Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analyse af mastcellernes funktioner i Vivo Ved hjælp af 'Mast Cell Knock-in' Mus

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52753
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

Summary

Vi beskriver en metode til generering af in vitro-afledte mastceller, deres engraftment i mastcelle-mangelfulde mus og analyse af fænotypen, antal og fordeling af engrafterede mastceller på forskellige anatomiske steder. Denne protokol kan bruges til at vurdere mastcellernes funktioner in vivo.

Abstract

Mastceller (MCs) er hæmatopoietiske celler, der findes i forskellige væv, og er især rigelige på steder, der udsættes for det ydre miljø, såsom hud, luftveje og mave-tarmkanalen. Bedst kendt for deres skadelige rolle i IgE-afhængige allergiske reaktioner, har MCs også vist sig som vigtige aktører i værtsforsvaret mod gift og invaderende bakterier og parasitter. MC-fænotype og -funktion kan påvirkes af mikromiljøfaktorer, der kan variere afhængigt af anatomisk placering og/eller baseret på typen eller udviklingsstadiet for immunrespons. Af denne grund har vi og andre begunstiget in vivo tilgange over in vitro metoder til at få indsigt i MC funktioner. Her beskriver vi metoder til generering af mus knoglemarvs-afledte dyrkede MC'er (BMCMCs), deres adoptivoverførsel til genetisk MC-mangelfuld mus, og analysen af antallet og fordelingen af adoptiv-overførte MC'er på forskellige anatomiske steder. Denne metode, der kaldes"mast celle knock-in"-metoden, er blevet anvendt i vid udstrækning i løbet af de sidste 30 år til at vurdere MCs og MC-afledte produkter in vivo. Vi diskuterer fordele og begrænsninger ved denne metode i lyset af alternative tilgange, der er blevet udviklet i de senere år.

Introduction

Mastceller (MCs) er hæmatopoietiske celler, der opstår fra pluripotente knoglemarvs forfædre1-3. Efter knoglemarvsudstridelse migrerer MCs-forfædre ind i forskellige væv, hvor de udvikler sig til modne MCs under indflydelse af lokale vækstfaktorer1-3. Vævsbeboende MCs er strategisk placeret på værtsmiljøgrænseflader, såsom huden, luftvejene og mave-tarmkanalen, hvor de opfører sig som en første forsvarslinje mod eksterne fornærmelser3-6. MCs er ofte subklassificeret baseret på deres "baseline" fænotypiske egenskaber og deres anatomiske placeringer. Hos mus er der beskrevet to typer MC'er: "bindevævstype" MCs (CTMCs) og slimhinde-MCs (MMCs)1-3,7,8. CTMCs er ofte placeret omkring venules og nær nervefibre, og bor i serosale hulrum, mens MMCs indtager intraepithelial steder i tarmen og respiratorisk slimhinde1-3.

Talrige metoder er blevet anvendt til at studere biologiske funktioner af MCs9-13. Mange grupper har fokuseret på in vitro tilgange ved hjælp af enten cellelinjer (såsom den menneskelige MC linjer HMC114 eller LAD215,16), in vitro afledte MC (såsom menneskelige perifere blod-afledte MC17, eller mus knoglemarv-afledt kultur18, føtal hudafledte dyrkede MC'er [FSCMCs]19 og peritoneale cellebaserede MCs [PCMCs]20) eller ex vivo isolerede MCS fra forskellige anatomiske steder. Alle disse modeller er meget udbredt til at studere molekylære detaljer i MC biologi, såsom signalering veje involveret i MC aktivering. Et vigtigt aspekt af MCs biologi er imidlertid, at deres fænotypiske og funktionelle egenskaber(f.eks.cytoplasmisk granulatproteaseindhold eller reaktion på forskellige stimuli) kan moduleres ved anatomisk placering og mikromiljø2,7. Da den nøjagtige blanding af sådanne faktorer, der opstår in vivo, kan være vanskelig at reproducere in vitro, går vi ind for at bruge in vivo-tilgange til at få indsigt i MCs-funktioner9.

Der findes flere musestammer med genetisk MC-mangel, såsom de udbredte WBB6F1-Kit W/W-v eller C57BL/6-Kit W-sh/W-sh mus. Disse mus mangler udtryk og/eller aktivitet af KIT (CD117), receptoren for den vigtigste MC vækstfaktor stamcellefaktor (SCF)21,22. Som følge heraf har disse mus en dyb MC-mangel, men har også yderligere fænotypiske abnormiteter relateret til deres c- kit-mutationer (i WBB6F1-Kit W/ W-v mus) eller til virkningerne af den store kromosomale inversion, der resulterer i reduceret c-kit-udtryk (i C57BL/6-Kit W-sh/W-sh mus) 9,10,12,23. For nylig er flere stammer af mus med c-kit-uafhængigkonstituerende MC-mangel blevet rapporteret24-26. Alle disse mus og nogle yderligere nye typer af inducible MC-mangelfulde mus er for nylig blevet gennemgået i detaljer9,10,13.

