En tiempo real de imágenes de rayos X de los pulmones de volúmenes de líquido en pulmón de ratón neonatal

Abstract

En el nacimiento, el pulmón experimenta un profundo interruptor fenotípica de la secreción a la absorción, lo que permite la adaptación a respirar de forma independiente. Promoción y mantenimiento de este fenotipo es críticamente importante en el crecimiento y el intercambio de gas alveolar normal de toda la vida. Varios estudios in vitro han caracterizado el papel de las proteínas reguladoras clave, moléculas de señalización, y hormonas esteroides que pueden influir en la velocidad de eliminación de líquido pulmonar. Sin embargo, en los exámenes vivo deben ser realizadas para evaluar si estos factores reguladores desempeñan importantes funciones fisiológicas en la regulación de la absorción de líquido pulmonar perinatal. Como tal, la utilización de imágenes de rayos X en tiempo real para determinar el líquido de limpieza de pulmón perinatal, o edema pulmonar, representa un avance tecnológico en el campo. Aquí, nos explican e ilustran un método para evaluar la velocidad de eliminación de líquido pulmonar alveolar y la inundación alveolar en ratones C57BL / 6 en el día post parto nosotros 10ing formación de imágenes y análisis de rayos X. La implementación exitosa de este protocolo requiere la aprobación previa de los comités institucionales de cuidado y uso de animales (IACUC), un sistema de imágenes de rayos X de pequeño animal in vivo, y software de imágenes moleculares compatibles.

Introduction

Al nacer, el pulmón del recién nacido debe hacer la transición desde un fluido que secretan a un órgano reabsorber fluido para establecer la ventilación y la oxigenación del cuerpo adecuada. Los mecanismos que facilitan (o dificulte) una depuración efectiva del líquido pulmonar en el momento del nacimiento no están claros. Modelado de la velocidad de eliminación del fluido alveolar en C57BL / 6 crías de ratón recién nacido va a llevar a una mejor comprensión de los factores regulatorios que pueden realzar o atenuar la tasa de absorción de líquidos. También se podría aplicar a otros modelos neonatales de la lesión pulmonar aguda o infección, y podría conducir a nuevas estrategias terapéuticas para los recién nacidos con dificultad respiratoria.

Dado que los pulmones del recién nacido son minúsculos en comparación con los adultos pulmones, las medidas convencionales de líquido de limpieza alveolar que se basan en mediciones de lavado o gravimétrico puede no ser adecuado para estudiar con precisión el líquido de limpieza de pulmón en modelos pulmonares neonatales. En este protocolo, se demuestra un ensayo que permitela determinación precisa de las tasas de eliminación de fluidos alveolares en postnatal cachorros día 10 de C57BL / 6 ratones usando un pequeño generador de imágenes de animales. Una ventaja importante de utilizar un enfoque fluoroscópica es que los animales son imágenes in vivo. Ellos están respirando libremente y pueden recuperarse de este ensayo mínimamente invasiva para el futuro de la observación y estudio. El objetivo general de este método es el modelo de edema pulmonar en el pulmón del recién nacido, y evaluar la velocidad de eliminación del fluido alveolar en pulmón neonatal. Esta técnica fue desarrollada, en parte, como una estrategia de reducción para disminuir el número de animales necesarios, sin embargo, maximizar la producción experimental. Esta técnica también permite la detección superior de los volúmenes de fluidos pulmonares utilizando imágenes de rayos X y requiere el dominio de sujeción de los animales básica y gastos de envío ^1; pequeña cirugías animales y traqueal instilación ^2, un pequeño generador de imágenes animal, y el software básico de análisis de imagen. Los investigadores que deseen evaluar los volúmenes de líquido pulmonar in vivo (BRE librementeathing anestesiado modelos animales) puede encontrar el procedimiento adecuado para su aplicación. Por último, este protocolo podría aumentar otros modelos existentes de la lesión pulmonar neonatal utilizado en el estudio mecanicista de la displasia broncopulmonar, incluidas las lesiones inducidas por hiperoxia pulmonar, ventilación mecánica, y los modelos de inflamación pulmonar ^3.

