Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحليل وظائف الخلايا الصاري في فيفو باستخدام 'الصاري خلية طرق في' الفئران

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52753
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

Summary

نحن نصف طريقة لتوليد الخلايا الصاري المشتقة في المختبر ، وغرغرتها في الفئران التي تعاني من نقص الخلايا الصاري ، وتحليل النمط الظاهري والأرقام وتوزيع الخلايا الصارية المحتقنة في مواقع تشريحية مختلفة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم وظائف الخلايا السارية في الجسم الحي.

Abstract

الخلايا الصارية (MCs) هي خلايا دموية موجودة في أنسجة مختلفة ، وهي وفيرة بشكل خاص في المواقع المعرضة للبيئة الخارجية ، مثل الجلد والمسالك الهوائية والجهاز الهضمي. اشتهر دورهم الضار في الحساسية التي تعتمد على IgE ، كما ظهرت MCs كلاعبين مهمين في الدفاع المضيف ضد السم والبكتيريا الغازية والطفيليات. يمكن أن يتأثر النمط الظاهري ووظيفة MC بالعوامل المحيطة الدقيقة التي قد تختلف وفقا للموقع التشريحي و / أو استنادا إلى نوع أو مرحلة تطور الاستجابات المناعية. لهذا السبب، ونحن وآخرون قد فضلت في نهج في الجسم الحي على أساليب في المختبر للحصول على نظرة ثاقبة وظائف MC. هنا، نقوم بوصف طرق توليد المركبات متعددة الثقافات المشتقة من نخاع العظم (BMCMCs)، ونقلها بالتبني إلى فئران ناقصة وراثيا MC، وتحليل أعداد وتوزيع MCs المنقولة بالتبني في مواقع تشريحية مختلفة. وقد استخدمت هذه الطريقة ، التي تسمى'الصاري خلية طرق في' النهج ، على نطاق واسع على مدى السنوات ال 30 الماضية لتقييم وظائف الشركات متعددة الأجهزة والمنتجات المشتقة من MC في الجسم الحي. ونناقش مزايا هذه الطريقة وحدودها، في ضوء النهج البديلة التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة.

Introduction

الخلايا الصارية (MCs) هي خلايا ما بين الهيماتوبوتية التي تنشأ من سلف نخاع العظم متعدد القدرات1-3. بعد خروج نخاع العظم، تهاجر السلف MCs إلى أنسجة مختلفة حيث تتطور إلى MCs ناضجة تحت تأثير عوامل النمو المحلية1-3. تقع MCs المقيمة في الأنسجة بشكل استراتيجي في واجهات البيئة المضيفة ، مثل الجلد والخطوط الجوية والجهاز الهضمي ، حيث تتصرف كخط دفاع أول ضد الإهانات الخارجية3-6. وغالبا ما تصنف الشركات متعددة الشخصيات على أساس خصائصها الظاهرية "الأساسية" ومواقعها التشريحية. في الفئران، تم وصف نوعين من MCs: "النسيج الضام من نوع" MCs (CTMCs) وMCs المخاطية (MMCs)1-3،7،8. غالبا ما تقع CTMCs حول النولس وبالقرب من الألياف العصبية ، وتقيم في تجاويف مصلية ، في حين تحتل MMCs مواقع داخل الظهارة في الأمعاء والغشاء المخاطي التنفسي1-3.

وقد طبقت منهجيات عديدة لدراسة الوظائف البيولوجية لمركبات الكربون المتعددة المركبات9-13. وقد ركزت مجموعات كثيرة على النهج في المختبر باستخدام خطوط الخلية إما (مثل خطوط MC الإنسان HMC114 أو LAD215,16), في المختبر MCs المستمدة (مثل الإنسان الطرفية المشتقة من الدم MCs17, أو نخاع العظام الماوس-MCs المستزرعة المشتقة [BMCMCs]18، MCs المستزرعة المشتقة من جلد الجنين [FSCMCs]19 و MCs المشتقة من الخلايا الصفاقية [PCMCs]20)أو MCs المعزولة من مواقع تشريحية مختلفة. وتستخدم جميع هذه النماذج على نطاق واسع لدراسة التفاصيل الجزيئية لبيولوجيا MC، مثل مسارات الإشارات المشاركة في تنشيط MC. ومع ذلك ، فإن جانبا هاما من بيولوجيا MCs هو أن خصائصها الظاهرية والوظيفية(على سبيل المثال، محتوى بروتياز الحبيبية السيتوبلازمية أو الاستجابة لمحفزات مختلفة) يمكن تحويرها حسب الموقع التشريحي والبيئة الدقيقة2،7. منذ الخليط الدقيق من هذه العوامل التي تواجهها في الجسم الحي قد يكون من الصعب إعادة إنتاج في المختبر، ونحن نفضل استخدام في نهج في الجسم الحي للحصول على رؤى في وظائف MCs9.

توجد عدة سلالات فأرة مع نقص MC الوراثي ، مثل WBB6F1المستخدم على نطاق واسع -كيت W / W-v أو C57BL /6 - كيت W-sh/W-sh الفئران. هذه الفئران تفتقر إلى التعبير و / أو نشاط KIT (CD117)، مستقبلات عامل نمو MC الرئيسي عامل الخلايا الجذعية (SCF)21،22. ونتيجة لذلك ، فإن هذه الفئران لديها نقص عميق MC ولكن لديها أيضا تشوهات إضافية فينوتيبيك تتعلق بطفراتهاc-kit (في WBB6F1-Kit W / W-v mice) أو بآثار الانعكاس الكروموسومي الكبير الذي يؤدي إلى انخفاض تعبيرc-kit (في C57BL/6 -Kit W-sh/W-sh mice)9,10,12,23. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن عدة سلالات من الفئران مع جعدة- المستقلة نقص MC التأسيسية24-26. وقد استعرضت مؤخرا كل هذه الفئران وبعض أنواع جديدة إضافية من الفئران MC ناقص غير قابل للانتقاص بالتفصيل9,10,13.