Her beskriver vi metoder til generering af mus knoglemarv-afledte dyrkede MC'er (BMCMCs), deres adoptivoverførsel til MC-mangelfuld mus, og analysen af antallet og fordelingen af adoptiv-overførte MC'er på forskellige anatomiske steder. Denne såkaldte "mastcelle knock-in"-metode kan bruges til at vurdere MCs og MC-afledte produkter in vivo. Vi diskuterer fordele og begrænsninger ved denne metode i lyset af alternative tilgange, der er blevet udviklet i de senere år.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Al dyrepleje og -forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health og med den specifikke godkendelse af Institutional Animal Care and Use Committee fra Stanford University.

1. Generering og karakterisering af knoglemarvsbaserede kulturperler (BMCMCs).

Bemærk: Donor BMCMCs bør genereres fra knoglemarvsceller med samme genetiske baggrund som modtageren MC-mangelfuld mus. Mandlige donor BMCMCs er ikke egnede til engraftment af kvindelige mus. Kvindelige donor BMCMCs vil med succes engraft i både mandlige og kvindelige modtagere.

  1. Knoglemarvsudtrækning.
    1. Hæld steril fosfat-buffered saltvand (PBS) i 6 godt kultur plade (1 godt per mus) og sted på is.
    2. Blødgør dissektionsinstrumenterne i 70% ethanol til sterilisering.
    3. Aflive donormus ved kuldioxid (CO2)indånding efterfulgt af livmoderhalskræft dislokation, derefter sprøjte musene med 70% ethanol på de steder, manipulation.
    4. Brug sterile dissektionsinstrumenter til at udtrække lårbenet, skinnebenet og fibulabenene uden at skære knoglefiser.
    5. Mens du sikrer knoglerne med en pincet, skrabes alt væv fra knogler (og kassér fibula) ved hjælp af steril saks (eller skalpelblade). Placer knogler i PBS på is, indtil alle knogler er indsamlet.
    6. Udfør alle resterende trin i steril vævskulturhætte. Brug sterile instrumenter, sikre knogler med pincet og afbrød begge epifyser for at afsløre medullærhulen.
    7. Ved hjælp af 3 ml sprøjter og 30 G nåle og koldt skyllemedium (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] suppleret med 10% føtal kalveserum [FCS, varmeinaktiveret], 2 mM L-glutamin, 1% antibiotisk antimykotisk opløsning, 50 μM Β-mercaptoethanol), skylles den røde knoglemarv i en petriskål.
    8. Brug den samme sprøjte til at adskille skyllede knoglemarvscelleklynger ved gentagen blid aspiration og udslyngning.
    9. Pool femoral og tibial knoglemarv fra hver mus i en 15 ml centrifuge rør. Røret fyldes med koldt skyllemedium for at vaske knoglemarvsceller og centrifuge ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C.
  2. BMCMCs Kultur.
    1. Supernatant fjernes, og pelleterede knoglemarvsceller genvindes i 10 ml dyrkningsmedium (DMEM suppleret med 10% føtal kalveserum [FCS, varmeinaktiveret], 2 mM L-glutamin, 1% antibiotisk-antimykotisk opløsning, 50 μM Β-mercaptoethanol og 20% WEHI-3 cellet betinget medium [som kilde til IL-3; alternativt anvendes rekombinant mus IL-3 ved 10 ng/ml]).
    2. Celler anbringes i vævskulturkolbe af passende størrelse(f.eks.T25 for 1 mus, T75 til 2 mus osv.).
    3. 1-2 dage efter plating celler, overføre medium og suspension celler (forlader snavs og vedhængende celler klæber til bunden af kolben) til en ny kolbe og tilsæt frisk kultur medium (10 ml / mus).
    4. I løbet af de følgende uger fødes celler hver 3-4 dage (tilsæt 10 ml kulturmedium pr. Mus). Celletætheden skal være mellem 2,5 x 105-1 x 106 celler/ml. Overfør ikke-klæbende celler til en ny kolbe en gang om ugen, indtil der ikke er nogen klæbende celler til stede i dyrkningskolben. Test modenhed af celler (se nedenfor) før brug for in vitro assays eller engraftment i MC-mangelfulde mus.
      BEMÆRK: Fuldstændig differentiering af BMCMCs vil tage 4-6 uger.
  3. Vurdering af BMCMC's modenhed.
    1. Brug af flowcytometry.
      1. Vaskeceller (5 x 104-5 x 105 celler/tilstand) med iskold FACS buffer (PBS, 0,5% FCS) i 5 ml polystyren runde bundrør. Centrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C. Aspirat supernatant.
      2. Cd16/32 (klon 93 eller 2,4 G2) monoklonale antistoffer fortyndes 1:200 (2,5 μg/ml) i FACS-buffer. Der tilsættes 10 μl til hver pellet og genbruges ved kortvarig hvirvelstrømning. Inkuber 5 min på is for at blokere Fc binding.
        BEMÆRK: Beskyt prøver mod direkte lys for alle resterende trin.
      3. Fortyndet phycoerythrin (PE) konjugeret antimus Fc εRI α (klon MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) og fluorescein isothiocyanat (FITC) konjugeret antimus KIT (CD117; klon 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("farvningsopløsning") eller de respektive mærkede isotypekontrolantistoffer i FACS-buffer ("isotypekontrolopløsning").
      4. Halvdelen af de blokerede celler opdeles fra trin 1.3.1.2) i et ekstra polystyren rundt bundrør og tilsættes 20 μl "farvningsopløsning" i det ene rør og 20 μl "isotypekontrolopløsning" i det andet rør. Inkuber 30 min på is.
      5. Der tilsættes 3 ml iskold FACS-buffer og centrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C. Supernatant kasseres, og pelletpenusesus i 300 μl FACS-buffer indeholdende 1 μg/ml propidiumjodid (PI til identifikation af døde celler). Fortsæt med at foretage cytometrianalyser (se figur 2A).
    2. Brug toluidin blå farvning.
      1. Vask 1 x 105 celler én gang med PBS ved centrifugering ved 400 x g i 5 minutter ved stuetemperatur, derefter indsugning og genopstudte celler i 200 μl PBS.
      2. Celleaffjedringen overføres til en forberedt cytofunnel, der er fastgjort til et mikroskopdias, og der fortsættes med cytocentrifugering ved hjælp af en cytocentrifuge (40 x g i 5 min).
      3. Lufttørre glider i 10 minutter og tegne en voks cirkel omkring celler ved hjælp af en PAP pen. Tilsæt 0,1% Toluidin blå opløsning til at dække cellerne. Inkuber i 1 min. Vask rutsjebaner i rindende vand fra hanen i 1 minut, derefter lufttørre dias i 10 minutter.
      4. Coverslip celler ved hjælp af montering medium. Gå videre til analyse af lysmikroskop (se figur 2B)

