Abstract
Bij de geboorte, de longen onderworpen aan een grondige fenotypische overgang van secretie absorptie, die zorgt voor aanpassing aan ademhaling zelfstandig. Het bevorderen en ondersteunen dit fenotype is van cruciaal belang in de normale alveolaire groei en gasuitwisseling gedurende het hele leven. Verscheidene in vitro studies hebben de rol van belangrijke regulerende eiwitten, signaalmoleculen en steroïde hormonen die de snelheid van longvocht klaring van invloed kunnen zijn gekarakteriseerd. Echter, in vivo onderzoek moet worden uitgevoerd om na te gaan of deze regulerende factoren spelen een belangrijke fysiologische rol in het reguleren van perinatale long vloeistof absorptie. Als zodanig is het gebruik van de real time röntgenbeeldvorming perinatale longvocht klaring of longoedeem bepalen vertegenwoordigt een technologische vooruitgang in het vakgebied. Hierin leggen we uit en illustreren een benadering van de snelheid van de alveolaire longvocht opruimen en alveolaire overstromingen in C57BL / 6 muizen beoordeeld op postnatale dag 10 onsing X-ray imaging en analyse. Succesvolle implementatie van dit protocol vereist voorafgaande toestemming van de institutionele dierlijke zorg en het gebruik commissies (IACUC), een in vivo kleine dieren X-ray imaging-systeem, en compatibele moleculaire imaging software.
Introduction
Bij de geboorte, moet de pasgeborene long overgang van een vloeistof afscheidende een vloeistof reabsorbing orgaan om voldoende ventilatie en zuurstofvoorziening van het lichaam vast te stellen. De mechanismen die vergemakkelijken (of belemmert) effectieve klaring van longvocht bij de geboorte onduidelijk. Modelleren van de snelheid van alveolaire vloeistof klaring bij C57BL / 6 muis pasgeboren pups zal leiden tot een beter begrip van regulerende factoren die kunnen versterken of verzwakken de snelheid van vochtopname. Het kan ook worden toegepast op andere neonatale modellen van acute longbeschadiging of infectie, en kan leiden tot nieuwe therapeutische strategieën voor pasgeboren baby's met ademhalingsproblemen.
Omdat pasgeboren longen zijn minuscuul in vergelijking met volwassen longen, kunnen conventionele maatregelen van de alveolaire vloeistof klaring die afhankelijk zijn van lavage of gravimetrische metingen niet geschikt om nauwkeurig te bestuderen klaring longvocht in neonatale long modellen. In dit protocol tonen we een test die het mogelijk maakt voorde nauwkeurige bepaling van de alveolaire vloeistof klaring prijzen voor postnatale dag 10 C57BL / 6 muis pups met behulp van een klein dier imager. Een groot voordeel van het gebruik van fluoroscopische benadering is dat de dieren worden afgebeeld in vivo. Ze zijn vrij ademen en kunnen herstellen van deze minimaal invasieve test voor toekomstige observatie en onderzoek. Het algemene doel van deze methode is om longoedeem model in de pasgeborene longen, en de snelheid van de alveolaire vloeistof klaring bij neonatale long te evalueren. Deze techniek werd ontwikkeld, gedeeltelijk in mindering strategie om het aantal benodigde dieren afnemen, maar experimenteel maximaal is. Deze techniek maakt het ook mogelijk voor een superieure detectie van longvocht volumes met behulp van X-ray imaging en vereist vaardigheid in elementaire dier terughoudendheid en de bediening daarvan 1; klein dier operaties en tracheale instillatie 2, een klein dier imager, en elementaire beeldanalyse software. Onderzoekers die willen longvocht volumes in vivo te evalueren (vrij breathing verdoofd diermodellen) kan deze procedure geschikt is voor hun toepassing vinden. Ten slotte kan dit protocol andere bestaande modellen van neonatale longschade gebruikt in de mechanistische studie van bronchopulmonaire dysplasie, met inbegrip van hyperoxia geïnduceerde longbeschadiging, mechanische ventilatie, en modellen van longontsteking 3 te vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele technieken moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele zorg en gebruik Comite richtlijnen.
1. X-ray Imaging Acquisition
- Software Overzicht (zie figuur 1 voor een overzicht van Software-instellingen).
- Selecteert u de knop Capture direct onder het tabblad Bestand.
- In de Instellingen drop-down menu, selecteert u Huidige sessie.
- Selecteer Standard Blootstelling in drop-down box onder belichtingstijd.
- Stel de belichtingstijd tot 2,00 min, en No. Blootstelling aan 1. Stel de X en Y Binning Binning tot 2 pixels. Zie figuur 1.
- Selecteer Final Ophoping van de Export Options drop-down menu.
- In de Verlichting instellingen, Select X-Ray van de Verlichting Bron drop-down menu. De standaard KVP is vastgesteld op 35.
- Selecteer Autoselect in het drop-down menu Solliciteren Referentie Bestand om de overeenkomstige X-ray referentiebestand van toepassing. (Zie hoofdstuk 2).
- In de Set camera de instellingen, stelt u de f-stop naar 2,51.
- Stel de FOV (Field of View) tot 125,64 voor PN10 muizen.
- Stel de Focal Plane tot en met 13, en in het drop-down menu naast de Focal Plane slider, selecteer X-Ray.
- Voor de X-stralen, stelt de excitatie Filter en de Emission Filter op 0 in het drop-down menu.
- Bewaar huidige sessie door te klikken op Nieuw op de top naast de instellingen. Voer de naam voor New Instellingen ophalen bestand, bijvoorbeeld "Jupiter Single Exposure Event voor het maken van een protocol." Zie afbeelding 2.
- Het creëren van een X-ray Imaging Protocol
- Klik op het maken / bewerken protocollen knop aan de rechterkant van het open raam.
- Als pop-up venster nieuwe protocol verschijnt, klikt u op de knop Nieuw in de rechter bovenhoek
- Voer de naam dat het protocol onder zal opslaan, bijvoorbeeld "Jove Demo Protocol", en klik op OK. (Zie Figuur 3).
- Op de bodem van de pop-up venster Protocol in Protocol Steps, ervoor te zorgen dat Stap 1 is gemarkeerd in rode tekst, Capture New Images is geselecteerd, en niets doen is geselecteerd in de Voordat Fotolader drop-down menu.
- In Capture instellen, selecteert u de onlangs gegenereerd eenmalige blootstelling gebeurtenis uit stap 1.1.12.
- Selecteer Wait (sec) uit het drop-down menu Na Fotolader.
- Klik op de knop Bewerken, type 180 in de pop-up box, en klik op OK om een 3 minuten wachttijd na elke 2 min overname toe te voegen.
- Dupliceren Stap 1 door met de rechtermuisknop te klikken op de tab Stap 1 en het selecteren van Duplicate Step. Maak 23 duplicaten voor een 2 uur observatieperiode. (Zie Figuur 4).
- Op de laatste stap (stap 24), wijzigt de After Fotolader instellen om niets te doen uit Wait (sec).
- Klik op de knop Opslaan en sluiten van het Protocol Editor.
2. Verlichting Reference Files
Opmerking: Breng X-ray verlichting referentiebestanden beeld een X-ray om automatisch corrigeren voor variaties in de uniformiteit van de detector röntgenbeelden verkregen hele experiment. De hierna beschreven procedures zijn specifiek voor de Bruker In vivo dierlijke Imaging Systems; andere in vivo beeldvormende systemen kanworden gebruikt.
- Genereer een verlichting referentiebestand door het openen van de moleculaire imaging software en te klikken op de knop Vastleggen.
- Met behulp van de pop-up menu, stellen de X-ray opname-instellingen in de lichtbron (zie aanbevolen instellingen in paragraaf 1 hierboven) en selecteer Verlichting Reference in het type belichting. Deze is te vinden onder de Standard Uitzettingen keuzelijst. (Zie figuur 5).
- Verwijder alle monsters uit de afbeelding station. De X- en Y binning tot 4 x 4 binning. Zie tabel 1: blootstelling Illumination referentiebestand keer om de juiste belichting te bepalen.
- Druk Expose.
- Breng het referentiebestand door het selecteren van Auto Select in het drop down menu onder Solliciteren Referentie Bestand. (Zie Figuur 6). De verlichting referentiebestand wordt nu automatisch worden toegepast op alle X-ray imleeftijden gevangen met dezelfde camera-instellingen. Stappen 2,1-2,4 hoeft niet te worden herhaald als dezelfde camera-instellingen worden gebruikt in volgende experimenten.
Opmerking: Een verlichting referentiebestand kan worden toegepast na het verwerven, of als er een foutmelding treedt op na auto-selectie van referentiebestanden. Solliciteer verlichting referentiebestanden post-beeld vast te leggen met behulp van de volgende reeks commando's in het navigatiepaneel van de moleculaire imaging software: Afbeelding> Afbeelding Math> Type: Taak> Bereken: Verlichting correctie. Selecteer het ingevoerde beeld (X) die je zou willen om de verlichting referentiebestand (Y) van toepassing zijn. Hernoem het gecorrigeerde bestand (Z). (Zie Figuur 7).
3. Animal Handling
- Het verwerven van Dieren
- Schaf zwanger dammen van commerciële kwekers of kweken vrouwelijke muizen in huis bij 12 weken oud (of ouder) in overeenstemming met de institutionele richtlijnens.
- Huis pasgeboren muizen met zogende moeders tot postnatale dag (PN) 10.
- Animal Anesthesie (PN 10)
- Bereid een ketamine / xylazine cocktail te verdoven PN 10 muizen gedurende langere verdovende effecten duren tot 40 min. Voeg 500 ul van ketamine (100 mg / ml) aan 75 pl xylazine (100 mg / ml). Verdun 1:10 in 0,9% zoutoplossing tot een ketamine (100 mg / kg) / xylazine (10 mg / kg) verdovingsmiddel cocktail.
- Weeg de pasgeboren muizen.
- Gebruik een 3/10 spuit met een 31 G 5/16 inch (8 mm) naald, toedienen 10 ul / g lichaamsgewicht van anesthesie met een intraperitoneale injectie.
- Houd dieren droog en geïsoleerd om overmatig verlies van lichaamswarmte te voorkomen.
4. Tracheal instillaties
- Bereid een intratracheaal zoutoplossing bestaande uit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2 en 10 mM HEPES; pH = 7,4. De osmolaliteit van de oplossing dient319 mOsmol / kg H2O
- Mount verdoofde dieren ventrale kant naar boven op een hellend chirurgische bord met behulp van chirurgische tape. Ensurethat koppen van de dieren aan de top van de helling.
- Voer een teen knijpen om ervoor te zorgen dat de dieren verdoofd en klaar voor de operatie. Desinfecteren chirurgische plaatsen, middelen en thoracale dier.
- Maak een kleine (3 mm) incisie in de anterior-mediale ventrale aspect van de hals (keel regio) met behulp van een chirurgische scalpel, maat 11. Push vernietiging van het platysma en de voorste tracheale spieren met behulp van stompe tang om te visualiseren en toegang tot de luchtpijp.
- Inboezemen 3 gl / g gewicht (ongeveer 10 - 30 pi uiteindelijk volume) van een zoutoplossing via de blootgestelde luchtpijp met behulp van een 31 G 5/16 inch (8 mm) naald. De kleine incisie wordt opengelaten tijdens het dier beeldvorming en meestal geneest zichzelf ook. Overleg met lokale Afdeling Animal Resource te bepalen of de insnijding eveneens kan worden opengelaten. Anders kan hechtingenvereist.
5. Animal Imaging
- Plaats de pups ventraal op een duidelijke bodem, verwijderbare, dier imaging lade. Worden de dieren zodat de róntgenbundel direct via borstkas wordt.
- Voor oneven dier cohorten, plaatst de eerste pup direct in het midden van de lade, en even genummerde cohorten plaats de eerste pup net links van het midden, zodat wanneer andere dieren in de lade alle dieren gecentreerd geplaatst.
- Zet de beeldvorming lade de röntgenbron beeldopnamekast en sluit de kastdeur.
- Schakel het dier thermische regeleenheid verdoofde dieren lichaamstemperatuur te handhaven. Gebruik de hoge instelling om een kamer temperatuur van ongeveer 35 te bereiken - 37 ° C. Schakel dier anesthesie-eenheid (verdampte isofluraan geleverd via zuurstof) om ervoor te zorgen dieren worden verdoofd en geïmmobiliseerd gedurende de duur van 2 uur imaging procedure.
- Het uitvoeren van X-ray imaging protocol
- Klik op Capture en selecteer het juiste protocol, bijvoorbeeld, "Jupiter Demo Protocol," uit het drop-down menu Protocol. (Zie figuur 8).
- Klik op Uitvoeren Geselecteerd Protocol knop op de moleculaire imaging software.
Opmerking: Een pop-up venster zal verschijnen om de status van het beeld overname volgen, wanneer het protocol is voltooid zal het venster verdwijnen. De röntgendosis laag, <dan 0,3 mRem of ongeveer 10 keer minder dan een radiografische. Zoals bij andere röntgenfoto er geen reststraling. - Wanneer de 2 uur overname sessie is voltooid, verwijdert u de dieren uit de imaging-lade en breng ze terug naar hun kooi. Monitor dieren voor volledig herstel alvorens terug te keren om te rekken.
6. Data Analysis
Opmerking: Moleculaire beeldvorming software maakt voor kwantificering en de vertaling van Xray pixel intensiteit in tarief van longvocht klaring. De onderstaande stappen beschrijven de procedures die nodig zijn om te normaliseren X-ray beelden en te kwantificeren intensiteiten in bepaalde regio's van belang (ROI).
- Ontwerp een ROI template
Opmerking: Een gebied van belang template moet specifiek de vastgelegde röntgenbeelden worden gemaakt tijdens de 2 uur studie, en worden gebruikt om röntgenstralen intensiteiten vergelijking tussen experimentele groepen. Aangezien kleine hoeveelheden zoutoplossing uitdagingen ophopen in de linker kwab van de long 4-6, moet de ROI (s) zich op dit deel van de long.- Open het eerste en het laatste beeld x-ray in de 2 uur set. Selecteer het venster afbeelding de eerste x-ray.
- In de werkbalk Navigatie, selecteert u Handmatig-ROI> New ROI Set.
- Klik ROI Ellipse en een ROI voldoende zijn voor de muis naar links lung.An ROI is niet gedefinieerd tot de rode, geschetst ROI is Dr.agged naar een andere positie. Een gedefinieerde ROI zal worden geschetst in blauw met een nummer.
- Als er meerdere pups worden afgebeeld, klikt u op de rode, geschetst ROI en sleep naar links longen van de andere muizen om meer individuele ROI's in dezelfde set te creëren. Sleep de rode, schetste ROI naar een gebied met een duidelijke achtergrond om een achtergrond ROI te creëren.
- Selecteer Pointer Selectie aan de ROI positie boven linkerlong elke muis te liggen, direct onder de tweede rib.
- In de bovenste werkbalk op het LCD-scherm.
- Controleer Overlay in het dialoogvenster het LCD-scherm om het beeld van de laatste x-ray overlay met behoud van de set ROI locaties. Selecteer zo nodig Pointer Selectie op de werkbalk Navigatie om de posities van de ROI te passen en te zorgen voor voldoende long dekking in beide beelden.
- In de Manual dialoogvenster ROI, selecteert u Template> Opslaan in Template. naam thij sjabloon en klik op OK.
- Sluit beide beelden. Selecteer Nee wanneer u wordt gevraagd wijzigingen op te slaan.
- Breng de ROI template elk beeld X-ray gevangen om vloeistof klaring analyseren door het openen van alle foto's genomen tijdens de studie. Begin met een open bestand te selecteren en klik op Manual ROI> Template.
- Selecteer de eerder gemaakte ROI sjabloon uit de drop-down menu en klik op Toepassen om alle geopende documenten.
- Export Numerieke ROI Gegevens uit de beelden naar een spreadsheet
- In de linker bovenhoek, klikt u op Bestand> Exporteren Data> ROI.
- Controleer zoals afgebeeld en Auto Open in Excel in het pop-up venster.
- Selecteer Exporteren alle geopende documenten.
- Noem het bestand en klik op Opslaan.
- Sluiten moleculaire imaging software.
- Institute of Laboratory Animal Resources. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8, The National Academies Press. (2011).
- Helms, M. N., Torres-Gonzalez, E., Goodson, P., Rojas, M. Direct tracheal instillation of solutes into mouse lung. J Vis Exp. , (2010).
- Hilgendorff, A., Reiss, I., Ehrhardt, H., Eickelberg, O., Alvira, C. M. Chronic lung disease in the preterm infant. Lessons learned from animal models. Am J Respir Cell Mol Biol. 50, 233-245 (2014).
- Goodson, P., et al. Nadph oxidase regulates alveolar epithelial sodium channel activity and lung fluid balance in vivo via O2- signaling. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302, L410-L419 (2012).
- McNeilly, T. N., Tennant, P., Lujan, L., Perez, M., Harkiss, G. D. Differential infection efficiencies of peripheral lung and tracheal tissues in sheep infected with Visna/maedi virus via the respiratory tract. J Gen Virol. 88, 670-679 (2007).
- Starcher, B., Williams, I. A method for intratracheal instillation of endotoxin into the lungs of mice. Lab Anim. 23, 234-240 (1989).
- Downs, C. A., Kumar, A., Kreiner, L. H., Johnson, N. M., Helms, M. N. H2O2 regulates lung ENaC via ubiquitin-like protein Nedd8. J Biol Chem. 288, 8136-8145 (2013).
- Gammon, S. T., et al. Preclinical anatomical, molecular, and functional imaging of the lung with multiple modalities. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306, L897-L914 (2014).
- Takemura, Y., et al. Cholinergic regulation of epithelial sodium channels in rat alveolar type 2 epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L428-L437 (2013).
- Lewis, R. A., et al. Dynamic imaging of the lungs using x-ray phase contrast. Phys Med Biol. 50, 5031-5040 (2005).
- Nyren, S., Radell, P., Mure, M., Petersson, J., Jacobsson, H., Lindahl, S. G., Sanchez-Crespo, A. Inhalation anesthesia increases V/Q heterogeneity during spontaneous breathing in healthy subjects. Anesthesiology. 113 (6), 1370-1375 (2010).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De linker panelen in figuren 9-10 zijn van PN 10 muizenlongen afgebeeld bij aanvang (pre-ingedruppeld). Deze beelden tonen succesvolle instillatie van zoutoplossing uitdagingen in de linker kwab van de neonatale longen. In figuur 9, werd de muis long tracheaal ingeprent met de zoutoplossing hierboven beschreven (zie paragraaf 2.1). De middelste en rechter panelen van figuur 9 zijn röntgenbeelden van dezelfde muis verkregen 5 min en 2 uur na instillatie; dit dier was met succes het zoute uitdaging gewist. Met name de röntgenintensiteit van deze dieren ROI steeg van 187,67 tot 515. Aldus is er een omgekeerde correlatie tussen pixeldichtheid en longen vloeistofvolume; dat wil zeggen, hoe groter de relatieve waarde, hoe minder vloeistof er in de longen. Het kan nuttig zijn om te begrijpen dat er meer X-ray energie wordt geabsorbeerd (en dus een grotere gerapporteerde waarde) wanneer er minder vloeistof attenuating van de X-ray. In figuur 10 werd de PN 10 muizenlong tracheaal gedruppeld met een verbinding die geoxideerd glutathion (opgelost in zoutoplossing in 2,1 beschreven) dat alveolaire vloeistof klaring van de zoutoplossing uitdaging geremd door het blokkeren van epitheliale natriumkanaal activiteit; de numerieke waarde van de ROI van dit dier zal dalen van de pre-inboezemen en achteraf ingeprent X-ray afgebeeld files, indicatief voor het verhogen van X-ray dekking. Specifiek, de netto-intensiteit van het dier ongeveer 5 min na instillatie was - 64, en verminderde tot - 182. Nogmaals, merk de omgekeerde relatie tussen de ROI pixelintensiteit en hoeveelheid vocht in de longen; toegenomen vloeistof in de linker kwab van de long verzwakt X-ray absorptie.
Het evalueren van de netto-intensiteit van de ROI maakt kwantitatieve evaluatie van de veranderingen in de snelheid van longvocht speling, zij acquisitie software maakt het ook mogelijk de onderzoekers uit te drukkengegevens in termen van g / cm3 indien gewenst. Bovendien kunnen de onderzoekers elk dier gebruiken als zijn eigen controle en normaliseren alle X-ray intensiteiten op een eerste tijdstip (Io) zoals t = 5 min en rapporteren netto veranderingen in de X-ray ondoorzichtigheid (dat wil zeggen, een maat voor de verandering in longvocht volumes).
Figuur 1. Belichtingsinstellingen. Dit screenshot toont de juiste belichting gebruikt in dit protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Instellingen File. Dit screenshot toont een belangrijke stap in het genereren van een bestand instelling die zal worden gebruiktin een protocol. Een pop-up venster (zoals afgebeeld) zal een nieuwe naam voor het bestand overname instellingen aan te vragen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Imaging Protocol. Deze schermafbeelding laat een belangrijke stap bij het bepalen of een nieuw beeldprotocol succesvol is gemaakt. Een pop-up venster (zoals afgebeeld) zal verschijnen en een nieuwe naam protocol zal worden aangevraagd voor de gegenereerde protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Protocol Trappen. Dit screenshot toont een snelkoppeling naar een bestand overname instellingen dupliceren, plaatst u een nieuwe stap, of om een stap binnen een imaging protocol te verwijderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Illumination Reference. Dit screenshot toont de verlichting verwijzing commando en de juiste instellingen in het dier imaging software die geschikt is voor het maken van een verlichting referentiebestand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Auto Select Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Verlichting Correction. Deze screenshot toont de juiste toepassing van een verlichting referentiebestand gegenereerd nadat dier beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8. Uitvoeren Protocol. Dit screenshotziet u hoe u een geselecteerd protocol uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9. X-ray beelden van ontruimde longen representatief beeld van PN 10 longen voorafgaand aan het ontvangen van een zoutoplossing uitdaging. (Pre-inboezemen; linker paneel); 5 min na het inbrengen (middelste paneel), en 2 uur na het zoute uitdaging van de overigens gezonde long (rechter paneel) had gewist. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10. X-ray Beelden van Overstroomde Longen. Vertegenwoordiwoordiger beeld van PN 10 longen voorafgaand aan het ontvangen van een zoutoplossing challenge (pre-inboezemen; linkerpaneel) met glutathion disulfide, die paracellulaire stoftransport remt; 5 min na het inbrengen van glutathion disulfide (middelste paneel), en 2 uur na het remmen paracellulaire vervoer dat leidt tot alveolaire overstromingen (rechter paneel). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.Geen filter = belichting 10 sec 0.1mm = belichting 15 sec 0.2mm = belichting 20 sec 0.4mm = belichting 30 sec 0.8mm = belichting 30 sec De grootte van de röntgenbron filter correleert met een bepaalde belichtingstijd voor crhet eten van een verlichting referentiebestand. Tabel 1. Verlichting Referentie Bestand. Dit bestand meldt de juiste belichting tijden voor het genereren van verlichting verwijzing bestanden op basis van X-ray filters gebruikt in imaging studies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van X-ray imaging, kunnen duidelijke beelden van de neonatale longen worden geanalyseerd op longvocht volumes. We 7,3,11 en 10 anderen, met succes gebruikt X-ray imaging dynamische veranderingen in de longen fluïdumvolume in vrije ademhaling verdoofd diermodellen bepalen en deze techniek is veelbelovend voor de studie van neonatale longbeschadiging bevorderen. Een groot voordeel bij het gebruik van onze benadering longvocht volume beoordelen (in tegenstelling tot x-straal phase constrast 10 bijvoorbeeld) dat tot vijf PN10 muis pups gelijktijdig kunnen worden onderzocht met behulp van een beeldvormingssysteem dat gemeenschappelijke plaats in onderzoeksfaciliteiten en kernen .
Bijbrengen een geschikt longvocht volume, om niet te verdrinken of instorten de longen, is van cruciaal belang voor de succesvolle uitvoering van dit protocol en kan nodig zijn om experimenteel worden onderzocht voordat X-ray imaging protocollen kunnen worden toegepast. De gevoeligheid van deze assay maakt de detectie van zeer kleine volumes van ingeprent zoutoplossing via X-ray detectie. We hebben kunnen verschillen in de röntgenbron opaciteit van neonatale longen ingedruppeld met 10 pl volumes zoutoplossing te onderscheiden geweest. Het verschil in röntgenonderzoek opacities nog uitgesprokener bij natriumkanaal remmers worden in de alveolaire luchtruimte omdat de zoutoplossing problemen niet kunnen worden geabsorbeerd en de longen blijven vloeistof afscheiden in het luchtruim. Indien een onredelijk hoog volume zoutoplossing ingebracht, plaatsen dieren in de beeldvorming kamer met zuurstof in de kamer stroomt via de anesthesie poorten ademhaling in overstroomd longen te vergemakkelijken.
Onze resultaten met X-ray imaging vergelijkbaar zijn alveolaire vloeistof speling gemeten met meer conventionele methoden, zoals long- nat-op-droog gewichtsverhoudingen en Evan's Blue voor de bepaling van proteïneconcentratie 4. We hebben nu laten zien dat deze benadering kan worden toegepast op de neonatale muis pup. Deze X-ray imaging techniek voor het bepalen longvocht volumes kan eenvoudig worden gecombineerd met aanvullende beeldvormende modaliteiten. Zo kunnen fluorescerende merkers of bioluminescente probes gelijktijdig instillatie in de alveoli en beoordeeld. (Detectie van fluorescerende en luminescente probes is beschreven 8, en valt buiten het bestek van dit rapport). De functie voor gelijktijdige registratie van de hoeveelheid longvocht (met X-ray imaging), naast de mogelijkheid om fluorescerende merkers opgespoord is een van de voordelen van deze dynamische test en het commerciële systeem voor het meten longvocht speling. Andere voordelen van het gebruik van deze benadering voor de bepaling van klaring en relatieve longvocht volume omvat de mogelijkheid om longitudinale studies (dus het aantal dieren nodig om statistisch significante waarnemingen bereiken afneemt) en het vermogen om kleine veranderingen in de longen fluïdumvolume in vrije ademhaling detecteren , verdoofd, neonatale muis pups. Een beperking van het gebruik van eenin vivo imaging benadering is echter dat de verdoving distributie van gas en de bloedstroom in de longen kan veranderen. Mismatches in ventilatie en perfusie (V / Q) en rangeren bleken toe te nemen onder anesthesie bij gezonde volwassen vrijwilligers 12, waardoor zuurstofvoorziening van het lichaam verminderen. Dit nadelige effect kan echter worden gecompenseerd door het verhogen van de ingeademde zuurstofconcentratie. Vanuit een technisch oogpunt, kan variabiliteit tussen de beeldvormende systemen in X-ray flux energie-optimalisatie van elk systeem voor het uitvoeren van imaging studies. Bijvoorbeeld, een systeem met een röntgenbron met meer flux en / of een detector met superieure kwantumrendement, een hoger f / stop en onderste binning state dacht beeldkwaliteit bij de beoordeling van kleine veranderingen in X-ray impedantie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit artikel is onderdeel van een themanummer over Multimodal Preklinische Imaging, gesponsord door Bruker BioSpin.
Materials
Name Company Catalog Number Comments Preclinical Imaging System (In- Vivo MS FX PRO) Bruker; Billerica, MA Ketamine Ketaset; Fort Dodge Animal Health, IA 26637-411-01 Xylazine Lloyd Laboratories; Shenandoah, IA 4821 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (with Calcium and Magnesium) Lonza; Walkersville, MD 17-513F Sodium chloride Amresco; Solon, OH 241 Potassuim chloride Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ P217-3 Calcium chloride Sigma-Aldrich; St. Loius, MO C5080 HEPES Sigma-Aldrich; St. Loius, MO H3375 0.3 ml insulin syringe with 31 G x 5/16" (8 mm) needle BD Insulin Syringe; Franklin Lakes, NJ 328438 References
Tags
Geneeskunde neonatale long-,