Protocol

Todas las técnicas experimentales deben llevarse a cabo de conformidad con las directrices de Cuidado institucional y el empleo.

1. X-ray Imaging Acquisition

1. Descripción general del software (Ver Figura 1 para una descripción de Configuración de software).
   1. Seleccione el botón de captura directamente debajo de la pestaña Archivo.
   2. En el menú desplegable Configuración, seleccione la sesión actual.
   3. Seleccione Estándar de exposición en el cuadro desplegable situado bajo tiempo de exposición.
   4. Ajuste el tiempo de exposición a 2,00 min, y No. Las exposiciones a 1. Establecer la Agrupación X e Y Intervalos de 2 píxeles. Ver Figura 1.
   5. Seleccionar Acumulación final en el menú desplegable Opciones de exportación.
   6. En los ajustes de iluminación, seleCT de rayos X en el menú desplegable Fuente de iluminación. El valor por defecto KVP se ha fijado en 35.
   7. Seleccione Selección automática en el menú Aplicar archivo de referencia desplegable para aplicar el archivo de referencia de rayos X correspondiente. (Consulte la sección 2).
   8. En la cámara en su configuración, configurar el f-stop a 2,51.
   9. Ajuste el FOV (campo de visión) a 125.64 para los ratones PN10.
   10. Establecer el plano focal a 13, y en el menú desplegable junto al control deslizante de plano focal, seleccione X-Ray.
   11. Para los rayos X, establezca el filtro de excitación y el filtro de emisión a 0 en el menú desplegable.
   12. Almacenar la sesión actual haciendo clic en Nuevo en la parte superior junto a Configuración. Introduce el nombre de Nueva Adquirir Archivo de ajustes, por ejemplo, "Jove único evento de exposición para la fabricación de un protocolo." Vea la Figura 2.
   13. La creación de un protocolo de imágenes de rayos X
       1. Haga clic en el botón Crear / Modificar protocolos en el lado derecho de la ventana abierta.
       2. A medida que aparece la ventana emergente nuevo Protocolo, haga clic en el botón Nuevo en la esquina superior derecha
       3. Introduzca el nombre que el protocolo guardará bajo, por ejemplo, "Protocolo de demostración Jove", y haga clic en OK. (Ver Figura 3).
       4. En la parte inferior de la ventana emergente Protocolo de Protocolo de pasos, asegúrese de que el paso 1 se pone de relieve en el texto de color rojo, la captura de imágenes nuevas se selecciona, y no hacer nada se selecciona en el menú desplegable de captura de imagen Antes.
       5. En Capture Setting, seleccione el evento exposición única recientemente generada desde el paso 1.1.12.
       6. Seleccione de espera (seg) en el menú desplegable Después de Captura de Imagen.
       7. Haga clic en el botón Editar, típe 180 en el cuadro desplegable, y haga clic en Aceptar para agregar un tiempo de espera de 3 minutos después de cada adquisición de 2 min.
       8. Duplicar Paso 1 haciendo clic derecho en la pestaña Paso 1 Paso y seleccionando Duplicar. Crear 23 duplicados para un periodo de observación de 2 horas. (Ver Figura 4).
       9. En el último paso (paso 24), cambiar la Después del ajuste a No hacer nada en espera (seg) Captura de Imagen.
       10. Haga clic en el botón Guardar y salir del Editor Protocolo.

   2. Archivos de referencia de iluminación

   Nota: Aplicar archivos de referencia de la iluminación de rayos X para una imagen de rayos X con el fin de corregir automáticamente las variaciones en la uniformidad del detector de las imágenes de rayos X obtenidos a lo largo experimento. Los procedimientos descritos a continuación son específicas del Bruker animales in vivo Imaging Systems; otros sistemas de formación de imágenes in vivo puedeser usado.

   1. Generar un archivo de referencia de la iluminación abriendo el software de imagen molecular y hacer clic en el botón de captura.
   2. Mediante el menú emergente, establecer los ajustes de captura de rayos X en Fuente de iluminación (ver ajustes sugeridos en el apartado 1 anterior) y luego seleccione Referencia de iluminación en el tipo de exposición. Esto se puede encontrar en las exposiciones estándar cuadro desplegable. (Ver Figura 5).
   3. Retire todas las muestras de la estación de imagen. Ajuste el binning X e Y de 4 x 4 hurgar en la basura. Consulte la Tabla 1: tiempos de exposición archivo de referencia de iluminación para determinar el momento exacto de la exposición.
   4. La exposicion de prensa.
   5. Aplicar el archivo de referencia mediante la selección de la selección automática desde el menú desplegable bajo Aplicar archivo de referencia. (Ver Figura 6). El archivo de referencia de la iluminación ahora se aplicará automáticamente a todos los im-rayos Xedades capturados con los mismos ajustes de la cámara. Los pasos 2.1 a 2.4 no tendrá que repetirse si los ajustes de la cámara mismos son utilizados en experimentos posteriores.
      Nota: Un archivo de referencia de la iluminación se puede aplicar después de la adquisición de imágenes, o si se produce un mensaje de error después de auto-selección de los archivos de referencia. Aplicar la iluminación archivos de referencia de la captura de la imagen utilizando la siguiente serie de comandos en el panel de navegación del software de imagen molecular: Imagen> Matemáticas> Imagen Tipo: Tarea> Calcular: Corrección de la iluminación. Seleccione la imagen de entrada (X) que desea aplicar el archivo de referencia de iluminación (Y) para. Cambie el nombre del archivo corregido (Z). (Ver Figura 7).

   3. Manejo de Animales

   1. La adquisición de Animales
      1. Compra presas embarazadas de los criadores comerciales o criar ratones hembra en casa a las 12 semanas de edad (o más) de conformidad con la directriz institucionals.
      2. ratones recién nacidos casa con las madres lactantes hasta el día postnatal (PN) 10.
   2. Anestesia Animal (PN 10)
      1. Preparar un cóctel de ketamina / xilazina para anestesiar PN 10 ratones para efectos anestésicos prolongados que duran hasta 40 minutos. Añadir 500 l de ketamina (100 mg / ml) a 75 l de xilazina (100 mg / ml). Diluir 1:10 en una solución salina al 0,9% para hacer una mezcla de ketamina (100 mg / kg) / xilazina (10 mg / kg) cóctel anestésico.
      2. Pesar los ratones recién nacidos.
      3. Usando una jeringa de 3/10 con una aguja 31 G 5/16 pulgadas (8 mm), administrar 10 l / g de peso corporal de la anestesia con una inyección intraperitoneal.
      4. Mantener a los animales en seco y aislados para evitar la pérdida excesiva de calor corporal.

   4. traqueal instilaciones

   1. Preparar una solución salina intratraqueal compuesto por NaCl 140 mM, KCl 5 mM, 1 mM CaCl _2, y HEPES 10 mM; pH = 7,4. La osmolalidad de esta solución debe ser319 mosm / kg _{de H2O}
   2. Monte anestesiaron los animales lado ventral hacia arriba sobre una tabla inclinada quirúrgica utilizando cinta quirúrgica. Ensurethat cabezas de los animales se encuentran en la parte superior de la pendiente.
   3. Realizar una pizca dedo del pie para asegurarse de que los animales son anestesiados y listo para la cirugía. Desinfectar todas las áreas quirúrgica, instrumentos, y la región torácica del animal.
   4. Hacer una pequeña incisión (3 mm) en la cara ventral anterior medial del cuello (región de la garganta), utilizando un bisturí quirúrgico, tamaño 11. Hacer a un lado el platisma y anterior músculos traqueales utilizando unas pinzas de punta roma con el fin de visualizar y acceder a la tráquea.
   5. Inculcar 3 l / g de peso (aproximadamente 10 - 30 l de volumen final) de solución salina a través de la tráquea expuesta utilizando una aguja de 31 G 5/16 pulgadas (8 mm). La pequeña incisión se deja abierta durante el diagnóstico por animal y por lo general se cura bien. Consulte con local de la División de Recursos Animales para determinar si la incisión del mismo modo puede dejarse abierta. De lo contrario, suturas puedenser requerido.

   5. Animal Imaging

   1. Coloque los cachorros ventral en un fondo claro,, bandeja extraíble de imágenes de animales. Centre los animales de modo que el haz de rayos X será directamente sobre la zona torácica.
   2. Para cohortes de animales numerados impares, colocar la primera pup directamente en el medio de la bandeja, y por cohortes pares colocan la primera pup justo a la izquierda del centro de modo que cuando los otros animales se colocan en la bandeja de todos los animales se centran.
   3. Devolver la bandeja de imágenes para el gabinete de imágenes de rayos X y cierre la puerta del armario.
   4. Encienda la unidad de control térmico de los animales para mantener la temperatura corporal de los animales anestesiados. Utilice el ajuste alto para alcanzar una temperatura de la cámara de aproximadamente 35 - 37 ° C. Encendido de la unidad de anestesia para animales (isoflurano vaporizado entregado a través de oxígeno) para asegurar que los animales son anestesiados y se inmovilizan en toda la duración del procedimiento de imagen de 2 horas.
   5. La ejecución de protocolo de formación de imágenes de rayos X
      1. Haga clic en Capturar y seleccione el protocolo apropiado, por ejemplo, "Protocolo de demostración Jove," desde el menú desplegable Protocolo. (Ver Figura 8).
      2. Haga clic en el botón Ejecutar Protocolo seleccionado en el software de imagen molecular.
         Nota: Aparecerá una ventana emergente para realizar el seguimiento del estado de la adquisición de la imagen, cuando el protocolo se ha completado la ventana desaparecerá. La dosis de rayos X es bajo, <a 0,3 mRem o alrededor de 10 veces menos que una radiografía dental. Al igual que con otros procedimientos de rayos X, no hay radiación residual.
      3. Cuando la sesión de adquisición de 2 horas, retire los animales de la bandeja de imágenes y devolverlos a sus jaulas. Observar a los animales para la recuperación completa antes de volver a bastidores.

   Análisis 6. Datos

   Nota: El software de imagen molecular permite la cuantificación y la traducción de Xray intensidad de los píxeles en la velocidad de eliminación de líquido pulmonar. Los pasos siguientes describen los procedimientos necesarios para normalizar las imágenes de rayos X y cuantificar las intensidades en las regiones definidas de interés (ROI).

   1. Diseñar una plantilla de retorno de la inversión
      Nota: Una región de la plantilla de interés debe ser creado específica a las imágenes de rayos X capturados durante el estudio 2 hr, y se debe utilizar con el fin de comparar las intensidades de rayos X entre los grupos experimentales. Desde pequeños volúmenes de desafíos de solución salina normalmente se acumulan en el lóbulo superior izquierdo del pulmón ^4-6, la ROI (s) debe centrarse en esta porción del pulmón.
      1. Abrir la primera y la última imagen de rayos x en el conjunto de 2 horas. Seleccione la ventana de la imagen de la primera radiografía.
      2. En la barra de herramientas de navegación, seleccione Manual-ROI> Nueva ROI Set.
      3. Haga clic ROI Elipse y crear un retorno de la inversión que cubra adecuadamente la izquierda lung.An ROI del ratón no se define hasta que el rojo, esbozó ROI es dragged a una posición diferente. Un ROI definido se resume en azul con un número.
      4. Si se crean imágenes de varios cachorros, haga clic en el rojo, el ROI se indica y arrastrar a los pulmones izquierdos de los otros ratones para crear más regiones de interés individual en el mismo conjunto. Arrastre el rojo, el ROI se indica a una zona con un fondo claro para crear un retorno de la inversión del fondo.
         1. Seleccionar puntero de selección para posicionar las regiones de interés para mentir sobre el pulmón izquierdo de cada ratón, directamente debajo de la segunda costilla.
      5. En la barra de herramientas superior, haga clic en la pantalla de imagen.
      6. Compruebe superposición en el diálogo de la pantalla de imagen para superponer la imagen de rayos X última vez que mantiene las ubicaciones conjunto de ROI. Si es necesario, seleccione puntero de selección en la barra de herramientas de navegación para ajustar las posiciones de las ROI y asegurar una cobertura adecuada de pulmón en ambas imágenes.
      7. En el diálogo ROI Manual, seleccione Plantilla> Guardar modelo. nombre tque plantilla y haga clic en OK.
      8. Cierre las dos imágenes. Seleccione No cuando se le pida para guardar los cambios.
      9. Aplicar la plantilla de retorno de la inversión de cada imagen de rayos X capturado para analizar el líquido de limpieza al abrir todas las imágenes tomadas durante el estudio para. Para empezar, seleccione un archivo abierto y haga clic en regiones de interés Manual> Plantilla.
      10. Seleccione la plantilla de ROI previamente creado en el menú desplegable y haga clic en Aplicar a todos los documentos abiertos.
   2. Exportación numérica ROI Los datos de las imágenes a una hoja de cálculo
      1. En la esquina superior izquierda, haga clic en Archivo> Exportar datos> ROI.
      2. Compruebe como se muestra y apertura automática en Excel en el cuadro de diálogo emergente.
      3. Seleccionar documentos de exportación todas abiertas.
      4. Nombre del archivo y haga clic en Guardar.
      5. software de imágenes moleculares estrecha.

Representative Results

Los paneles de la izquierda en las figuras 9 - 10 son de PN 10 pulmones de ratones fotografiados al inicio del estudio (pre-inculcado). Estas imágenes muestran la instilación de solución salina con éxito de desafíos en el lóbulo izquierdo de los pulmones neonatales. En la Figura 9, el pulmón de ratón se traqueal inculca con la solución salina se ha definido anteriormente (ver sección 2.1). Los paneles central y derecha de la figura 9 son imágenes de rayos X desde el mismo ratón obtenido 5 minutos y 2 horas después de la instilación; este animal se había aclarado con éxito el reto de solución salina. En concreto, la intensidad de los rayos X de esta ROI animales aumentó de 187,67 a 515. Por lo tanto, existe una correlación inversa entre la densidad de píxel y el volumen de líquido del pulmón; es decir, cuanto mayor es el valor relativo, la menor cantidad de líquido que hay en los pulmones. Puede ser útil para entender que más energía de rayos X es absorbida (por lo tanto un valor reportado mayor) cuando hay menos líquido attenuating de la radiografía. En la Figura 10, el pulmón de ratón PN 10 se instiló traqueal con un compuesto que contiene glutatión oxidado (reconstituida en solución salina se describe en 2.1) que inhibió el líquido de limpieza alveolar de la provocación con solución salina mediante el bloqueo de la actividad del canal de sodio epitelial; el valor numérico de retorno de la inversión de este animal se reducirá de la pre-inculcar y archivos de imagen formada de rayos X después de la inculcado, indicativo de aumento de opacidad a los rayos X. En concreto, la intensidad neta del animal aproximadamente 5 minutos después de la instilación era - 64, y la disminución de - 182. Una vez más, tenga en cuenta la relación inversa entre la intensidad de píxeles ROI y la cantidad de líquido en los pulmones; aumento de líquido en el lóbulo superior izquierdo del pulmón atenúa la absorción de rayos X.

La evaluación de la intensidad neta de la ROI permite la evaluación cuantitativa de los cambios en la velocidad de eliminación de líquido pulmonar, aunque el software de adquisición también permite a los investigadores para expresarlos datos en términos de g / ^cm3, si se desea. Por otra parte, los investigadores pueden utilizar cada animal como su propio control y normalizar todas las intensidades de rayos X a un punto de tiempo inicial (Io), tales como t = 5 min y reportar los cambios netos en opacidad a los rayos X (es decir, una medida del cambio en volúmenes de fluido pulmonar).

Figura 1. Ajustes de exposición. Esta captura de pantalla ilustra la configuración de exposición apropiados utilizados en este protocolo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Configuración del archivo. Esta captura de pantalla muestra un paso clave en la generación de un valor de archivo que se utilizaráen un protocolo. Una ventana pop-up (como se muestra) solicitará un nuevo nombre para el archivo de configuración de adquisición. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Protocolo de imagen. Esta captura de pantalla muestra un paso clave en la determinación de si un nuevo protocolo de formación de imágenes se ha creado correctamente. Una ventana pop-up (como se muestra) aparecerá y será solicitado un nuevo nombre de protocolo para el protocolo generada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. ProtOcol pasos. Esta captura de pantalla muestra un atajo para duplicar un archivo de configuración de adquisición, insertar un nuevo paso, o para borrar un paso dentro de un protocolo de obtención de imágenes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Iluminación de referencia. Esta captura de pantalla muestra el comando de referencia de la iluminación y la configuración adecuada en el software de imagen animal apropiado para la creación de un archivo de referencia de la iluminación. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Selección automática Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. Corrección de la iluminación. Esta captura de pantalla muestra la aplicación apropiada de un archivo de referencia de la iluminación generada después de la impresión animal. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8. Ejecutar Protocolo. Esta captura de pantallailustra cómo ejecutar un protocolo seleccionado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9. imágenes de rayos X de los pulmones despejados imagen representativa de PN 10 pulmones antes de recibir una provocación con solución salina. (Pre-inculcar; panel de la izquierda); 5 minutos después de la instilación (panel central), y 2 horas después de la provocación con solución salina había desaparecido de los pulmones por lo demás sanos (panel derecho). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10. Imágenes de rayos X de los pulmones inundados. Represenimagen tativo de PN 10 pulmones antes de recibir un desafío de solución salina (pre-instill; panel de la izquierda) que contiene disulfuro de glutatión, que inhibe el transporte de soluto paracelular; 5 minutos después de la instilación de disulfuro de glutatión (panel central), y 2 horas después de la inhibición del transporte paracelular que conduce a la inundación alveolar (panel derecho). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Sin filtro =	exposición 10 sec
0,1 mm =	exposición 15 sec
0,2 mm =	exposición 20 sec
0,4 mm =	exposición 30 sec
0,8 mm =	exposición 30 sec
El tamaño del filtro de rayos X se correlaciona con un tiempo de exposición específico para crcomiendo un archivo de referencia de la iluminación.

Tabla 1. Iluminación de referencia del archivo. Este fichero informa de los tiempos de exposición apropiados para la generación de archivos de referencia de iluminación basado en filtros de rayos X utilizados en los estudios de imagen.

Discussion

El uso de imágenes de rayos X, imágenes claras de los pulmones neonatales pueden ser analizados por los volúmenes de fluidos pulmonares. Nos ^{7,3,11, 10} y otros, hemos utilizado con éxito imágenes de rayos X para determinar los cambios dinámicos en el volumen de líquido pulmonar en modelos animales anestesiados libremente la respiración, y esta técnica es una gran promesa para avanzar en el estudio de la lesión pulmonar neonatal. Una gran ventaja en el uso de nuestro enfoque para evaluar el volumen de líquido de pulmón (en oposición a constrast fase de rayos X ^10, por ejemplo) es que hasta cinco PN10 crías de ratón se pueden estudiar simultáneamente usando un sistema de imagen que es lugar común en las instalaciones de investigación y núcleos .

Infundir un volumen de líquido pulmonar adecuada, para no ahogarse o contraer el pulmón, es fundamental para la implementación exitosa de este protocolo y pueden necesitar ser explorado experimentalmente antes de protocolos de imágenes de rayos X se pueden aplicar. La sensibilidad de este ensayo permite la detección de muy pequeño volumES de solución salina inculcado a través de la detección de rayos X. Hemos sido capaces de discernir las diferencias en la opacidad de rayos X de los pulmones neonatales inculcados con 10 volúmenes de suero fisiológico. La diferencia de opacidades de rayos X son aún más pronunciada cuando los inhibidores de los canales de sodio se introducen en el espacio aéreo alveolar porque los desafíos de solución salina no pueden ser absorbidos y los pulmones continúan secretando fluido en el espacio aéreo. En el caso de que se introduce un volumen inapropiadamente alta de la solución salina, la colocación de los animales en la cámara de formación de imágenes con el oxígeno que fluye en la cámara a través de los puertos de la anestesia puede facilitar la respiración en los pulmones inundados.

Nuestros resultados utilizando imágenes de rayos X son comparables a los espacios libres de fluidos alveolares se mide usando enfoques más convencionales, como el pulmón relaciones en peso de húmedo a seco y azul de Evan para la determinación de la concentración de proteína ^4. Ahora demuestran que este enfoque puede ser aplicado a la cría de ratón neonatal. Este im de rayos Xtécnica de envejecimiento para la determinación de los volúmenes de fluido de pulmón se puede combinar fácilmente con técnicas de imagen adicionales. Por ejemplo, marcadores fluorescentes o sondas bioluminiscentes pueden ser infundidos de forma simultánea en los alvéolos y evaluados. (La detección de sondas fluorescentes y luminiscentes se ha descrito ^8, y está más allá del alcance de este informe). La capacidad para co-registrar el volumen de fluido pulmonar (utilizando las imágenes de rayos X), junto con la capacidad de detectar biomarcadores fluorescentes es una de las varias ventajas del uso de este ensayo dinámico y el sistema comercial para la medición de líquido de limpieza de pulmón. Otros beneficios de la utilización de este enfoque para la determinación de aclaramiento y el volumen de líquido pulmonar relativa incluye la capacidad para llevar a cabo estudios longitudinales (disminuyendo así el número de animales necesarios para lograr observaciones estadísticamente significativas), y la capacidad de detectar los pequeños cambios en el volumen de líquido de pulmón en respirar libremente , anestesiados, los cachorros recién nacidos de ratón. Una limitación de utilizar unaenfoque de formación de imágenes in vivo, sin embargo, es que la anestesia puede alterar la distribución de gas y el flujo sanguíneo dentro de los pulmones. Los desajustes en la ventilación y la perfusión (V / Q) y la derivación se ha demostrado que aumentar bajo anestesia en voluntarios adultos sanos ^12, reduciendo así la oxigenación del cuerpo. Este efecto adverso, sin embargo, puede ser compensada mediante el aumento de la concentración de oxígeno inspirado. Desde un punto de vista técnico, la variabilidad entre los sistemas de formación de imágenes en la energía flujo de rayos X puede requerir la optimización de cada sistema antes de realizar los estudios de imagen. Por ejemplo, en un sistema con una fuente de rayos X con más flujo y / o un detector con eficiencia cuántica superior, un mayor f / parada y el estado binning inferior podría proporcionar una mejor calidad de imagen cuando se evalúa pequeño cambio en la impedancia de rayos X.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Preclinical Imaging System (In- Vivo MS FX PRO)	Bruker; Billerica, MA
Ketamine	Ketaset; Fort Dodge Animal Health, IA	26637-411-01
Xylazine	Lloyd Laboratories; Shenandoah, IA	4821
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (with Calcium and Magnesium)	Lonza; Walkersville, MD	17-513F
Sodium chloride	Amresco; Solon, OH	241
Potassuim chloride	Fisher Scientific; Fair Lawn, NJ	P217-3
Calcium chloride	Sigma-Aldrich; St. Loius, MO	C5080
HEPES	Sigma-Aldrich; St. Loius, MO	H3375
0.3 ml insulin syringe with 31 G x 5/16" (8 mm) needle	BD Insulin Syringe; Franklin Lakes, NJ	328438