هنا، نقوم بوصف طرق توليد MCs المستزرعة المشتقة من نخاع العظم الماوس (BMCMCs)، ونقلها بالتبني إلى الفئران MC ناقصة، وتحليل أعداد وتوزيع MCs المنقولة بالتبني في مواقع تشريحية مختلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة المسماة "طرق الخلايا السارية" لتقييم وظائف MCs والمنتجات المشتقة من MC في الجسم الحي. ونناقش مزايا هذه الطريقة وحدودها، في ضوء النهج البديلة التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت جميع عمليات العناية بالحيوانات وتجريبه وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة وبموافقة محددة من اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة ستانفورد.

1. توليد وتوصيف خلايا الصاري المستزرعة المشتقة من نخاع العظم (BMCMCs).

ملاحظة: يجب أن يتم إنشاء BMCMCs المانحة من خلايا نخاع العظم من نفس الخلفية الوراثية مثل الفئران المتلقية MC ناقصة. لا تصلح مراكز BMCMCs المانحة المشتقة من الذكور لرض الفئران الإناث. وستنجح البلدان المانحة المستمدة من الإناث في رعي الإناث في متلقين من الذكور والإناث على حد سواء.

  1. استخراج نخاع العظم.
    1. صب المحلول الملحي المعقم العازل بالفوسفات (PBS) في 6 لوحة ثقافة بئر (1 بئر لكل فأر) ووضعها على الجليد.
    2. نقع أدوات تشريح في الإيثانول 70٪ للتعقيم.
    3. قتل الفئران المانحة عن طريق ثاني أكسيد الكربون (CO2)استنشاق تليها خلع عنق الرحم، ثم رش الفئران مع الإيثانول 70٪ في مواقع التلاعب.
    4. استخدام أدوات التشريح العقيمة لاستخراج عظام عظم الفخذ والساق والشظية دون قطع أي epiphyses العظام.
    5. أثناء تأمين العظام مع ملقط، كشط قبالة جميع الأنسجة من العظام (وتجاهل الشظية) باستخدام مقص معقم (أو ريش مشرط). ضع العظام في برنامج تلفزيوني على الجليد حتى يتم جمع جميع العظام.
    6. تنفيذ جميع الخطوات المتبقية في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة العقيمة. باستخدام أدوات معقمة، وتأمين العظام مع ملقط وقطع كل epiphyses لفضح تجويف النخاعي.
    7. باستخدام 3 مل المحاقن والإبر 30 G، والمتوسطة التنظيف البارد (Dulbecco تعديل النسر المتوسطة [DMEM] تكملها مع 10٪ مصل العجل الجنين [FCS، الحرارة معطلة]، 2 MM L-الجلوتامين، 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية، 50 ميكرومتر Β-mercaptoethanol)، دافق نخاع العظم الأحمر في طبق بيتري.
    8. استخدم نفس الحقنة للتفكك بين مجموعات خلايا نخاع العظم المتدفقة عن طريق الطموح اللطيف المتكرر والقذف.
    9. تجمع نخاع العظم الفخذي والظنبوبي من كل فأر إلى أنبوب طرد مركزي واحد 15 مل. ملء أنبوب مع الباردة التنظيف المتوسطة لغسل خلايا نخاع العظام والطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
  2. ثقافة BMCMCs.
    1. إزالة supernatant واستعادة خلايا نخاع العظام بيليه في 10 مل من المتوسطة الثقافة (DMEM تكملها مع 10٪ مصل العجل الجنيني [FCS، الحرارة المعطل]، 2 مللي متر L-الجلوتامين، 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية، 50 ميكرومتر Β-mercaptoethanol و 20٪ WEHI-3 المتوسطة مكيفة الخلية [كمصدر IL-3؛ بدلا من ذلك استخدام الماوس المؤتلف IL-3 في 10 نانوغرام /مل]).
    2. ضع خلايا في قارورة زراعة الأنسجة ذات الحجم المناسب(على سبيل المثال، T25 ل 1 فأر ، T75 للفئران 2 ، إلخ).
    3. 1-2 أيام بعد طلاء الخلايا، ونقل الخلايا المتوسطة والتعليق (ترك الحطام والخلايا الملتصقة التمسك الجزء السفلي من قارورة) إلى قارورة جديدة وإضافة متوسطة الثقافة الطازجة (10 مل / الماوس).
    4. خلال الأسابيع التالية، تغذية الخلايا كل 3-4 أيام (إضافة 10 مل من الثقافة المتوسطة لكل فأر). الحفاظ على كثافة الخلية بين 2.5 × 105-1 × 106 خلايا / مل. نقل الخلايا غير المنضمة إلى قارورة جديدة مرة واحدة في الأسبوع حتى لا توجد خلايا معتنقة في قارورة الثقافة. اختبار نضج الخلايا (انظر أدناه) قبل استخدامها في المقايسات المختبرية أو engraftment في الفئران MC ناقص.
      ملاحظة: التمايز الكامل من BMCMCs سيستغرق 4-6 أسابيع.
  3. تقييم نضج BMCMC.
    1. استخدام قياس التدفق الخلوي.
      1. غسل الخلايا (5 × 104-5 ×10 5 خلايا / شرط) مع الجليد الباردة FACS العازلة (برنامج تلفزيوني، 0.5٪ FCS) في 5 مل البوليسترين جولة أنبوب أسفل. جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أسبيرات فائقة.
      2. تمييع المضادة للفأرة CD16/32 (استنساخ 93 أو 2.4G2) الأجسام المضادة أحادية النسيلة 1:200 (2.5 ميكروغرام / مل) في العازلة FACS. إضافة 10 ميكرولتر إلى كل بيليه وإعادة الإنفاق عن طريق دوامة قصيرة. احتضان 5 دقائق على الجليد لمنع Fc ملزمة.
        ملاحظة: حماية عينات من الضوء المباشر لكافة الخطوات المتبقية.
      3. تمييع phycoerythrin (PE) اقترانها المضادة للفأرة fc εRI α (استنساخ MAR-1) 1:200 (1 ميكروغرام / مل) والفلوريسين ايزوثيوسيانات (FITC) اقترانها مكافحة الماوس كيت (CD117; استنساخ 2B8) 1:200 (2.5 ميكروغرام / مل) ("حل تلطيخ") ، أو الأجسام المضادة للتحكم في النمط المتساوي المعنية في المخزن المؤقت FACS ("حل التحكم isotype").
      4. تقسيم نصف الخلايا المحظورة من الخطوة 1.3.1.2) إلى أنبوب إضافي من أسفل جولة البوليسترين وإضافة 20 ميكرولتر من "محلول تلطيخ" في أنبوب واحد و 20 ميكرولتر من "حل عناصر التحكم متساوية النمط" في الأنبوب الآخر. احتضان 30 دقيقة على الجليد.
      5. أضف 3 مل من العازلة والطرد المركزي FACS الباردة الجليد في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 300 ميكرولتر FACS العازلة التي تحتوي على 1 ميكروغرام / مل يوديد البروبيديوم (PI، لتحديد الخلايا الميتة). انتقل إلى تحليل قياس الخلايا التدفق (انظر الشكل 2A).
    2. باستخدام تلطيخ الأزرق التولويدين.
      1. غسل 1 × 105 خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم يستنشق وإعادة إنفاق الخلايا في 200 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني.
      2. نقل تعليق الخلية إلى قناة خلوية معدة تعلق على شريحة المجهر والمضي قدما في الطرد المركزي الخلوي باستخدام جهاز الطرد المركزي الخلوي (40 × ز لمدة 5 دقائق).
      3. الهواء الجاف الشرائح لمدة 10 دقيقة ورسم دائرة الشمع حول الخلايا باستخدام قلم PAP. إضافة 0.1٪ حل الأزرق Toluidine لتغطية الخلايا. حضانة لمدة 1 دقيقة. اغسل الشرائح في مياه الصنبور الجارية لمدة دقيقة واحدة، ثم الشرائح الجافة للهواء لمدة 10 دقائق.
      4. الخلايا الأغطية باستخدام تركيب المتوسطة. انتقل إلى تحليل المجهر الخفيف (انظر الشكل 2B)

2. إنجرافتمنت من الفئران الخلايا الصاري ناقص مع BMCMCs.

  1. حقن الأذن عن طريق الحقن داخل الجلد (أي d.)
    ملاحظة: لنقل بالتبني من BMCMCs إلى بينا الأذن من الفئران MC ناقصة، نوصي بإجراء حقنتين من 1 × 106 خلايا لكل منهما (لما مجموعه 2 × 106 خلايا) لكل بينا الأذن. وقد استخدمت engraftment Intradermal من BMCMCs في بينا الأذن من الفئران MC ناقص من قبل العديد من المحققين في عدة نماذج، بما في ذلك نماذج من الحساسية المفرطة الجلدية السلبية (PCA)24،27،الدفاع المضيف ضدالسموم 28،وتفاعلات فرط الحساسية المزمنة (CHS)29،30.
    1. عد الخلايا وإعادة إنفاقها عند 4 × 107 BMCMCs /ml (1 × 106 BMCMCs / 25 ميكرولتر) في DMEM الباردة. نقل محلول BMCMCs إلى حقنة 1 مل مجهزة بإبرة 30 G. تبقي على الجليد حتى الحقن.
    2. تخدير الفئران MC-deficient 4-6 أسابيع القديمة باستخدام isoflurane (2.5٪ v/v). تحقق من عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم، وضبط isoflurane إذا أشار ومواصلة رصد التنفس و إصبع القدم قرصة الاستجابة طوال العملية. ضعي مرهم العيون مع طرف Q لمنع جفاف العينين.
    3. مع السبابة، قم بإنشاء ضغط عمودي على الوجه الظهري لثنايا الأذن لفضح وتمدد الوجه البطني.
    4. إجراء حقنتين 25 ميكرولتر أي د. من محلول BMCMC في موقعين مختلفين من الوجه البطني ل بينا الأذن، الحقنة الأولى في منتصف الأذن والحقنة الثانية نحو طرف بينا الأذن. انتظر 4-6 أسابيع بعد أي زراعة قبل إجراء تجارب في الجسم الحي.
      ملاحظة: في تجربتنا، بحلول ذلك الوقت عدد MCs/mm2 من الأدمة في الجزء الأوسط من بينا الأذن عموما مماثلة لتلك الموجودة في الموقع المقابل في الفئران نوع البرية، في حين أن أعداد MCs /mm2 في محيط بيناي الأذن عادة ما تكون أقل بكثير من تلك الموجودة في الفئران نوع البريةالمقابلة 27،28. وينبغي أن يوضع هذا في الاعتبار عند تصميم التجارب مع هذه الفئران MC-engrafted(على سبيل المثال،ينبغي حقن وكلاء مع الآثار المحتملة على وظيفة MC في الجزء المركزي من بينا الأذن، وتحليل آثار مثل هذه العلاجات ينبغي أن تركز أيضا على هذا المجال).
  2. تجويف الصفاق عن طريق الحقن داخل الصفاق (أي p.)
    ملاحظة: سيتطلب النقل بالتبني ل BMCMCs إلى التجويف البريتوني للفئران الناقصة MC حقنة واحدة من 2 × 106 خلايا لكل فأر. وقد استخدمت هذه الحقن أي p. من BMCMCs في الفئران MC ناقص من قبل العديد من المجموعات لدراسة أدوار MCs الصفاق في نماذج مختلفة، بما في ذلك نماذج من الدفاع المضيف ضدالسموم 31 أو الإنتان البكتيري32،33.
    1. عد العدد المناسب من الخلايا وإعادة الإنفاق في 1 × 107 BMCMCs / مل (2 × 106 BMCMCs / 200 ميكرولتر) في DMEM الباردة. نقل حل BMCMCs إلى حقنة 1 مل مجهزة بإبرة 25 G. تبقي على الجليد حتى الحقن.
    2. إجراء حقنة واحدة من محلول BMCMCs 200 ميكرولتر في تجويف الصفاق من الفئران التي تعاني من نقص MC لمدة 4-6 أسابيع. انتظر 4-6 أسابيع بعد أي p. engraftment قبل إجراء تجارب في الجسم الحي.
  3. الإنجرافت عن طريق الحقن الوريدي (أي الوريد).
    ملاحظة: سيتطلب النقل بالتبني ل BMCMCs عن طريق حقن أي في الفئران MC ناقص حقنة واحدة من 5 × 106 خلايا لكل فأر. الحقن الوريدي (أي) من BMCMCs في الفئران MC ناقص وقد استخدمت من قبل العديد من المجموعات لدراسة أدوار MCs في نماذج مختلفة من الأمراض, بما في ذلك نماذج من عدوى المثانة34, الربو35, تليف الرئة36, والتهاب المفاصل المضادة بوساطة37.
    1. عد العدد المناسب من الخلايا وإعادة الإنفاق في 2.5 × 107 BMCMCs /ml (5 × 106 BMCMCs/200 ميكرولتر) في DMEM الباردة. نقل محلول BMCMCs إلى حقنة 1 مل مجهزة بإبرة 30 G. تبقي على الجليد حتى الحقن.
    2. تخدير الفئران MC-deficient 4-6 أسابيع القديمة باستخدام isoflurane (2.5٪ v/v). تحقق من عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم، وضبط isoflurane إذا أشار ومواصلة رصد التنفس و إصبع القدم قرصة الاستجابة طوال العملية. ضعي مرهم العيون مع طرف Q لمنع جفاف العينين.
    3. إجراء حقنة واحدة من 200 ميكرولتر من محلول BMCMC في الوريد الذيل (أو، بدلا من ذلك، الوريد المداري الرجعية) من الماوس MC ناقصة. انتظر 12 أسبوعا بعد أي زراعة قبل إجراء تجارب في الجسم الحي.

3. تحليل الفئران المنقوصة الخلايا المنقوصة.

  1. تحليل غرغرة الأذن.
    1. وفي نهاية التجربة، يقتل الفئران عن طريقاستنشاق ثاني أكسيد الكربون يليه خلع عنق الرحم.
    2. عزل بينا الأذن وإصلاح في 10٪ (vol/vol) العازلة الفورماليين بين عشية وضحاها في 4 °C. تضمين بينا الأذن الثابتة في البارافين، وقطع 4 أجزاء ميكرومتر من بينا الأذن وجبل على الشرائح الزجاجية.
    3. وصمة عار الشرائح مع حل الأزرق Toluidine 0.1٪ لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح في ماء الصنبور لمدة دقيقة واحدة، ثم الشرائح الجافة للهواء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. الشرائح Coverslip باستخدام تركيب المتوسطة، ثم عد عدد من MCs engrafted لكل أقسام pinnae باستخدام المجهر الخفيف. تقييم كفاءة الحرمان من خلال مقارنة النسبة المئوية وتوزيع MCs في جلد الأذن من الفئران المحتقنة مقابل الفئران البرية من النوع.
  2. تحليل تجويف الصفاق.
    1. تقييم عدد الخلايا الصاري في تجويف الصفاق.
      1. وفي نهاية التجربة، يقتل الفئران عن طريقاستنشاق ثاني أكسيد الكربون يليه خلع عنق الرحم. إزالة بعناية الجلد البطني للفئران دون كسر تجويف الصفاق.
      2. حقن 5 مل من البرد أو درجة حرارة الغرفة PBS في تجويف الصفاق باستخدام حقنة 5 مل مجهزة إبرة 25 G. استخدام برنامج تلفزيوني بارد للحد من خطر تنشيط الخلايا البريتونية (وهذا مهم جدا عند تقييم التججير MC الصفاق أو مستويات بعض المنتجات المشتقة من MC في السائل اللافاج الصفاق). إجراء تدليك البطن لمدة 20 ثانية لحصاد الخلايا البريتونية.
      3. يستنشق ببطء lavage البريتوني باستخدام حقنة 5 مل مجهزة إبرة 22 G. سجل حجم الحمم المهترأة (توقع استرداد ما يصل إلى 80٪ من الحجم المحقون).
      4. نقل السائل اللافاج البريتوني في أنبوب 5 مل البوليسترين جولة أسفل والطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. أسبيرات فائقة. استرداد بيليه في 400 ميكرولتر برنامج تلفزيوني الباردة.
      5. عد العدد الإجمالي للخلايا البريتونية باستخدام غرفة قياس الدم. استخدم نصف تعليق الخلية لتحليل قياس التدفق الخلوي (كما هو موضح في الخطوة 1.3.1)، لتقييم النسبة المئوية والتعبير عن علامة من MCs المحتشدة في تجويف الصفاق. ضرب العدد الإجمالي للخلايا البريتونية بنسبة مئوية من MCs للحصول على العدد المطلق من MCs الصفاق.
      6. إجراء الطرد الخلوي مع الخلايا المتبقية كما هو موضح في الخطوة 1.3.2.2. الهواء الجاف الشرائح لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ورسم دائرة الشمع حول الخلايا باستخدام قلم PAP.
      7. تغطية الخلايا مع محلول تلطيخ مايو غرونوالد غير المخفف لمدة 5 دقائق ، يليه الغسيل في PBS لمدة 5 دقائق ، وكلاهما في درجة حرارة الغرفة. تغطية الخلايا مع Giemsa وصمة عار المخفف 1:20 مع الماء deionized واحتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح مرتين في ماء الصنبور لمدة دقيقة واحدة، ثم الشرائح الجافة في الهواء.
      8. الخلايا Coverlip باستخدام تركيب المتوسطة، وحساب النسبة المئوية من MCs engrafted باستخدام المجهر الخفيف (عن طريق عد ما لا يقل عن 400 الخلايا الإجمالية). تقييم كفاءة الحرمان من خلال مقارنة النسبة المئوية لمركبات الكربون الهيدروفلورية في الحمم البريتونية للفئران المحتقنة مقابل الفئران البرية.
    2. تقييم الخلايا الصاري في النوافذ mesenteric.
      1. بعد اللافاج البريتوني الموصوف في الخطوة 3.2.1 ، قطع الغشاء البريتوني لكشف القناة المعوية للفئران. ترتيب 4 إلى 5 نوافذ mesenteric لكل ماوس على الشريحة.
      2. إصلاح الشرائح لمدة 1 ساعة في محلول Carnoy (3:2:1 vol/vol/vol من الإيثانول والكلوروفورم وحمض الخليك الجليدي) في درجة حرارة الغرفة. الشرائح الجافة الهواء وإزالة الأمعاء (ستبقى النوافذ mesenteric ثابتة تعلق على الشرائح).
      3. وصمة عار الاستعدادات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع Csaba (الألسي الأزرق / صفران O) تلطيخ الحل.
        1. لجعل 500 مل من بقعة Csaba، وإعداد 500 مل من العازلة خلات عن طريق خلط 100 مل من محلول خلات الصوديوم 1 M مع 120 مل من 1 M HCl. جعل ما يصل إلى 500 مل مع الماء deionized وضبط درجة الحموضة إلى 1.42. ثم، حل 90 ملغ سافرانين [يحدد 'MCs ناضجة' باللون الأحمر]، 1.8 غرام الأزرق الألسي [يحدد 'MCs غير ناضجة' باللون الأزرق] و 2.4 غرام فيريس الأمونيوم كبريتات NH4Fe (SO4)2 إلى 500 مل من العازلة خلات.
      4. الشرائح Coverslip باستخدام تركيب المتوسطة، ثم عد عدد MCs engrafted لكل نافذة mesenteric باستخدام المجهر الخفيف. تقييم كفاءة الحرمان من خلال مقارنة النسبة المئوية وتوزيع MCs في النوافذ المتوسطة للفئران المحتقنة مقابل الفئران البرية.
  3. I.v. تحليل الحرمان.
    1. فينهاية التجربة ، والقتل الرحيم الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون تليها خلع عنق الرحم ، والأنسجة الحصاد ذات الأهمية(مثل الرئة والجلد أو الطحال) وإصلاح بين عشية وضحاها في 10 ٪ (فول / فول) الفورمالين المخزنة مؤقتا في 4 درجة مئوية.
    2. تضمين الأنسجة الثابتة في البارافين، وقطع 4 أجزاء ميكرومتر، وجبل على الشرائح الزجاجية. وصمة عار الشرائح مع حل الأزرق Toluidine 0.1٪ لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح في ماء الصنبور لمدة دقيقة واحدة، ثم الشرائح الجافة للهواء لمدة 10 دقائق.
    3. الشرائح Coverslip باستخدام تركيب المتوسطة وتقييم عدد وتوزيع MCs engrafted لكل أقسام الأنسجة باستخدام المجهر الخفيف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد في الشكل 1نظرة عامة على نهج'طرق الخلايا السارية'ويشمل توليد مركبات بي إم سي إم سي، وعدد الخلايا التي ينبغي أن تكون محفورة في أي p.p. أو أي أي في الفئران MC-deficient (يمكن أن يختلف العدد إذا أشير إليها على أساس التصميم التجريبي) والفاصل الزمني بين الحرمان والتجربة اعتمادا على موقع الحقن (يمكن أن يختلف هذا الفاصل الزمني أيضا، إذا أشير إلى ذلك؛ على سبيل المثال، يزيد محتوى الوسطاء المخزنين في حبيبات MC السيتوبلازمية باطراد مع الوقت38). ويبين الشكل 2 تحليلات قياس التدفق التمثيلي للخلايا والتلوين الأزرق لمركبات بي إم سي إم سي بعد 1 و15 و45 يوما من الثقافة في المتوسط DMEM التي تحتوي على 20٪ من المتوسطة المكيفة بالخلايا WEHI-3 كمصدر ل IL-3. لاحظ أن BMCMCs المستزرعة لمدة 45 يوما نقية بنسبة 95٪ ، وتحتوي على أعداد كبيرة من الحبيبات السيتوبلازمية ويمكن استخدامها في تجارب الزرع ، في حين أن الخلايا المستزرعة لمدة 15 يوما ليست مناسبة للرعي. الشكل 3 يظهر ممثل engraftment ناجحة في الأذن pinnae 4 أسابيع بعد i.d. engraftment (الشكل 3A)، في النوافذ الوسطى (الشكل 3B) وتجويف الصفاق (الشكل 3C) 6 أسابيع بعد i.p. engraftment، وفي الرئة (الشكل 3D) 12 أسابيع بعد i.v. engraftment.

Figure 1
الشكل 1:'الصاري خلية ضرب في' نموذج الماوس لتحليل وظائفMC في الجسم الحي. يتم إنشاء نوع البرية أو متحولة نخاع العظم المستمدة من MCs المستزرعة (BMCMCs) عن طريق زرع خلايا نخاع العظام لمدة 4-6 أسابيع على الأقل في 20٪ WEHI-3 المتوسطة مكيفة الخلية كمصدر لIL-3 (أو بدلا من ذلك في المتوسطة التي تحتوي على 10 نانوغرام / مل الماوس المؤتلف IL-3). ويمكن بعد ذلك أن تكون هذه BMCMCs منهمكة في الفئران MC ناقصة لخلق ما يسمى 'الصاري خلية طرق في' الفئران. يمكن حقن مركبات BMCMCs عبر طرق مختلفة (الوريد [i.v.] أو داخل الصفاق [i.p.] أو intradermal [i.d.]) للسكان المحليين (أي i.p.) أو إعادة تشكيل النظامية (أي v.) لمختلف مجموعات MC. MC وظيفة (ق) في الاستجابات البيولوجية المختلفة ويمكن بعد ذلك تحليلها عن طريق مقارنة الاستجابات في الفئران نوع البرية، والفئران MC ناقص و 'الصاري خلية طرق في' الفئران. ويمكن تحليل مساهمة (ق) من منتجات MC محددة من خلال مقارنة الاستجابات من 'الصاري الخلايا طرق في' الفئران المحتدمة مع نوع البرية BMCMCs أو BMCMCs المستمدة من الفئران التي تفتقر، أو التعبير عن أشكال المعدلة وراثيا من هذه المنتجات. (هذا هو نسخة معدلة من الشكل 1 منالمرجع. 12).

Figure 2
الشكل 2: تقييم نقاء استعدادات BMCMC عن طريق قياس التدفق الخلوي والمجهر. (أ)تحليل التدفق التمثيلي لقياس الخلايا لتعبير FcεRIα و KIT (CD117) على سطح يوم واحد (اللوحة اليسرى) و15 يوما (لوحة متوسطة) و45 يوما (لوحة اليمين) تم استبعاد الخلايا الميتة الإيجابية من Propidium (PI) من التحليل (غير مبين). تشير الأرقام إلى النسبة المئوية ل FcεRIα+KIT+ BMCMCs المسورة في المربع الأزرق. (ب) صور تمثيلية من BMCMCs ملطخة باللون الأزرق toluidine، لوحة أقل هو تكبير المناطق من اللوحة العليا المحددة في خطوط منقط أسود. أشرطة = 10 ميكرومتر.

Figure 3
الشكل 3: تقييم كفاءة الحرمان من MC في مختلف المواقع التشريحية. (أ) صور تمثيلية من 4 ميكرومتر الأذن بينا أقسام ملطخة الأزرق toluidine. (ب) صور تمثيلية لنوافذ من السينتيرية ملطخة بسافرانين/أشيا بلو ('Csaba' وصمة عار). (ج) صور تمثيلية لخلايا موجودة في سوائل اللافاج البريتونية وملطخة بمايو-غرونوالد غيمزا (MGG). (D) صور تمثيلية من 4 ميكرومتر أقسام الرئة ملطخة الأزرق toluidine. أشرطة = 50 ميكرومتر (A، B و D) أو 20 ميكرومتر (C). الصور هي من الفئران نوع البرية C57BL/6 (اللوحة العليا)، MC-ناقص كيتW-sh/W-sh الفئران (لوحة الأوسط) والفئران MC-ناقصة منهمكة مع BMCMCs نوع البرية: BMCMCs كيتW-sh/W-sh (لوحة أقل). ويشار إلى MCs مع الأسهم.

فئران الخلفيات المتاحة أرقام MC
(حالة ثابتة)		 الأنماط الظاهرية الأخرى (تمت مراجعتها في9,10,13) الإغراءات المبلغ عنها مع BMCMCs
كيتدبليو / دبليو الخامس (البنك الدولي/ إعادة x C57BL/6) واو1
(مختبرات جاكسون –
WBB6F1/J-كيت دبليو/كيت دبليو- v/J)		 غياب النسيج الضام وأجهزة MCs المخاطية فقر الدم، وانخفاض أعداد البازلاء والنيوتروف، وأوجه القصور في الخلايا الصباغية والخلايا الخلالية من كاخال، معقمة، الخ. أي35,37؛ أي31,62; أي28,29؛ i.c.50,51; أي49؛ fp.i. 63
كيتدبليو ش / دبليو ش C57BL/6
(مختبرات جاكسون –
باء 6 - ال 20 في المائة Cg-كيت دبليو ش/ HNihrJaeBsmJ) تحليل واحد تعدد الأشكال النيوكليوتيدات التي أجريت في مختبرات جاكسون يظهر أن هذه الفئران ليست سوى ~ 87٪ C57BL/6-الخلفية الوراثية.		 غياب النسيج الضام وأجهزة MCs المخاطية زيادة معتدلة في أعداد البازلاء والنيوتروفيل، وزيادة أعداد الخلايا القامع المشتقة من النخاع64،أوجه القصور في الخلايا الصباغية والخلايا الخلالية من كاخال أي23,34-36؛ أي31,62; أي28,29؛ أي49
C57BL/6J62
(مختبرات جاكسون –
باء 6 - ال 20 في المائة Cg-كيتوش/ HNihrJaeBsmGlliJ) وقد تم تجاوز هذه الفئران >11 مرة على خلفية C57BL/6J.
BALB/c65
(C.B6 -كيتدبليو ش)
مكبت5-كري;
R-DTA 		C57BL/625
(TG (Cma1-cre) أرور؛ B6.129P2-Gt(ROSA)26Sortm1 (DTA)Lky/J)		 انخفاض ملحوظ في الصفاق (98٪) والجلد (89-96.5٪) الشركات المتوسطة والمركبات المخاطية من غير المرجح أن تستنفد احتمال وجود MCs المخاطية؛ مراسل الفئران يكشف عن حذف Cre بوساطة من 'floxed' YFP transgene في ~ 30 ٪ الطحال NK الخلايا66 اي
Cpa3كر / + C57BL/626
(B6.129P2-Cpa3tm3 (icre)Hrr)		 غياب النسيج الضام وأجهزة MCs المخاطية Cpa3 أعرب في أنواع الخلايا الأخرى؛ انخفاض أعداد الباسوفيلي i.v.26
BALB/c26
(B6.129P2/OlaHsd.BALB/c-Cpa3tm3(icre)Hrr)
Cpa3-كري;
ماكل-1فلوريدا/فلوريدا 		C57BL/624
(Tg (Cpa3-cre)3Glli؛ B6; 129 -Mcl1tm3sjkJ)		 غياب النسيج الضام وأجهزة MCs المخاطية Cpa3 أعرب في أنواع الخلايا الأخرى؛ زيادة العدلات الطحال وفقر الدم الخفيف;
انخفاض أعداد الباسوفيلي		 أي24؛
أي49
i.v. (بياناتنا غير المنشورة)

الجدول 1: سلالات الفئران التي تعاني من أوجه قصور في MC التأسيسية. تتوفر عدة سلالات من الفئران معج- عدةتعتمد أوج- عدة-مستقلةنقص MC التأسيسية. من حيث المبدأ، يمكن استخدام كل هذه السلالات لتوليد 'الصاري خلية طرق في' الفئران (على الرغم من أن، على حد علمنا، وهذا لم يتم الإبلاغ عنه حتى الآن لMcpt5-Cre. فئران R-DTA). ومع ذلك، كل من هذه السلالات لديها تشوهات أخرى phenotypic والقيود التي ينبغي أن يوضع في الاعتبار عند تفسير النتائج التي تم الحصول عليها مع هذه الفئران. يمكن العثور على بعض الأمثلة على نجاح MC engraftment في المراجع. (هذا هو نسخة معدلة ومحدثة من الجدول 1 من المرجع9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ما يقرب من 30 عاما بعد وصفها الأولي38،'الصاري خلية طرق في'النهج لا يزال يقدم معلومات قيمة حول ما يمكن أن تفعله الشركات متعددة الشخصيات أو لا يمكن القيام به في الجسم الحي. كان يعتقد منذ فترة طويلة أن وظائف MCs تقتصر على دورها في الحساسية. البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام'الصاري خلية طرق في'النهج قد غيرت هذا الرأي, من خلال تقديم أدلة على أن MCs يمكن, من بين وظائف أخرى, تلعب أدوارا حاسمة في الدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض معينة4,39 أوالسموم 28,31, أو حتى يمكن قمع بعض الاستجابات المناعية29,34,40.

في وصف البروتوكول الخاص بنا ، قررنا التركيز على توليد وغرغرة MCs المستزرعة المشتقة من نخاع العظم (BMCMCs) ، لأنه يمكن توليد أعداد كبيرة من هذه الخلايا في المختبر من نخاع العظم من النوع البري أو الفئران المتحولة. ومع ذلك، يمكن أيضا زراعة MCs مباشرة من الخلايا الجذعية الجنينية (MCs المستزرعة المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية [ESCMCs])41، وعندما تكون متوافقة وراثيا، يمكن أيضا استخدام هذه الخلايا للإغراق في الفئران التي تعاني من نقص MC. هذا النهج البديل مثير للاهتمام بشكل خاص لدراسة دور البروتين الذي يؤدي نقصه إلى الفتك الجنيني في الفئران ، وبالتالي لا يمكن توليد BMCMCs الناقصة لهذا البروتين. ويمكن أيضا أن يتم نقل كل من BMCMCs وESMCs في المختبر مع الفيروسات العدسية ترميز الجينات ذات الأهمية أو shRNA لإسكات الجينات ذات الاهتمام، قبل engraftment من هذه الخلايا إلى الفئران MC ناقص31،33.

نحن عادة ما نستخدم 20٪ WEHI-3-مشروطة المتوسطة كمصدر لIL-3 لثقافة BMCMCs. ومع ذلك، يمكن أيضا استخدام IL-3 المؤتلف (10 نانوغرام/مل، كما هو موضح في الخطوة 1.2.1)، وإضافة عامل الخلايا الجذعية المؤتلف (SCF) إلى وسيط الثقافة يمكن أن يعزز بشكل كبير أعداد BMCMCs ولدت42،43. اعتمادا على الدراسة، وقد استخدمت 10 إلى 100 نانوغرام / مل من SCF المؤتلف، بالإضافة إلى IL-3، لتوليد BMCMCs36،44،45. وينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا أن المتاحة تجاريا مورين المؤتلفة SCF الاستعدادات من مختلف الموردين قد تختلف في فعاليتها في التأثير على تطوير BMCMCs. ومن المهم أيضا أن ندرك أن تفاصيل النهج المستخدم لتوليد BMCMCs (مثل ما إذا كان أحد يضيف SCF المؤتلف إلى IL-3 التي تحتوي على المتوسطة، ومدة فترة الثقافة، وما إلى ذلك)قد تؤثر على النمط الظاهري ووظيفة هذه الخلايا. على سبيل المثال، فقد أفيد أن BMCMCs يتعرض بشكل مزمن لSCF قد زادت مستويات الهيستامين وبعض proteases44،46،ولكن عرض توهين ملحوظ من fcεRI بوساطة إزالة الترغيب وإنتاج السيتوكين في المختبر45. وأخيرا، بالإضافة إلى IL-3، WEHI-3-مشروط المتوسط يحتوي على العديد من الجزيئات النشطة بيولوجيا التي قد تؤثر على وظائف MC. ولذلك فإن مركبات BMCMCs التي تم الحصول عليها باستخدام وسيطة مكيفة WEHI-3 من المرجح أن تختلف عن مركبات BMCMCs التي تم الحصول عليها باستخدام IL-3 المؤتلف (أو مع IL-3 المؤتلف بالإضافة إلى SCF). كانت هناك دراسات قليلة حول ما إذا كان أو إلى متى يتم الاحتفاظ بأي اختلافات من هذا القبيل في الأنماط الظاهرية ل BMCMCs المتولدة في أنواع مختلفة من الوسط الثقافي بعد رعي الخلايا في مواقع تشريحية مختلفة في الجسم الحي، وقد تكون دراسات إضافية من هذا النوع ذات أهمية. ومع ذلك، وبغض النظر عن ظروف الثقافة المختارة، ينبغي استخدام نفس الوصفة المتوسطة للثقافة لتوليد جميع مراكز BMCMCs لاستخدامها في الإغراء في التجارب التي سيتم تجميع النتائج منها للتحليل. وعلاوة على ذلك، ينبغي استزراع MCs لمدة 4 إلى 6 أسابيع على الأقل قبل أن يتم زراعة الفئران التي تعاني من نقص MC، من أجل الوصول إلى نقاء 95-98٪(الشكل 2). هذا هو للحد من احتمال أن وجود، في "السكان BMCMC"، من خلايا الدم غير تلك الملتزمة نسب الخلايا الصاري (التي توجد في الثقافات في فترات مبكرة بعد وضع خلايا نخاع العظام في المختبر)قد يؤدي إلى ظهور الخلايا المشتقة من الجهات المانحة بالإضافة إلى MCs في'خلية الصاري طرق في' الفئران.

نحن نقدم هنا بروتوكول مفصل ل engrafting الفئران MC ناقص مع نوع البرية أو BMCMCs متحولة intraperitoneally (أي p.) ، عن طريق الوريد (أي) أو intradermally (أي) في بينا الأذن ، لأن هذه الطرق من الحقن قد استخدمت من قبل العديد من المحققين. ومع ذلك، BMCMCs كما تم engrafted بنجاح في الجلد الخلفي47،في48القدم، داخلالمفصلي49 أو داخل الجمجمة50،51. يمكن أن يختلف عدد BMCMCs إلى engraft ، وكذلك الفاصل الزمني بين engraftment والتجربة ، اعتمادا على مسار الحقن والجهاز المستهدف إلى engraft (الشكل 1). من المهم جدا احترام هذه الفترات بعد الانغماس في BMCMCs قبل بدء التجربة من أجل إتاحة الوقت الكافي ل BMCMCs (التي ليست ناضجة تماما MCs) لتصبح أكثر نضجا في الجسم الحي. لأن محتوى الوسطاء المخزنة في حبيبات السيتوبلازمية MC يمكن أن تستمر في الزيادة خلال عمر الخلية38,52, لتجارب معينة قد يرغب المرء في زيادة الفاصل الزمني بين engraftment MC وبدء التجربة لتقييم وظيفة MC.

اعتمادا على مسار الحقن و / أو أعداد BMCMCs حقن, يمكن أن تختلف أعداد و / أو التوزيع التشريحي للMCs المنقولة بالتبني من تلك التي من السكان MC الأصلي المقابلة في الفئران نوع البرية12,23,53,54. يمكن أن الفئران MC ناقصة engrafted i.p. أو i.d. مع BMCMCs يكون حول نفس الأرقام وتوزيع MCs من السكان مولودية الأصلي في الفئران نوع البرية، في تجويف الصفاق والميسينتاري وفي الأدمة، على التوالي عند تقييمها 4 إلى 8 أسابيع بعد نقل MC12،23. لا يؤدي النقل الوريدي لمركبات بي إم سي إم سي إلى أرقام MC طبيعية و/أو توزيع في معظم الأنسجة. على سبيل المثال، لا توجد أي أو عدد قليل جدا من الشركات متعددة الأجهزة في الجلد من مثل هذه i.v.-engrafted 'الصاري الخلية ضرب في' الفئران. في 4-28 أسابيع بعد أي حقن BMCMCs في الفئران MC ناقصة، أعداد MCs في القصبة الهوائية هي أقل بكثير من تلك الموجودة في الفئران نوع البرية المقابلة. وعلى النقيض من ذلك، فإن أعداد MCs في محيط الرئة عادة ما تكون أكبر من تلك الموجودة في الفئران البرية المقابلة12,23,53,55. I.v. نقل BMCMCs يؤدي أيضا إلى مستويات عالية من MCs في الطحال، في حين توجد عادة عدد قليل جدا من MCs الأصلية في هذا الجهاز في الفئران نوعالبرية 23،56. الأهم من ذلك ، أظهرت التقارير السابقة أن أي حقن BMCMCs في الفئران MC ناقصة يفشل في أن يؤدي إلى engraftment من السكان MC في مواقع تشريحية محددة مثل الحبل الشوكي ، والغدد الليمفاوية أو القلب5457. كما لاحظت عدة مجموعات أن مثل هذا الحرمان لا يؤدي إلى رعي الأمعاء المخاطية MC (MMC)23,58-60. يجب أن تؤخذ هذه الاختلافات في أرقام MC و / أو توزيع MCs المنقولة بالتبني مقابل MCs الأصلية في الاعتبار عند تفسير البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام MC 'الخلايا السارية طرق في' نموذج9.

توجد عدة سلالات من الفئران التي تعاني من نقص MC ، واختيار أي واحد (ق) لاستخدامها في مشروع معين مهم. ج-عدة الفئران المتحولة MC-ناقصة، مثل كيتW/W-v أو كيتW-sh/W-sh الفئران، وقد استخدمت تقليديا من قبل العديد من المحققين. ومع ذلك، تعاني هذه الفئران من العديد من التشوهات الظاهرية المرتبطة بc-kitبجانب نقص MC العميق(الجدول 1). في السنوات الأخيرة ، تم الإبلاغ عن عدة سلالات من الفئران مع جعدة- المستقلة نقص MC التأسيسية24-26. بعض هذه الفئران أيضا تظهر تشوهات أخرى phenotypic بجانب نقص MC بهم (الجدول 1), ويمكن أيضا اكتشاف تشوهات إضافية كما النمط الظاهري لهذه السلالات الموصوفة حديثا لا يزال قيد التحقيق. وقد استعرضت مؤخرا كل هذه الفئران وبعض أنواع جديدة إضافية من الفئران MC ناقص بالتفصيل9,10,13.

نظرا للقيود المفروضة على كل من سلالات MC ناقص المتاحة حاليا, نوصي محاولة لاختبار الفرضيات حول وظيفة MC باستخدام أكثر من نموذج واحد من نقص MC9. في مختبرنا، ونحن عموما إجراء التجارب التجريبية في كيتW-sh/W-sh و Cpa3-Cre. فئران Mcl-1fl/fl. إذا حصلنا على نتائج متطابقة في كلا النوعين من الفئران MC ناقصة، ثم ننتقل إلى تجارب engraftment للتأكد من دور الشركات متعددة الأنواع وتقييم الأدوار المحتملة لبعض المنتجات المشتقة MC. وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن العديد من السلالات التي تسمح باستنزاف غير قابل للاختزال من الشركات متعددة الوسائط أو حذف الجينات "المتخبطة" بوساطة Cre في الشركات المتوسطة قد وصفت مؤخراأيضا 25,49,61. وقد استعرضت هذه السلالات بالتفصيل في أماكن أخرى9,10,13 وتمثل البديل الواعد - أو التكميلي - النهج لدراسة وظائف MC في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

N.G. هو المستفيد من الزمالات من الفرنسية "مؤسسة من أجل Recherche Médicale FRM" ومؤسسة فيليب; R.S. تدعمها مؤسسة لوسيل باكارد لصحة الطفل وجائزة ستانفورد NIH/NCRR CTSA رقم UL1 RR025744; 20- وتحظى شهادة البكالوريوس بدعم من زمالة ماكس كادي من مؤسسة ماكس كادي والأكاديمية النمساوية للعلوم وزمالة شرودينغر من الصندوق النمساوي للعلوم: J3399-B21؛ وزمالة شرودينغر من صندوق العلوم النمساوي( FWF): J3399-B21؛ S.J.G. تعترف بدعم المعاهد الوطنية للصحة منح U19 AI104209, NS 080062 ومن برنامج أبحاث الأمراض المرتبطة بالتبغ في جامعة كاليفورنيا; L.L.R. يعترف بدعم من مؤسسة البحوث الوطنية لالتهاب المفاصل (ANRF) والمعاهد الوطنية للصحة منحة K99AI110645.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25 G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30 G x 1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1% Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as 'tunable' effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models - Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. 'Sash' mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 99،ج-عدة،عامل الخلايا الجذعية، FcεRI، الغلوبولين المناعي E، نموذج الماوس، نقل بالتبني، علم المناعة، الحساسية
تحليل وظائف الخلايا الصاري <em>في فيفو</em> باستخدام '<em>الصاري خلية طرق في</em>' الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, … More

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter