Real-time X-ray Imaging av Lung Fluid Volumene i Neonatal Mouse Lung

Abstract

Ved fødselen, gjennomgår lunge en dyp fenotypisk overgang fra sekresjon til absorpsjon, noe som gjør det mulig for tilpasning til å puste på egen hånd. Fremme og opprettholde denne fenotype er kritisk viktig i normal kjeve vekst og gassutveksling gjennom hele livet. Flere in vitro studier har preget rollen som viktige regulatoriske proteiner, signalmolekyler, og steroidhormoner som kan påvirke frekvensen av lunge væske klaring. Men in vivo undersøkelser må gjennomføres for å vurdere om disse regulatoriske forhold spiller viktige fysiologiske roller i regulering perinatal lunge væske absorpsjon. Som sådan, til utnyttelse av sanntidsrøntgen bestemme perinatal lunge væske klaring, eller lungeødem, representerer et teknisk fremskritt på området. Heri forklarer vi og illustrerer en tilnærming for å vurdere graden av alveolar lunge væske klaring og alveolar flom i C57BL / 6 mus ved postnatal dag 10 ossing X-ray bildebehandling og analyse. Vellykket gjennomføring av denne protokollen krever forhåndsgodkjenning fra institusjonelle dyr omsorg og bruk komiteer (IACUC), et in vivo små dyr X-ray imaging system, og kompatibel molekylær bildebehandling.

Introduction

Ved fødselen, må det nyfødte lunge overgangen fra et fluid sekresjon til en fluid reabsorbing organ for å etablere tilstrekkelig ventilasjon og oksygentilførsel av kroppen. Mekanismene som letter (eller hindrer) effektivt clearance av lunge væske på tidspunktet for fødselen fortsatt uklare. Modellering av frekvensen av alveolære væske klaring i C57BL / 6 mus nyfødte unger vil føre til en bedre forståelse av regulatoriske faktorer som kan forsterke eller svekke graden av fluid absorpsjon. Det kan også anvendes på andre neonatale modeller av akutt lungeskade eller infeksjon, og kan lede til nye terapeutiske strategier for nyfødte barn med respiratorisk distress.

Siden nyfødte lungene er forsvinnende liten sammenlignet med voksne lungene, kan konvensjonelle tiltak av alveolar væske klaring som er avhengige av kylling eller gravimetrical målinger ikke være egnet til å nøyaktig studere lunge væske klaring i neonatale lunge-modeller. I denne protokollen, viser vi en metode som tillaternøyaktig bestemmelse av alveolære væske clearance i postnatal dag 10 C57BL / 6 mus valper med en liten dyr imager. En stor fordel med å bruke en fluoroskopisk tilnærming er at dyrene blir avbildet in vivo. De er fritt puste og kan gjenopprette fra denne minimal invasiv analysen for fremtidig observasjon og studier. Det overordnede målet med denne metoden er å modellere lungeødem hos den nyfødte lunge, og vurdere frekvensen av alveolar væske klaring i neonatal lunge. Denne teknikken ble utviklet, delvis, som en reduksjon strategi for å redusere det antall dyr som trengs, men maksimere eksperimentell utgang. Denne teknikken gir også mulighet for overlegen påvisning av lungevæskevolumer bruker røntgen og krever kompetanse i grunnleggende dyr beherskelse og håndtering ^1; små dyr operasjoner og tracheal drypping ^2, et lite dyr imager, og grunnleggende bildeanalyse programvare. Etterforskerne som ønsker å vurdere lungevæskevolumer in vivo (fritt breathing bedøvet dyremodeller) kan finne denne prosedyren egnet for deres søknad. Til slutt, kan denne protokollen forsterke andre eksisterende modeller av neonatal lungeskade brukt i mekanistisk studie av bronkopulmonal dysplasi, inkludert hyperoksi-indusert lungeskade, mekanisk ventilasjon, og modeller av lungebetennelse ^tre.

Protocol

Alle eksperimentelle teknikker skal utføres i samsvar med institusjon og bruk komité retningslinjer.

1. X-ray Imaging Acquisition

1. Programvareoversikt (Se figur 1 for en oversikt over programvareinnstilling).
   1. Velg opptaksknappen rett under kategorien Fil.
   2. I innstillingsrullegardinmenyen velger du gjeldende økt.
   3. Velg Standard Eksponering i rullegardinlisten under Exposure Time.
   4. Sett Exposure Time til 2,00 min, og nr Eksponeringer til ett. Sett X Binning og Y Binning til 2 piksler. Se figur 1.
   5. Velg Endelig Oppsamling fra eksport av rullegardinmenyen.
   6. I Illumination innstillinger, Select røntgen fra Illumination Kilde rullegardinmenyen. Standard KVP settes til 35.
   7. Velg Autoselect i rullegardinmenyen Søk Referanse fil for å bruke den tilsvarende X-ray referansefilen. (Se avsnitt 2).
   8. I Set Kamera til innstillinger, sett f-stop til 2,51.
   9. Sett FOV (Field of View) til 125,64 for PN10 mus.
   10. Sett Focal Plane til 13, og i rullegardinmenyen ved siden av Focal Plane glidebryteren, velg X-Ray.
   11. For røntgen, setter eksitasjonsfilteret og Emission Filter til 0 i rullegardinmenyen.
   12. Lagre gjeldende økten ved å klikke Ny på topp ved siden av Innstillinger. Skriv inn navn for New Acquire Innstillingsfil, for eksempel "Jove Enkel eksponering hendelse for å lage en protokoll." Se figur 2.
   13. Opprette en X-ray Imaging Protocol
       1. Klikk på Create / Edit Protokoller knappen på høyre side av det åpne vinduet.
       2. Som ny protokoll pop-up vindu vises, klikker du på Ny-knappen i øvre høyre hjørne
       3. Skriv inn navnet at protokollen vil spare for eksempel under "Jove Demo Protocol", og klikk OK. (Se figur 3).
       4. På bunnen av protokollen pop-up vindu i protokoll Trappen sikre at trinn 1 er markert med rød tekst, Capture Nye bilder er valgt, og ikke gjøre noe er valgt i Før Image Capture nedtrekksmenyen.
       5. I opptaksinnstilling, velger du den nylig genererte enkel utsettelse hendelse fra trinn 1.1.12.
       6. Velg Vent (sek) fra Etter Image Capture rullegardinmenyen.
       7. Klikk på Rediger-knappen, type 180 inn i pop-up-boksen, og klikk OK for å legge til en 3 min ventetid etter hvert 2 min oppkjøpet.
       8. Duplicate trinn 1 ved å høyreklikke på fanen Trinn 1 og velge Duplicate trinn. Lag 23 duplikater for en to timers observasjonsperioden. (Se figur 4).
       9. På det siste trinnet (trinn 24), endrer Etter Image Capture innstilling å gjøre noe fra Wait (sek).
       10. Klikk på Lagre og avslutte Protocol Editor.

   2. Belysning Reference filer

   Merk: Bruk X-ray belysning referansefiler til en X-ray bilde for å automatisk korrigere for variasjoner i detektoren ensartethet av røntgenbilder som oppnås gjennom forsøket. Prosedyrene er beskrevet nedenfor er spesifikke for Bruker in vivo dyre Imaging Systems; andre in vivo imaging-systemer kanbli brukt.

   1. Generere en belysning referansefilen ved å åpne den molekylære bildebehandlingsprogrammer og klikke på opptaksknappen.
   2. Bruke hurtigmenyen, etablere røntgenopptaksinnstillinger i Illumination kilde (se foreslåtte innstillingene i kapittel 1 ovenfor), og velg deretter Belysning Reference i eksponeringstypen. Dette finner du under Standard eksponeringer drop down box. (Se figur 5).
   3. Fjern alle prøvene fra bildet stasjonen. Sett X og Y binning til 4 x 4 binning. Se Tabell 1: Illumination referansefilen eksponeringstider for å bestemme nøyaktig eksponeringstiden.
   4. Trykk Expose.
   5. Påfør referansefilen ved å velge Automatisk valg på rullegardinmenyen under Søk Referanse File. (Se figur 6). Belysningen referansefilen vil nå bli automatisk brukes på alle X-ray imaldre tatt med samme kamerainnstillinger. Steps 02.01 til 02.04 vil ikke må gjentas hvis samme kamerainnstillingene benyttes i etterfølgende eksperimenter.
      Merk: En belysning referansefilen kan brukes etter bildeopptak, eller hvis du får en feilmelding etter automatisk valg av referansefiler. Påfør belysning referansefiler post-bildeopptak ved hjelp av følgende serie med kommandoer i navigasjonspanelet av den molekylære bildebehandlingsprogrammer: Bilde> Bilde Math> Type: Oppgave> Beregn: Belysning korreksjon. Velg inngangsbildet (X) som du ønsker å bruke belysning referansefilen (Y) til. Gi nytt navn til den korrigerte filen (Z). (Se figur 7).

   3. Animal Handling

   1. Anskaffelse av Dyr
      1. Kjøp gravide demninger fra kommersielle oppdrettere eller avle hunnmus i huset ved 12 ukers alder (eller eldre) i henhold til institusjonelle retningslinjers.
      2. Hus nyfødte mus med ammende mødre opp til postnatal dag (PN) 10.
   2. Animal Anestesi (PN 10)
      1. Forbered en Ketamin / xylazin cocktail å bedøve PN 10 mus i lengre bedøvende effekter som varer opp til 40 min. Legg 500 mL av ketamin (100 mg / ml) til 75 ul av xylazin (100 mg / ml). Fortynn 1:10 i en 0,9% saltoppløsning for å lage en ketamin (100 mg / kg) / xylazin (10 mg / kg) bedøvelse cocktail.
      2. Vei nyfødte mus.
      3. Ved hjelp av en 3/10 sprøyte med en 31 G 5/16 tomme (8 mm) p, administrere 10 ul / g kroppsvekt av anestesi med en intraperitoneal injeksjon.
      4. Holde dyr tørt og isolert for å hindre overdreven tap av kroppsvarme.

   4. Tracheal instillasjoner

   1. Fremstille en intratrakeal saltoppløsning bestående av 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM _CaCl2 og 10 mM HEPES; pH = 7,4. Osmolaliteten av denne oppløsningen bør være319 mosmol / kg H ₂ O.
   2. Mount bedøvet dyr ventral siden opp på en skrå kirurgisk bord med kirurgisk tape. Ensurethat dyrenes hoder er på toppen av stigningen.
   3. Utfør en tå klype for å sikre at dyr er bedøvet og klar for operasjon. Desinfisere alle kirurgiske områder, instrumenter, og thorax-regionen av dyret.
   4. Foreta en liten (3 mm) innsnitt i anterior-mediale aspektet av ventral halsen (hals region) ved anvendelse av en kirurgisk skalpell, størrelse 11. skyve til side den platysma og fremre luftrørsmuskler ved hjelp avstumpet tang for å visualisere og åpne luftrøret.
   5. Innpode 3 ul / g vekt (ca. 10 - 30 ul endelig volum) saltløsning via den eksponerte luftrøret ved hjelp av en 31 G 5/16 tomme (8 mm) nål. Den mindre innsnitt er igjen åpen om dyr bildebehandling og vanligvis helbreder seg godt. Ta kontakt med lokale Division of Animal Resource å finne ut om snittet kan likeledes stå åpen. Ellers sting kanvære nødvendig.

   5. Animal Imaging

   1. Plasser valpene ventralt på en klar bunn, avtakbar, dyr bildebehandling skuffen. Sentrere dyrene slik at røntgenstrålen vil være rett over brystområdet.
   2. For oddetallsdyre kohorter, plasserer den første valpen direkte i midten av skuffen, og for partalls kohorter sette den første valpen bare til venstre for sentrum, slik at når de andre dyrene er plassert på brettet alle dyrene er sentrert.
   3. Returner bildebehandling skuffen til røntgenskap og lukke skapdøren.
   4. Slå på dyret termiske styreenhet for å opprettholde de bedøvede dyrene kroppstemperatur. Bruk høy innstilling for å oppnå et kammer temperatur på ca 35-37 ° C. Slå på dyr anestesi enhet (fordampede isofluran levert via oksygen) for å sikre at dyrene bedøvet og immobilisert i hele varighet på 2 timer avbildningsprosedyre.
   5. Utfører X-ray imaging protokollen
      1. Klikk på Capture og velger riktig protokoll, for eksempel "Jove Demo Protocol", fra rullegardinmenyen protokollen. (Se figur 8).
      2. Klikk på Execute Selected knappen protokollen om molekylær bildebehandling.
         Merk: En pop-up vindu vil vises for å spore status på bildet oppkjøpet, når protokollen er ferdig vinduet vil forsvinne. Røntgen dose er lav, <enn 0,3 mrem eller omtrent 10 ganger mindre enn en dental røntgen. Som med andre røntgenprosedyrer, er det ingen rester av stråling.
      3. Når to timers oppkjøpet økten er ferdig, fjerner dyrene fra fotoskuffen og returnere dem til sine bur. Overvåk dyr for full gjenoppretting før retur til racks.

   6. Data Analysis

   Merk: Molecular bildebehandling sørger for kvantifisering og oversettelsen av Xray piksel intensitet i frekvensen av lunge væske klaring. Trinnene nedenfor skisserer de prosedyrer som trengs for å normalisere røntgenbilder og kvantifisere intensiteter i definerte regioner av interesse (ROI).

   1. Design en ROI mal
      Merk: Det må opprettes en region av interesse mal spesifikke for de fangede røntgenbilder i løpet av 2 timer studien, og bør brukes for å sammenligne X-ray intensiteter blant eksperimentelle grupper. Da små volumer av saltvann utfordringer vanligvis akkumuleres i venstre øvre flik av lunge ^4-6, bør det ROI (e) fokuserer på denne del av lungen.
      1. Åpne den første og siste røntgenbilde i 2 timer settet. Velge vinduet i den første røntgenbilde.
      2. I navigasjonsverktøylinjen, velger du Manuell-Rois> Ny ROI Set.
      3. Klikk ROI Ellipse og skape en avkastning som i tilstrekkelig grad dekker musens venstre lung.An ROI er ikke definert til den røde, skissert ROI er dragged til en annen posisjon. En definert ROI vil bli markert i blått med et tall.
      4. Hvis flere valper er avbildet, klikk på den røde, skissert ROI og dra til venstre lungene av de andre musene å skape mer individuell Rois i samme sett. Dra den røde, skissert ROI til et område med en klar bakgrunn for å lage en bakgrunn avkastning.
         1. Velg Peker Selection å plassere Rois å ligge over hver musens venstre lunge, direkte under andre ribben.
      5. I den øverste verktøylinjen klikker bildeskjermen.
      6. Sjekk overlegg i dialogboksen bildeskjermen for å overlappe siste røntgenbilde og samtidig opprettholde de innstilte ROI steder. Om nødvendig, velge Peker Selection i navigasjonsverktøylinjen til å justere posisjonene til Rois og sikre tilstrekkelig lunge dekning i begge bildene.
      7. I Manuell dialogen ROI, velger du Mal> Lagre til mal. navn than mal og klikk på OK.
      8. Lukk begge bildene. Velg Nei når du blir bedt om å lagre endringene.
      9. Påfør ROI malen til hver X-ray bilde tatt for å analysere væske klaring ved å åpne alle bilder som er tatt i løpet av studien. Start med å velge en åpen fil og klikk Manuelle Rois> Mal.
      10. Velg den tidligere opprettede ROI mal fra rullegardinmenyen, og klikk på Bruk på alle åpne dokumenter.
   2. Eksporter Numerisk ROI data fra bilder til et regneark
      1. I øvre venstre hjørne, klikk på Fil> Eksporter data> ROI.
      2. Sjekk Som Viste og Auto Åpne i Excel i pop-up dialog.
      3. Velg Eksporter alle åpne dokumenter.
      4. Gi navn til filen og klikk på Lagre.
      5. Lukk molekylær bildebehandling.

Representative Results

Den venstre paneler i figur 9 - 10 er av PN 10 mus lungene avbildes ved baseline (pre-innpodet). Disse bildene viser vellykket drypping av saltvann utfordringer i venstre flik av neonatal lungene. I figur 9, ble muselunge trakealt innpodet med saltoppløsning definert ovenfor (se avsnitt 2.1). Den midterste og høyre panel av figur 9 er røntgenbilder fra samme mus fått 5 min og 2 timer etter instillasjon; dette dyret hadde tømt salt utfordring. Nærmere bestemt, røntgenstråleintensiteten i dette dyr ROI øket fra 187,67 til 515. Det er således en omvendt korrelasjon mellom pikseltetthet og lunge væskevolum; det vil si, jo større den relative verdi, desto mindre væske som finnes i lungene. Det kan være nyttig å forstå at mer X-ray energi absorberes (derav en større rapportert verdi) når det er mindre væske attenuating X-ray. I figur 10, ble den PN 10 mus lunge trakealt innpodet med en forbindelse inneholdende oksydert glutation (rekonstituert i saltløsning som er beskrevet i 2.1) som inhiberte alveolar fluid klaring av salt utfordringen ved å blokkere epitelial natriumkanal aktivitet; tallverdien av dette dyret avkastningen vil avta fra pre-innpode og post-innpodet røntgenfotograferte filer, en indikasjon på økt røntgentetthet. Nærmere bestemt netto intensiteten av dyret ca 5 min etter instillasjon var - 64, og avtok til - 182. Igjen er oppmerksom på det inverse forholdet mellom ROI pikselintensiteten og mengden av væske i lungene; økt væske i øvre venstre flik av lunge demper X-ray absorpsjon.

Vurderer netto intensiteten av ROI muliggjør kvantitativ evaluering av endringer i frekvensen av clearance lunge væske, riktignok oppkjøpet programvaren også tillater etterforskerne til å uttrykkedata i form av g / ^cm3 hvis ønskelig. Videre kan undersøkerne bruke hvert dyr som sin egen kontroll, og normalisere alle røntgen intensiteter til et første tidspunkt (IO), slik som t = 5 min og rapportere netto endring i røntgentetthet (dvs. en måling av endring i lunge væskevolum).

Figur 1. Eksponeringsinnstillinger. Dette skjermbildet viser de aktuelle eksponeringsinnstillinger som brukes i denne protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Innstillingsfil. Dette skjermbildet viser et viktig steg i å generere en fil innstilling som vil bli brukti en protokoll. En pop up vindu (som vist) vil be om et nytt navn på oppkjøpsinnstillingsfilen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Imaging Protocol. Dette skjermbildet viser et viktig steg i å avgjøre om en ny bilde protokollen er opprettet. En pop up vindu (som vist) vises, og en ny protokoll navn vil bli bedt for den genererte protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Protocol Trappen. Dette skjermbildet viser en snarvei til å duplisere en oppkjøps innstillingsfil, sette inn et nytt steg, eller for å slette et skritt i en bildeprotokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Belysning Reference. Dette skjermbildet viser belysningen referansen kommando og riktige innstillinger i dyrebildebehandlingsprogrammer hensiktsmessig for å skape en belysning referansefilen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6. Auto Select Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7. Belysning Correction. Dette skjermbildet viser den aktuelle anvendelsen av en belysning referansefilen generert etter dyr bildebehandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 8. Utfør protokollen. Dette skjermbildetillustrerer hvordan å utføre en valgt protokoll. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9. X-ray bilder av ryddet lungene representant bilde av PN 10 lungene før du mottar en salt utfordring. (Pre-innpode, venstre panel); 5 min etter drypping (midtre panelet), og to timer etter at saltvann utfordringen hadde fjernet fra ellers frisk lunge (høyre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 10. X-ray bilder av oversvømte Lunger. Representertav kvalitativ bilde av PN 10 lungene før du mottar en salt utfordring (pre-innpode, venstre panel) som inneholder glutation disulfide, som hemmer paracellulære oppløst stoff transport; 5 min etter drypping av glutation disulfide (midtre panelet), og to timer etter å hemme paracellulære transport som fører til alveolar flom (høyre panel). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ingen filter =	10 sek eksponering
0.1mm =	15 sek eksponering
0.2mm =	20 sek eksponering
0.4mm =	30 sek eksponering
0,8 mm =	30 sek eksponering
Størrelsen av røntgenfilter korrelerer med en bestemt eksponeringstid for crspise en belysning referansefilen.

Tabell 1. Belysning Reference fil. Denne filen rapporterer de aktuelle eksponeringstider for å generere belysning referansefiler basert på X-ray filtre som brukes i imaging studier.

Discussion

Ved hjelp av røntgenbilder, kan klare bilder av nyfødte lungene bli analysert for lungevæskevolumer. Vi ^7,3,11, og andre ^10, har med hell benyttet røntgen for å bestemme dynamiske endringer i væskevolum lunge i fritt puste bedøvede dyremodeller, og denne teknikken har store løftet for å fremme studiet av neonatal lungeskade. En stor fordel i å bruke vår tilnærming for å vurdere lungevæskevolum (i motsetning til røntgen fase constrast ¹⁰ for eksempel) er at opptil fem PN10 museunger kan samtidig studert ved hjelp av et bildesystem som er vanlig i forskningsfasiliteter og kjerner .

Instilling en passende væskevolum lunge, som å ikke drukne eller kollapse lungene, er avgjørende for en vellykket gjennomføring av denne protokollen og kan trenge å bli eksperimentelt utforsket før X-ray bildebehandlings protokoller kan brukes. Sensitiviteten til denne analysen muliggjør påvisning av meget små volumes av innpodet saltvann via X-ray inspeksjon. Vi har vært i stand til å skjelne forskjeller i røntgentetthet av neonatale lungene innpodet med 10 ul volumer av saltoppløsning. Forskjellen i X-ray uklarheter er enda mer uttalt når natriumkanal-inhibitorer er innført i den alveolære luftrom fordi saltvann utfordringene ikke kan absorberes og lungene fortsetter å utskille væske inn i luftrommet. I det tilfelle at en feilaktig høy volum av saltløsning er innført, å plassere dyrene i bilde kammer med oksygen som strømmer inn i kammeret via anestesi portene kan lette respirasjonen i oversvømte lungene.

Våre resultater ved hjelp av røntgenbilder er sammenlign alveolære væske klareringer målt ved bruk av mer konvensjonelle metoder, som for eksempel lunge våte til tørre vektforhold og Evans blå for bestemmelse av proteinkonsentrasjonen ^4. Vi viser nå at denne tilnærmingen kan brukes til neonatal mus valp. Dette X-ray imaldring teknikk for å bestemme lungevæskevolumene kan enkelt kombineres med ytterligere bildediagnostikk. For eksempel kan fluorescerende markører eller bioluminescent prober samtidig bli innpodet inn i alveolene og vurdert. (Påvisning av fluorescerende og selvlysende prober har blitt beskrevet ^åtte, og er utenfor rammen av denne rapporten). Evnen til å medvirke registrere volumet av lungevæske (ved hjelp av røntgenstråle-avbildning) ved siden av evnen til å detektere fluorescerende biomarkører er en av flere fordeler med å bruke denne dynamiske analyse, og det kommersielle system for måling av lungefluid klaring. Andre fordeler ved å benytte denne metode for å bestemme klaringen og relativ lungevæskevolum inkluderer evnen til å utføre langsgående studier (og dermed redusere antall dyr som trengs for å oppnå statistisk signifikante observasjoner), og evnen til å oppdage små endringer i væskevolum lunge i fritt å puste , bedøvet, neonatale mus valper. En begrensning ved anvendelse av enin vivo avbildning tilnærming, er imidlertid at den anestesi kan forandre fordelingen av gass og blodstrømmen i lungene. Uoverensstemmelser i ventilasjon og perfusjon (V / Q) og skifting har vist seg å øke under anestesi hos voksne friske frivillige ^12, og dermed redusere oksygenopptaket i kroppen. Denne negative effekten, men kan kompenseres for ved å øke den inspirerte oksygenkonsentrasjonen. Fra et teknisk synspunkt, kan variasjoner mellom bildesystemer i X-ray flux energi krever optimalisering av hvert system før gjennomføring imaging studier. For eksempel på et system med en X-ray kilde med mer forandring og / eller en detektor med overlegen kvante effektivitet, høyere f / stopp og lavere binning stat kan gi bedre bildekvalitet ved vurdering liten endring i X-ray impedans.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Preclinical Imaging System (In- Vivo MS FX PRO)	Bruker; Billerica, MA
Ketamine	Ketaset; Fort Dodge Animal Health, IA	26637-411-01
Xylazine	Lloyd Laboratories; Shenandoah, IA	4821
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (with Calcium and Magnesium)	Lonza; Walkersville, MD	17-513F
Sodium chloride	Amresco; Solon, OH	241
Potassuim chloride	Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ	P217-3
Calcium chloride	Sigma-Aldrich; St. Loius, MO	C5080
HEPES	Sigma-Aldrich; St. Loius, MO	H3375
0.3 ml insulin syringe with 31 G x 5/16" (8 mm) needle	BD Insulin Syringe; Franklin Lakes, NJ	328438