2. Engraftment af Mast Cell-mangelfuld Mus med BMCMCs.

  1. Øre engraftment ved intradermal (i.d.) injektion.
    BEMÆRK: Ved adoptivoverførsel af BMCMC'er til ørestiften af MC-mangelfulde mus anbefaler vi, at du udfører to injektioner på hver 1 x10 6 celler (i alt 2 x 106 celler) pr. ørepinna. Intradermal engraftment af BMCMCs i øret pinnae af MC-mangelfuld mus er blevet brugt af mange efterforskere i flere modeller, herunder modeller af passiv kutan anafylaksi (PCA)24,27, vært forsvar mod giftstoffer28, og kronisk overfølsomhed (CHS) reaktioner29,30.
    1. Tæl og genbrug celler ved 4 x 107 BMCMC'er/ml (1 x 106 BMCMC'er/ 25 μl) i koldt DMEM. BMCMCs-opløsning overføres til en 1 ml sprøjte, der er udstyret med en 30 G-nål. Hold på is indtil injektion.
    2. Bedøve 4-6 uger gamle MC-mangelfuld mus ved hjælp af isofluran (2,5% v / v). Kontroller anæstesidybdens dybde ved hjælp af tåkleling, juster isofluranen, hvis det er angivet, og fortsæt med at overvåge vejrtrækningen og tåklede reaktion under hele proceduren. Påfør oftalmisk salve med en Q-tip for at forhindre tørhed i øjnene.
    3. Med pegefingeren skal du skabe lodret tryk på ørestiftens dorsale ansigt for at eksponere og strække det ventrale ansigt.
    4. Udfør to 25 μl i.d. injektioner af BMCMC-opløsning i to forskellige steder i ørestiftens ventrale ansigt, den første injektion i midten af øret og den anden injektion mod spidsen af ørestiften. Vent 4-6 uger efter i.d. engraftment, før du udfører in vivo-eksperimenter.
      Bemærk: Det er vores erfaring, at antallet af MCs/mm2 dermis i den centrale del af ørestiften på det tidspunkt generelt svarer til antallet på det tilsvarende sted i mus af vild type, mens antallet af MCs/mm2 i ørepinnaens periferi typisk er væsentligt lavere end antallet i de tilsvarende mus af vildtypen27,28. Dette bør tages i betragtning, når der udformes forsøg med sådanne MC-engrafted mus(f.eks.bør agenser med mulige virkninger på MC-funktionen injiceres i den centrale del af ørestiften, og analysen af virkningerne af sådanne behandlinger bør også fokusere på dette område).
  2. Peritoneal hulrum engraftment ved intraperitoneal (i.p.) injektion.
    BEMÆRK: Adoptivoverførsel af BMCMC'er til peritonealhulen hos MC-mangelfulde mus vil kræve en injektion på 2 x 106 celler pr. Mus. Sådanne i.p. injektioner af BMCMCs i MC-mangelfulde mus er blevet brugt af mange grupper til at studere rollerne af peritoneale MC'er i forskellige modeller, herunder modeller af værtsforsvar mod giftstoffer31 eller bakteriel sepsis32,33.
    1. Det relevante antal celler tælles og genbruges ved 1 x 107 BMCMC'er/ml (2 x 106 BMCMC'er/200 μl) i koldt DMEM. BMCMCs-opløsning overføres til en 1 ml sprøjte, der er udstyret med en 25 G nål. Hold på is indtil injektion.
    2. Udfør 1 injektion af 200 μl BMCMCs opløsning i peritoneal hulrummet på 4-6 uger gamle MC-mangelfulde mus. Vent 4-6 uger efter i.p. engraftment, før du udfører in vivo eksperimenter.
  3. Engraftment ved intravenøs (i.v.) injektion.
    BEMÆRK: Adoptivoverførsel af BMCMC'er ved i.v. injektion i MC-mangelfulde mus vil kræve en injektion på 5 x 106 celler pr. Mus. Intravenøs (i.v.) injektioner af BMCMCs i MC-mangelfulde mus er blevet brugt af mange grupper til at studere rollerNE af MC'er i forskellige sygdomsmodeller, herunder modeller af blæreinfektion34, astma35, lungefibrose36, og antistof-medieret arthritis37.
    1. Der tælles et passende antal celler, og der forbruges et passende antal celler ved 2,5 x10 7 BMCMC'er/ml (5 x 106 BMCMC'er/200 μl) i koldt DMEM. BMCMCs-opløsning overføres til en 1 ml sprøjte, der er udstyret med en 30 G-nål. Hold på is indtil injektion.
    2. Bedøve 4-6 uger gamle MC-mangelfuld mus ved hjælp af isofluran (2,5% v / v). Kontroller anæstesidybdens dybde ved hjælp af tåkleling, juster isofluranen, hvis det er angivet, og fortsæt med at overvåge vejrtrækningen og tåklede reaktion under hele proceduren. Påfør oftalmisk salve med en Q-tip for at forhindre tørhed i øjnene.
    3. Udfør en injektion af 200 μl BMCMC-opløsning i haleåren (eller alternativt retro-orbital venen) af en MC-mangelfuld mus. Vent 12 uger efter i.v. engraftment, før du udfører in vivo eksperimenter.

3. Analyse af engraferede mastcelle-mangelfulde mus.

  1. Analyse af øre engraftment.
    1. I slutningen af eksperimentet aflives mus ved CO2-indånding efterfulgt af cervikal dislokation.
    2. Ørestiften isoleres og fastgøres i 10% (vol/vol) buffer formalin natten over ved 4 °C. Der indlejres fast ørepinnae i paraffin, skæres 4 μm sektioner af øre pinnae og monteres på glas dias.
    3. Plette lysbillederne med en 0,1% Toluidine blå opløsning i 1 min ved stuetemperatur. Vask rutsjebaner i ledningsvand i 1 min, derefter lufttørre dias i 10 minutter ved stuetemperatur.
    4. Coverslip dias ved hjælp af montering medium, derefter tælle antallet af engrafted MCs per pinnae sektioner ved hjælp af et let mikroskop. Vurder engraftmenteffektiviteten ved at sammenligne procentdelen og fordelingen af MCs i øreskind hos engrafted mus i forhold til vilde mus.
  2. Peritoneal hulrum engraftment analyse.
    1. Evaluering af mastceller nummer i peritoneal hulrum.
      1. I slutningen af eksperimentet aflives mus ved CO2-indånding efterfulgt af cervikal dislokation. Fjern forsigtigt musens ventrale hud uden at bryde peritonealhulen.
      2. Der injiceres 5 ml kold eller stuetemperatur PBS i peritonealhulen ved hjælp af en 5 ml sprøjte udstyret med en 25 G nål. Brug kold PBS til at reducere risikoen for at aktivere peritoneale celler (dette er meget vigtigt, når du vurderer peritoneal MC degranulation eller niveauer af nogle MC-afledte produkter i peritoneal lavagevæsken). Udfør en massage af maven i 20 sek for at høste peritoneale celler.
      3. Aspirere langsomt peritonealtoileten ved hjælp af en 5 ml sprøjte udstyret med en 22 G nål. Registrer mængden af indsugningstugning (forvent at genvinde op til 80% af det injicerede volumen).
      4. Peritoneal lavagevæske overføres til et 5 ml polystyren rundt bundrør og centrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C. Aspirat supernatant. Pellet'en genvindes i 400 μl kold PBS.
      5. Tæl det samlede antal peritoneale celler ved hjælp af et hæmocytometerkammer. Brug halvdelen af cellesuspensionen til en flowcytometrianalyse (som beskrevet i trin 1.3.1) til at evaluere procentdelen og markørudtrykket af engraferede MCs i peritonealhulen. Multiplicer det samlede antal peritoneale celler med procentdelen af MCs for at opnå absolut antal peritoneale MCs.
      6. Udfør en cytocentrifugering med de resterende celler som beskrevet i trin 1.3.2.2. Lufttørre lysbilleder i 10 minutter ved stuetemperatur og tegne en voks cirkel omkring celler ved hjælp af en PAP pen.
      7. Dæk celler med ufortyndet May-Grünwald Staining opløsning i 5 min, efterfulgt af vask i PBS i 5 min, begge ved stuetemperatur. Dæk celler med Giemsa pletten fortyndet 1:20 med deioniseret vand og inkuber 20 min ved stuetemperatur. Vask rutsjebaner 2 gange i ledningsvand i 1 min. og derefter lufttørre dias.
      8. Coverslip celler ved hjælp af montering medium, og beregne procentdelen af engrafted MCs ved hjælp af et lys mikroskop (ved at tælle mindst 400 samlede celler). Vurder engraftmenteffektiviteten ved at sammenligne procentdelen af MCs i peritoneal lavage af engrafted mus versus vilde type mus.
    2. Evaluering af mastceller i de mesenteriske vinduer.
      1. Efter peritoneal lavage beskrevet i trin 3.2.1, skæres peritonealmembranen op for at udsætte musens tarmkanal. Arranger 4 til 5 mesenteriske vinduer pr. mus på et dias.
      2. Fastgør lysbillederne i 1 time i Carnoy-opløsning (3:2:1 vol/vol/vol ethanol, kloroform og iseddike) ved stuetemperatur. Lufttørre dias og fjern tarmen (de faste mesenteriske vinduer forbliver fastgjort til diasene).
      3. Farv præparaterne i 20 minutter ved stuetemperatur med Csaba (Alcian blue/Safranin O) farvningsopløsning.
        1. For at fremstille 500 ml Csaba-plet fremstilles 500 ml acetatbuffer ved at blande 100 ml 1 M natriumacetatopløsning med 120 ml 1 M HCl. Der fyldes op til 500 ml med deioniseret vand, og pH justeres til 1,42. Derefter opløses 90 mg Safranin [identificerer 'modne MCs' i rødt], 1,8 g Alcian blå [identificerer 'umodne MCs' i blå] og 2,4 g ferric ammoniumsulfat NH4Fe(SO4)2 i 500 ml acetat buffer.
      4. Coverslip dias ved hjælp af montering medium, derefter tælle antallet af engrafted MCs per mesenteric vindue ved hjælp af et let mikroskop. Vurder engraftmenteffektiviteten ved at sammenligne procentdelen og fordelingen af MCs i de mesenteriske vinduer i engrafted mus i forhold til vilde typemus.
  3. I.v. engraftment analyse.
    1. Ved forsøgets afslutning aflives mus ved CO2-indånding efterfulgt af cervikal dislokation og høstvæv af interesse(f.eks. lunge, hud eller milt) og fastgøres natten over i 10% (vol/vol) bufferet formalin ved 4 °C.
    2. Indlejr fast væv i paraffin, skær 4 μm sektioner, og montere på glas dias. Plette lysbillederne med en 0,1% Toluidine blå opløsning i 1 min ved stuetemperatur. Vask rutsjebaner i ledningsvand i 1 minut, og lufttørre dias i 10 minutter.
    3. Coverslip dias ved hjælp af montering medium og evaluere antallet og fordelingen af engrafted MCs per væv sektioner ved hjælp af et let mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En oversigt over metoden 'mastcelle knock-in' er vist i figur 1og omfatter generering af BMCMCs, antallet af celler, der skal indpodes i.p., i.d. eller i.v. i MC-mangelfulde mus (antallet kan varieres, hvis det er angivet på grundlag af forsøgsdesignet) og intervallet mellem engraftment og eksperiment afhængigt af injektionsstedet (dette interval kan også variere, hvis det er angivet; f.eks.øges indholdet af lagrede mæglere i MC cytoplasmiske granulater støt med tiden38). Figur 2 viser repræsentative flowcytometrianalyser og toluidblå farvning af BMCMCs efter 1, 15 og 45 dages kultur i DMEM-medium, der indeholder 20% WEHI-3 cellet betinget medium som kilde til IL-3. Bemærk, at BMCMC'er, der dyrkes i 45 dage, er 95% rene, indeholder et stort antal cytoplasmiske granulater og kan bruges til engraftmentforsøg, mens celler dyrket i 15 dage ikke er egnede til engraftment. Figur 3 viser repræsentativ vellykket engraftment i ørestiften 4 uger efter i.d. engraftment (Figur 3A), i mesenteriske vinduer (figur 3B) og peritoneal hulrum (Figur 3C) 6 uger efter i.p. engraftment og i lungen (Figur 3D) 12 uger efter i.v. engraftment.

Figure 1
Figur 1: 'Mast celle knock-in' mus model til analyser af MCfunktioner in vivo. Vilde eller mutante knoglemarvsbaserede dyrkede MCs (BMCMCs) genereres ved at dyrke knoglemarvsceller i mindst 4-6 uger i 20% WEHI-3 celle-konditioneret medium som en kilde til IL-3 (eller alternativt i medium indeholdende 10 ng/ml rekombinant mus IL-3). Disse BMCMCs kan derefter inddeles i MC-mangelfulde mus for at skabe såkaldte 'mast celle knock-in' mus. BMCMC'er kan injiceres via forskellige ruter (intravenøs [i.v.], intraperitoneal [i.p.] eller intradermal [i.d.]) for lokal (i.d., i.p.) eller systemisk (i.v.) rekonstituering af forskellige MC-populationer. MC-funktion(er) i forskellige biologiske reaktioner kan derefter analyseres ved at sammenligne reaktionerne i mus af vild type, MC-mangelfulde mus og 'mastcelle knock-in' mus. Bidraget(e) fra specifikke MC-produkter kan analyseres ved at sammenligne svarene fra 'mastcelle knock-in' mus, der er indgraveret med enten vilde BMCMC'er af typen BMCMCs eller BMCMC'er fra mus, der mangler eller udtrykker genetisk ændrede former for sådanne produkter. (Dette er en modificeret udgave af figur 1 fra ref.12).

Figure 2
Figur 2: Vurdering af renheden af BMCMC-præparater ved hjælp af flowcytometri og mikroskopi. (A) Repræsentative flowcytometrianalyser af FcεRIα- og KIT-ekspressionen (CD117) på overfladen af 1 dag (venstre panel), 15 dage (mellempanel) og 45 dage (højre panel) gamle BMCMC'er. Propidium iodide (PI)-positive døde celler blev udelukket fra analysen (ikke vist). Tal angiver procentdelen af FcεRIα+KIT+ BMCMCs gated i den blå firkant. (B) Repræsentative billeder af BMCMCs farves med toluidin blå, nederste panel er en forstørrelse af regionerne i det øverste panel defineret i sorte punkterede linjer. Stænger = 10 μm.

Figure 3
Figur 3: Evaluering af effektiviteten af MC-engraftment på forskellige anatomiske steder. (A) Repræsentative billeder af 4 μm øre pinnae sektioner farvet med toluidin blå. (B) Repræsentative billeder af mesenteriske ruder, der er plettet med Safranin/Acian Blue (»Csaba«-pletten). (C) Repræsentative billeder af celler, der er til stede i peritonealt toiletvæsker og farvet med May-Grünwald Giemsa (MGG). (D) Repræsentative billeder af 4 μm lungesektioner, der er farvet med toluidinblå. Stænger = 50 μm (A, B og D) eller 20 μm (C). Billederne er fra C57BL/6 wild type mus (øverste panel), MC-mangelfuld KitW-sh/W-sh mus (midterste panel) og MC-mangelfuld mus indkapslet med vilde type BMCMCs: BMCMCs KitW-sh/W-sh (nederste panel). MCs er angivet med pile.

Mus Tilgængelige baggrunde MC-numre
(stabil tilstand)		 Andre fænotyper (revideret i9,10,13) Rapporterede engraftments med BMCMCs
KitW/W-v (WB/Re x C57BL/6) F1
(Jackson Laboratorier -
WBB6F1/J-KitW/KitW-v/J)		 Fravær af bindevæv og slimhinde-MCS Anæmi, reducerede basofile og neutrofile tal, mangler i melanocytter og interstitielle celler i Cajal, sterile osv. 35,37; 31,62; 28,29; i.c.50,51; i.a.49; fp.i. 63 år
KitW-sh/W-sh C57BL/6
(Jackson Laboratorier -
B6. Cg-KitW-sh/HNihrJaeBsmJ) Enkelt nukleotid polymorfi analyse udført på Jackson laboratorier viser, at disse mus er kun ~ 87% C57BL/6-genetisk baggrund.		 Fravær af bindevæv og slimhinde-MCS Moderat stigning i basofile og neutrofile tal, øget antal myeloid-afledte suppressor celler64, mangler i melanocytter og interstitielle celler i Cajal i.v.23.34-36; 31,62; 28,29; i.a.49
C57BL/6J62
(Jackson Laboratorier -
B6. Cg-KitWsh/ HNihrJaeBsmGlliJ) Disse mus er blevet backcrossed >11 gange på C57BL/6J baggrund.
BALB/c65
(C.B6-KitW-sh)
Mcpt5-Cre;
R-DTA 		C57BL/625
(Tg(Cma1-cre) ARoer; B6.129P2-Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Lky/J)		 Markante reduktioner i peritoneal (98%) og hud (89-96,5%) MCs, slimhinde-MCs usandsynligt, at blive udtømt Sandsynlig tilstedeværelse af slimhinde-MCs; reporter mus afslører Cre-medieret sletning af 'floxed' YFP transgene i ~ 30% milt NK celler66 ingen
Cpa3Cre/+ C57BL/626
(B6.129P2 -Cpa3tm3(icre)Hrr)		 Fravær af bindevæv og slimhinde-MCS Cpa3 udtrykt i andre celletyper; reducerede basofilital i.v.26
BALB/c26
(B6.129P2/OlaHsd.BALB/c-Cpa3tm3(icre)Hrr)
Cpa3-Cre;
Mcl-1fl/fl 		C57BL/624
(Tg(Cpa3-cre)3Glli; B6;129-Mcl1tm3sjkJørgensen)		 Fravær af bindevæv og slimhinde-MCS Cpa3 udtrykt i andre celletyper; øget milt neutrofiler & mild anæmi;
reducerede basofilital		 i.d.24;
i.a.49
i.v. (vores ikke-offentliggjorte data)

Tabel 1: Musstammer med konstituerende MC-mangler. Flere stammer af mus medc-kit-afhængigeellerc-kit-uafhængigekonstituerende MC-mangel er tilgængelige. I princippet kan alle disse stammer bruges til at generere 'mast celle knock-in' mus (selv om, så vidt vi ved, er dette endnu ikke blevet rapporteret for Mcpt5-Cre; R-DTA mus). Men hver af disse stammer har andre fænotypiske abnormiteter og begrænsninger, der bør holdes for øje, når man fortolker resultater opnået med disse mus. Nogle eksempler på vellykket MC engraftment kan findes i referencerne. (Dette er en ændret og ajourført udgave af tabel 1 fra ref.9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Næsten 30 år efter den første beskrivelse38, den 'mast celle knock-in' tilgang fortsætter med at give værdifulde oplysninger om, hvad MCs kan gøre eller ikke kan gøre in vivo. De funktioner, MCs var længe menes at være begrænset til deres rolle i allergi. Data genereret ved hjælp af 'mast celle knock-in' tilgang har ændret denne opfattelse, ved at fremlægge bevis for, at MCs kan blandt andre funktioner, spille kritiske roller i værtsforsvaret mod visse patogener4,39 eller gifter28,31, eller kan endda undertrykke visse immunresponser29,34,40.

I vores protokolbeskrivelse besluttede vi at fokusere på generering og indskrivning af knoglemarvsbaserede dyrkede MCs (BMCMCs), fordi et stort antal af disse celler kan genereres in vitro fra knoglemarven af vild type eller mutant mus. MC'er kan imidlertid også dyrkes direkte fra embryonale stamceller (embryonale stamcellebaserede dyrkede MC'er [ESCMCs])41, og når de er genetisk kompatible, kan disse celler også bruges til engraftment i MC-mangelfulde mus. Denne alternative tilgang er særlig interessant for at studere rollen som et protein, hvis mangel fremkalder embryonal dødelighed hos mus, og derfor kan BMCMCs mangelfuld for dette protein ikke genereres. Både BMCMCs og ESCMCs kan også transduceres in vitro med lentivirus kodning gener af interesse eller shRNA at lukke munden på gener af interesse, før engraftment af disse celler i MC-mangelfuld mus31,33.

Vi bruger normalt 20% WEHI-3-konditioneret medium som en kilde til IL-3 til kulturen i BMCMCs. Der kan dog også anvendes rekombinant IL-3 (10 ng/ml som beskrevet i trin 1.2.1), og tilsætning af rekombinant stamcellefaktor (SCF) til dyrkningsmediet kan i væsentlig grad øge antallet af genererede BMCMC'er42,43. Afhængigt af undersøgelsen er der ud over IL-3 blevet anvendt 10 til 100 ng/ml rekombinant SCF til at generere BMCMC'er36,44,45. Man bør huske på, at kommercielt tilgængelige murine rekombinant SCF præparater fra forskellige leverandører kan variere i deres styrke i at påvirke udviklingen af BMCMCs. Det er også vigtigt at erkende, at detaljer om den fremgangsmåde, der anvendes til at generere BMCMCs (f.eks. om man tilføjer rekombinant SCF til IL-3-holdige medier, kulturperiodens varighed osv.),kan påvirke sådanne cellers fænotype og funktion. For eksempel er det blevet rapporteret, at BMCMCs kronisk udsat for SCF har øget niveauet af histamin og visse proteaser44,46, men viser en markant dæmpning af FcεRI-medieret degranulation og cytokinproduktion in vitro45. Endelig indeholder WEHI-3-konditioneret medium ud over IL-3 mange biologisk aktive molekyler, der kan påvirke MC-funktioner. BMCMC'er opnået med WEHI-3-konditioneret medium vil derfor sandsynligvis afvige fra BMCMC'er opnået med rekombinant IL-3 (eller med rekombinant IL-3 plus SCF). Der har kun været få undersøgelser af, hvorvidt eller hvor længe sådanne forskelle i fænotyperne af BMCM'er, der genereres i forskellige typer dyrkningsmedium, bevares efter cellernes indskrivning på forskellige anatomiske steder in vivo, og yderligere undersøgelser af denne type kan være af interesse. Uanset de valgte kulturforhold bør den samme kulturmediumopskrift dog anvendes til at generere alle de BMCMC'er, der skal anvendes til engraftment i eksperimenter, hvorfra resultaterne samles til analyse. Desuden bør MCS dyrkes i mindst 4 til 6 uger før deres indskrivning i MC-mangelfulde mus for at nå en renhedsgrad på 95-98% (figur 2). Dette er for at reducere muligheden for, at tilstedeværelsen i "BMCMC populationerne" af andre hæmatopoietiske celler end dem, der er forpligtet til mastcellelinjen (som er til stede i kulturerne med tidlige intervaller efter placering af knoglemarvscellerne in vitro) kan resultere i udseende af donor-afledte celler ud over MC'er i 'mastcelle knock-in' mus.

Vi præsenterer her en detaljeret protokol for engrafting MC-mangelfuld mus med vilde type eller mutant BMCMCs intraperitoneally (i.p.), intravenøst (i.v.) eller intradermally (i.d.) i øret pinna, da disse injektionsveje er blevet brugt af mange efterforskere. BMCMCs er dog også blevet indgraveret i baghuden47, i fodpuden48,intra-articularly49 eller intra-cranially50,51. Antallet af BMCMC'er, der skal inddeles, samt intervallet mellem engraftment og eksperiment kan variere afhængigt af injektionsvejen og det målrettede organ, der skal indgraveres (figur 1). Det er meget vigtigt at respektere sådanne intervaller efter engrafting af BMCMCs, før forsøget påbegyndes, for at der er tilstrækkelig tid til, at BMCMCs (som ikke er fuldt modne MCs) kan blive mere modne in vivo. Fordi indholdet af mæglere gemt i MC's cytoplasmiske granulat kan fortsætte med at stige i løbet af cellens levetid38,52, for visse eksperimenter kan man ønske at øge intervallet mellem MC engraftment og indledningen af eksperimentet til at vurdere MC funktion.

Afhængigt af injektionsvejen og/eller antallet af injicerede BMCMC'er kan antallet og/eller den anatomiske fordeling af de adoptivoverdragede MC'er afvige fra tallene for de tilsvarende indfødte MC-populationer i mus af vild type12,23,53,54. MC-mangelfulde mus, der er indpodet i.p. eller i.d. med BMCMC'er, kan have omtrent samme antal og fordeling af MC'er end den oprindelige MC-population i mus af vild type, i peritonealhulen og mesenteriet og i dermis, henholdsvis når de vurderes 4 til 8 uger efter MC-overførsel12,23. Intravenøs overførsel af BMCMC'er fører ikke til normale MC-numre og/eller distribution i de fleste væv. For eksempel findes der ingen eller meget få MCs i huden på sådanne i.v.-engrafted 'mast celle knock-in' mus. 4-28 uger efter indsprøjtningen af BMCMC'er i MC-mangelfulde mus er antallet af MC'er i luftrøret væsentligt lavere end antallet i de tilsvarende mus af vildtypen. I modsætning hertil er antallet af MCs i periferien af lungerne typisk større end i de tilsvarende vilde type mus12,23,53,55. I.v. overførsel af BMCMCs resulterer også i høje niveauer af MCs i milten, mens meget få indfødte MCs typisk findes i dette organ i vilde type mus23,56. Det er vigtigt, at tidligere rapporter viste, at i.v. injektion af BMCMCs i MC-mangelfulde mus ikke resulterer i engraftment af MC-populationerne på specifikke anatomiske steder som rygmarven, lymfeknuder eller hjerte54,57. Flere grupper har også bemærket, at en sådan i.v. engraftment ikke resulterer i engraftment af tarmslimkosale MC (MMC) befolkning23,58-60. Sådanne forskelle i MC-numre og/eller distribution af adoptivoverførte MC'er i forhold til oprindelige MC'er skal tages i betragtning ved fortolkning af data, der er indhentet ved hjælp af MC 'mastcelle knock-in' model9.

Der findes flere stammer af MC-mangelfulde mus, og det er vigtigt at vælge, hvilken eller hvilke der skal bruges i et bestemt projekt. c-kit mutant MC-mangelfuld mus, såsom KitW/W-v eller KitW-sh/W-sh mus, har traditionelt været brugt af mange efterforskere. Sådanne mus lider imidlertidaf mange c- kit-relaterede fænotypiske abnormiteter ved siden af deres dybe MC-mangel (tabel 1). I de senere år er flere stammer af mus med c-kit-uafhængig konstituerende MC-mangel blevet rapporteret24-26. Nogle af disse mus udviser også andre fænotypiske abnormiteter ved siden af deres MC-mangel (tabel 1), og yderligere abnormiteter kan også opdages, da fænotypen af disse nyligt beskrevne stammer stadig undersøges. Alle disse mus og nogle yderligere nye typer AF MC-mangelfulde mus er for nylig blevet gennemgået i detaljer9,10,13.

I betragtning af begrænsningerne i hver af de MC-mangelfulde stammer, der i øjeblikket er tilgængelige, anbefaler vi at forsøge at teste hypoteser om MC-funktion ved hjælp af mere end en model af MC-mangel9. I vores laboratorium udfører vi generelt pilotforsøg i KitW-sh/W-sh og Cpa3-Cre; Mcl-1fl/fl mus. Hvis vi opnår konkordans resultater i begge typer af MC-mangelfuld mus, vi derefter gå videre til engraftment eksperimenter for at fastslå den rolle, MC'er og vurdere de potentielle roller for visse MC-afledte produkter. Endelig skal det bemærkes, at flere stammer, der muliggør en inducerbar udtømning af MCs eller Cre recombinase-medieret sletning af "floxed" gener i MCs er også for nylig blevet beskrevet25,49,61. Disse stammer er blevet gennemgået i detaljer andre steder9,10,13 og repræsenterer lovende alternative - eller komplementære - tilgange til at studere MC-funktioner in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

N.G. modtager stipendier fra den franske "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" og Philipp Foundation; R.S. støttes af Lucile Packard Foundation for Children's Health og Stanford NIH/NCRR CTSA award number UL1 RR025744; PS støttes af et Max Kade Fellowship fra Max Kade Foundation og det østrigske videnskabsakademi og et Schroedinger Fellowship fra den østrigske videnskabsfond (FWF): J3399-B21; SJ G. anerkender støtte fra National Institutes of Health tilskud U19 AI104209, NS 080062 og fra Tobaksrelaterede Sygdomme Research Program ved University of California; L.L.R. anerkender støtte fra Arthritis National Research Foundation (ANRF) og National Institutes of Health grant K99AI110645.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25 G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30 G x 1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1% Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as 'tunable' effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models - Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. 'Sash' mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

Tags

Immunologi og infektion ,c-kit stamcellefaktor FcεRI immunoglobulin E musemodel adoptivoverførsel immunologi allergi
Analyse af mastcellernes funktioner <em>i Vivo</em> Ved hjælp af '<em>Mast Cell Knock-in</em>' Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, … More

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter