Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

'मस्त सेलनॉक-इन'चूहों का उपयोग कर वीवो में मस्त कोशिकाओं के कार्यों का विश्लेषण

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52753
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

Summary

हम इन विट्रो व्युत्पन्न मास्ट कोशिकाओं की पीढ़ी के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं, मस्तूल कोशिकाओं की कमी वाले चूहों में उनका engraftment, और विभिन्न शारीरिक साइटों पर एनग्रेंफ्ट मस्तूल कोशिकाओं के फेनोटाइप, संख्या और वितरण का विश्लेषण। इस प्रोटोकॉल का उपयोग वीवो में मस्त कोशिकाओं के कार्यों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

मस्त कोशिकाएं (एमसी) हेमेटोपोइटिक कोशिकाएं हैं जो विभिन्न ऊतकों में रहती हैं, और बाहरी वातावरण के संपर्क में आने वाली साइटों पर विशेष रूप से प्रचुर मात्रा में होती हैं, जैसे त्वचा, वायुमार्ग और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट। सबसे अच्छा IgE में अपनी हानिकारक भूमिका के लिए जाना जाता है पर निर्भर एलर्जी प्रतिक्रियाओं, एमसी भी विष और बैक्टीरिया और परजीवी पर हमला करने के खिलाफ मेजबान रक्षा में महत्वपूर्ण खिलाड़ियों के रूप में उभरा है । एमसी फेनोटाइप और फ़ंक्शन को माइक्रोएनवायरमेंटल कारकों से प्रभावित किया जा सकता है जो शारीरिक स्थान के अनुसार भिन्न हो सकते हैं और/या प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के विकास के प्रकार या चरण के आधार पर । इस कारण से, हम और अन्य लोगों ने एमसी कार्यों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए इन विट्रो तरीकों पर वीवो दृष्टिकोण में पक्षपात किया है। यहां, हम माउस बोन मैरो-व्युत्पन्न सुसंस्कृत एमसी (बीएमसीएमसी) की पीढ़ी के लिए तरीकों का वर्णन करते हैं, आनुवंशिक रूप से एमसी की कमी वाले चूहों में उनके दत्तक हस्तांतरण, और विभिन्न शारीरिक स्थलों पर दत्तक रूप से स्थानांतरित एमसी की संख्या और वितरण का विश्लेषण। 'मास्ट सेलनॉक-इन' दृष्टिकोण नाम के इस विधि का उपयोग पिछले 30 वर्षों में वीवो मेंएमसी और एमसी-व्युत्पन्न उत्पादों के कार्यों का आकलन करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। हम हाल के वर्षों में विकसित किए गए वैकल्पिक दृष्टिकोणों के आलोक में इस विधि के फायदों और सीमाओं पर चर्चा करते हैं ।

Introduction

मस्त कोशिकाएं (एमसी) हेमेटोपोइटिक कोशिकाएं हैं जो1-3प्लूइपोटेंट बोन मैरो प्रोजेनिटर से उत्पन्न होती हैं। बोन मैरो एग्रेशन के बाद, एमसी जनक विभिन्न ऊतकों में स्थानांतरित हो जाते हैं जहां वे स्थानीय विकास कारकों1-3के प्रभाव में परिपक्व एमसी में विकसित होते हैं। ऊतक-निवासी एमसी रणनीतिक रूप से मेजबान-पर्यावरण इंटरफेस पर स्थित हैं, जैसे त्वचा, वायुमार्ग और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट, जहां वे बाहरी अपमान3-6के खिलाफ रक्षा की पहली पंक्ति के रूप में व्यवहार करते हैं। एमसी अक्सर उनकी "बेसलाइन" फेनोटाइपिक विशेषताओं और उनके शारीरिक स्थानों के आधार पर उप-वर्गीकृत होते हैं। चूहों में, दो प्रकार के एमसी का वर्णन किया गया है: "कनेक्टिव टिश्यू-टाइप" एमसी (सीटीएमसी) और म्यूकोसल एमसी (एमएमएस)1-3,7,8। CTMCs अक्सर वेणुओं के आसपास और तंत्रिका फाइबर के पास स्थित होते हैं, और सेरोसल गुहाओं में रहते हैं, जबकि एमएमएस आंत और श्वसन म्यूकोसा1-3में इंट्रापिटेलियल स्थानों पर कब्जा करते हैं।

एमसी9-13के जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए कई तरीके लागू किए गए हैं। कई समूहों ने सेल लाइनों (जैसे मानव एमसी लाइनों HMC1 14 या LAD215,16), इन विट्रो व्युत्पन्न एमसी (जैसे मानव परिधीय रक्त-व्युत्पन्न एमसी17,या माउस बोन मैरो) का उपयोगकरके इन विट्रो दृष्टिकोणों पर ध्यान केंद्रित किया है -व्युत्पन्न संस्कारी एमसी [बीएमसीएमसी]18,भ्रूण त्वचा से व्युत्पन्न सुसंस्कृत एमसी [एफएससीसी]19 और पेरिटोनियल सेल-व्युत्पन्न एमसी [पीसीसी]20)या पूर्व वीवो अलग एमसी विभिन्न शारीरिक स्थलों से । इन सभी मॉडलों का व्यापक रूप से एमसी जीव विज्ञान के आणविक विवरणों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है, जैसे एमसी सक्रियण में शामिल सिग्नलिंग रास्ते। हालांकि, एमसी जीव विज्ञान का एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि उनकी फेनोटाइपिक और कार्यात्मक विशेषताएं(जैसे,साइटोप्लाज्मिक ग्रेन्यूल प्रोटीज सामग्री या विभिन्न उत्तेजनाओं की प्रतिक्रिया) को शारीरिक स्थान और माइक्रोएनवायरमेंट2,7द्वारा संग्राहक किया जा सकता है। चूंकि वीवो में सामने आने वाले ऐसे कारकों का सटीक मिश्रण विट्रो मेंपुन: उत्पन्न करना मुश्किल हो सकता है , इसलिए हम एमसी कार्यों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए वीवो दृष्टिकोणों में उपयोग करने के पक्ष में हैं9.

आनुवंशिक एम सी की कमी के साथ कई माउस उपभेदों मौजूद हैं, जैसे व्यापक रूप से इस्तेमाल WBB6F1-किट W/W-v या C57BL/6-किट डब्ल्यू-श/डब्ल्यू-एसएच चूहों । इन चूहों में अभिव्यक्ति और/या किट (CD117), मुख्य एमसी विकास कारक स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ)२१,२२के लिए रिसेप्टर की गतिविधि की कमी है । नतीजतन, इन चूहों में एक गहरा एमसी की कमी है, लेकिन उनकेसी-किट म्यूटेशन (WBB6F1-किट डब्ल्यू/डब्ल्यू-वी चूहों में) या बड़े क्रोमोसोमल इनवर्स के प्रभाव के लिए जो कमसी-किट अभिव्यक्ति (C57BL/6-किट डब्ल्यू-एसएच/डब्ल्यू-एसएच चूहों)9,10,12,23 सेसंबंधित अतिरिक्त फेनोटाइपिक असामान्यताएं हैं । हाल ही में,सी-किट-स्वतंत्रसंविलियन एमसी की कमी वाले चूहों के कई उपभेदों की सूचना24-26दी गई है । इन सभी चूहों और कुछ अतिरिक्त नए प्रकार के अकांक्षित एमसी की कमी वाले चूहों की हाल ही में विस्तार से9,10,13समीक्षा की गई है।

यहां, हम माउस बोन मैरो-व्युत्पन्न सुसंस्कृत एमसी (बीएमसीएमसी) की पीढ़ी के लिए तरीकों का वर्णन करते हैं, एमसी की कमी वाले चूहों में उनका दत्तक हस्तांतरण, और विभिन्न शारीरिक स्थलों पर दत्तक रूप से स्थानांतरित एमसी की संख्या और वितरण का विश्लेषण। इस तथाकथित 'मस्त सेल नॉक-इन' विधि का उपयोग वीवो में एमसी और एमसी-व्युत्पन्न उत्पादों के कार्यों का आकलन करने के लिए किया जा सकताहै। हम हाल के वर्षों में विकसित किए गए वैकल्पिक दृष्टिकोणों के आलोक में इस विधि के फायदों और सीमाओं पर चर्चा करते हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी पशु देखभाल और प्रयोग राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के दिशा निर्देशों के अनुपालन में और स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के विशिष्ट अनुमोदन के साथ आयोजित किए गए थे ।

1. बोन मैरो-व्युत्पन्न सुसंस्कृत मस्त कोशिकाओं (बीएमसीएमसी) की पीढ़ी और लक्षण वर्णन।

नोट: दाता BMCMCs प्राप्तकर्ता एमसी की कमी चूहों के रूप में एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि के अस्थि मज्जा कोशिकाओं से उत्पन्न किया जाना चाहिए । पुरुष-व्युत्पन्न दाता बीएमसीएमसी मादा चूहों के engraftment के लिए उपयुक्त नहीं हैं। महिला-व्युत्पन्न दाता बीएमसीएमसी पुरुष और महिला दोनों प्राप्तकर्ताओं में सफलतापूर्वक शामिल होगा।

  1. बोन मैरो एक्सट्रैक निष्कर्षण।
    1. बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (PBS) 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में डालो (माउस प्रति 1 अच्छी तरह से) और बर्फ पर जगह है ।
    2. विच्छेदन उपकरणों को नसबंदी के लिए 70% इथेनॉल में भिगो दें।
    3. कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2)साँस लेना द्वारा दाता चूहों को इच्छामृत्यु दें इसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था, फिर हेरफेर की साइटों पर 70% इथेनॉल के साथ चूहों को स्प्रे करें।
    4. किसी भी हड्डी epiphyses काटने के बिना फीमर, टिबिया और fibula हड्डियों को निकालने के लिए बाँझ विच्छेदन उपकरणों का प्रयोग करें।
    5. एक संदंश के साथ हड्डियों को सुरक्षित करते समय, बाँझ कैंची (या स्केलपेल ब्लेड) का उपयोग करके हड्डियों (और त्यागें फिबुला) से सभी ऊतकों को कुरेदना। सभी हड्डियों को एकत्र किए जाने तक बर्फ पर पीबीएस में हड्डियों को रखें।
    6. बाँझ ऊतक संस्कृति हुड में सभी शेष कदम ों को पूरा करें। बाँझ उपकरणों का उपयोग करना, संदंश के साथ हड्डियों को सुरक्षित करें और मेडुलरी गुहा को बेनकाब करने के लिए दोनों एपिफिसिस काट दें।
    7. 3 मिलीलीटर सीरिंज और 30 जी सुइयों का उपयोग करना, और ठंडा फ्लशिंग माध्यम (Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम [DMEM] 10% भ्रूण बछड़ा सीरम [एफसीएस, गर्मी निष्क्रिय], 2 m L-ग्लूटामाइन, 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान, 50μM AS-mercapto के साथ पूरक पेट्री डिश में लाल अस्थि मज्जा।
    8. बार-बार कोमल आकांक्षा और रिजेक्शन द्वारा फ्लश बोन मैरो सेल क्लस्टर को अलग करने के लिए एक ही सिरिंज का उपयोग करें।
    9. पूल फेमोरल और टिबियल बोन मैरो प्रत्येक माउस से एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर बोन मैरो कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र धोने के लिए ठंडे फ्लशिंग माध्यम से ट्यूब भरें।
  2. बीएमसीएमसी संस्कृति।
    1. 10 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम में सुपरनेट निकालें और पेलेट बोन मैरो कोशिकाओं को ठीक करें (डीएमईएम 10% भ्रूण बछड़े सीरम के साथ पूरक [एफसीएस, हीट-इनएक्टिवेटेड], 2 एमएमएम एल-ग्लूटामाइन, 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान, 50 माइक्रोन एम-मर्केप्टोथेनॉल और 20% वीएचआई-3 सेल-वातानुकूलित माध्यम [आईएल-3 के स्रोत के रूप में; वैकल्पिक रूप से 10 एनजी/एमएल पर पुनर्संयोजन माउस आईएल-3 का उपयोग करें]) ।
    2. उचित आकार के ऊतक संस्कृति फ्लास्क में कोशिकाओं को रखें(उदाहरण केलिए, 1 माउस के लिए टी-25, 2 चूहों के लिए T75, आदि)।
    3. चढ़ाना कोशिकाओं के बाद 1-2 दिन, मध्यम और निलंबन कोशिकाओं हस्तांतरण (मलबे और अनुयायी कोशिकाओं को छोड़ने के फ्लास्क के नीचे से चिपके हुए) एक नया फ्लास्क करने के लिए और ताजा संस्कृति माध्यम (10 मिलीलीटर/माउस) जोड़ें ।
    4. निम्नलिखित सप्ताहों के दौरान, हर 3-4 दिनों में कोशिकाओं को खिलाएं (प्रति माउस 10 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम जोड़ें)। 2.5 x 105 -1x 106 कोशिकाओं/मिलीलीटर के बीच सेल घनत्व बनाए रखें। गैर-अनुयायी कोशिकाओं को सप्ताह में एक बार एक नए फ्लास्क में स्थानांतरित करें जब तक कि संस्कृति फ्लास्क में कोई अनुयायी कोशिकाएं मौजूद न हों। कोशिकाओं की परिपक्वता का परीक्षण करें (नीचे देखें) इन विट्रो परख या एमसी की कमी वाले चूहों में एनग्रेफ्टमेंट के लिए उपयोग करने से पहले।
      नोट: बीएमसीएमसी के पूर्ण भेदभाव में 4-6 सप्ताह लगेंगे।
  3. बीएमसीएमसी परिपक्वता का आकलन।
    1. प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करना।
      1. 5 एमएल पॉलीस्टीरिन राउंड बॉटम ट्यूब में आइस-कोल्ड एफएएफएस बफर (पीबीएस, 0.5% एफसीएस) के साथ वॉश सेल्स (5 x 104-5 x 10 5 सेल/कंडीशन) को धोएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। एस्पिरेट सुपरनेट।
      2. तनु विरोधी माउस CD16/32 (क्लोन ९३ या 2.4G2) मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 1:200 (२.५ μg/ml) FACS बफर में । प्रत्येक गोली में 10 माइक्रोन जोड़ें और संक्षिप्त भंवर द्वारा पुनर्स्थानात्मक। एफसी बाइंडिंग को ब्लॉक करने के लिए बर्फ पर 5 मिनट इनक्यूबेट करें।
        नोट: शेष सभी चरणों के लिए सीधे प्रकाश से नमूनों की रक्षा करें।
      3. तनु फिकोरीथ्रिन (पीई) ने एंटी-माउस एफसी εRI α (क्लोन मार्च-1) 1:200 (1 माइक्रोग्राम/एमएल) और फ्लोरोसीन आइसोथियोसायनेट (फिटसी) संयुग्मित एंटी-माउस किट (सीडी 117; क्लोन 2B8) 1:200 (2.5 μg/ml) ("धुंधला समाधान"), या संबंधित लेबल आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी FACS बफर में ("आइसोटाइप नियंत्रण समाधान") ।
      4. एक अतिरिक्त पॉलीस्टीरिन राउंड बॉटम ट्यूब में चरण 1.3.1.2 से अवरुद्ध कोशिकाओं के आधे को विभाजित करें और एक ट्यूब में "धुंधला समाधान" के 20 माइक्रोन जोड़ें और दूसरी ट्यूब में "आइसोटाइप नियंत्रण समाधान" के 20 माइक्रोन जोड़ें। बर्फ पर 30 मिनट इनक्यूबेट।
      5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x g पर 3 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे FACS बफर और सेंट्रलाइज जोड़ें। सुपरनेटेंट को त्यागें और 300 माइक्रोन FACS बफर में गोली को फिर से ढंकें जिसमें 1 माइक्रोग्राम/एमएल प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई, मृत कोशिकाओं की पहचान के लिए) होता है। साइटोमेट्री विश्लेषण प्रवाह के लिए आगे बढ़ें (चित्रा 2Aदेखें)।
    2. टोलुइडीन ब्लू स्टेनिंग का उपयोग करना।
      1. 1 x 105 कोशिकाओं को एक बार पीबीएस के साथ कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र द्वारा धोएं, फिर पीबीएस के 200 माइक्रोन में कोशिकाओं को एस्पिरेट और रीसंपेंड करें।
      2. कोशिका निलंबन को माइक्रोस्कोप स्लाइड से जुड़े एक तैयार साइटोफुननेल में स्थानांतरित करें और साइटोसेंट्रफ्यूज (5 मिनट के लिए 40 x ग्राम) का उपयोग करके साइटो-सेंट्रलाइजेशन के साथ आगे बढ़ें।
      3. 10 मिनट के लिए एयर ड्राई स्लाइड और पीएपी पेन का उपयोग करके कोशिकाओं के चारों ओर एक मोम सर्कल खींचें। कोशिकाओं को कवर करने के लिए 0.1% टोलुइडीन ब्लू समाधान जोड़ें। 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट। 1 मिनट के लिए नल के पानी को चलाने में स्लाइड धोएं, फिर 10 मिनट के लिए हवा-सूखी स्लाइड।
      4. बढ़ते माध्यम का उपयोग कर कोशिकाओं को कवर। प्रकाश माइक्रोस्कोप विश्लेषण के लिए आगे बढ़ें (चित्रा 2Bदेखें)

2. बीएमसीएमसी के साथ मस्त सेल की कमी वाले चूहों का एनबेड़ा।

  1. इंट्राडरमल (यानी) इंजेक्शन द्वारा कान एनग्रेफ्टमेंट।
    नोट: एमसी की कमी वाले चूहों के कान पिनाने में बीएमसीएमसी के दत्तक हस्तांतरण के लिए, हम प्रति कान पिन्ना 1 x 106 कोशिकाओं के दो इंजेक्शन (कुल 2 x 106 कोशिकाओं के लिए) प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं। एमसी की कमी वाले चूहों के कान पिनाने में बीएमसीएमसी के इंट्राडरमल एनग्रेफ्टमेंट का उपयोग कई मॉडलों में कई जांचकर्ताओं द्वारा किया गया है, जिसमें निष्क्रिय क्यूटनेर एनाफिलैक्सिस (पीसीए)24,27के मॉडल, विष के खिलाफ मेजबान रक्षा28,और पुरानी अतिसंवेदनशीलता (सीएचएस) प्रतिक्रियाएं29,30शामिल हैं।
    1. ठंडे डीएमईएम में 4 x 107 बीएमसीएमसी/एमएल (1 x 106 बीएमसीएमसी/25 माइक्रोन) पर गिनती और पुनर्संस्रित कोशिकाएं। 30 जी सुई से लैस 1 मिलीलीटर सिरिंज में बीएमसीएमसी समाधान स्थानांतरित करें। इंजेक्शन तक बर्फ पर रखें।
    2. एनेस्थेटाइज 4-6 सप्ताह पुराने एमसी की कमी चूहों का उपयोग कर आइसोफ्लुन (२.५% v/v) । अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें, यदि संकेत दिया जाता है तो आइसोफ्लाणे को समायोजित करें और प्रक्रिया के दौरान श्वास और अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया की निगरानी जारी रखें। आंखों के सूखापन को रोकने के लिए क्यू-टिप के साथ नेत्र मरहम लगाएं।
    3. इंडेक्स फिंगर के साथ, वेंट्रल चेहरे को बेनकाब करने और खिंचाव करने के लिए कान पिन्ना के पृष्ठीय चेहरे पर ऊर्ध्वाधर दबाव बनाएं।
    4. कान पिन्ना के वेंट्रल फेस के दो अलग-अलग साइटों में बीएमसीएमसी समाधान के दो 25 माइक्रोन 2डी इंजेक्शन, कान के बीच में पहला इंजेक्शन और कान पिन्ना की नोक की ओर दूसरा इंजेक्शन करें। वीवो प्रयोगों में प्रदर्शन करने से पहले 4-6 सप्ताह इंतजार करें।
      नोट: हमारे अनुभव में, उस समय तक कान पिन्ना के मध्य भाग में डर्मिस के एमसी/एमएम2 की संख्या आम तौर पर जंगली प्रकार के चूहों में इसी स्थान के समान होती है, जबकि कान पिनाने की परिधि मेंएमसी/मिमी 2 की संख्या आम तौर पर संबंधित जंगली प्रकार के चूहों27,28की तुलना में काफी कम होती है। इस तरह के एमसी-एनग्रफ्टेड चूहों(उदाहरण के लिए,एमसी फ़ंक्शन पर संभावित प्रभाव वाले एजेंटों को कान पिनाने के मध्य भाग में इंजेक्ट किया जाना चाहिए, और ऐसे उपचारों के प्रभावों का विश्लेषण भी उस क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करना चाहिए)।
  2. इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन द्वारा पेरिटोनियल गुहा एनग्रेफ्टमेंट।
    नोट: एमसी की कमी वाले चूहों के पेरिटोनियल गुहा में बीएमसीएमसी के दत्तक हस्तांतरण के लिए प्रति माउस 2 x 106 कोशिकाओं के एक इंजेक्शन की आवश्यकता होगी। एमसी की कमी वाले चूहों में BMCMCs के ऐसे आईपी इंजेक्शन का उपयोग कई समूहों द्वारा विभिन्न मॉडलों में पेरिटोनियल एमसी की भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए किया गया है, जिसमें विष31 या बैक्टीरियल सेप्सिस32,33के खिलाफ मेजबान रक्षा के मॉडल शामिल हैं।
    1. ठंडे डीएमईएम में 1 x 107 बीएमसीएमसी/एमएल (2 x 106 बीएमसीएमसी/200 माइक्रोल) पर उचित संख्या में कोशिकाओं और पुनर्सुस्ल की गणना करें। 25 जी सुई से लैस 1 मिलीलीटर सिरिंज में बीएमसीएमसी समाधान स्थानांतरित करें। इंजेक्शन तक बर्फ पर रखें।
    2. 4-6 सप्ताह पुराने एमसी की कमी चूहों के पेरिटोनियल गुहा में 200 माइक्रोन बीएमसीएमसी समाधान के 1 इंजेक्शन करें। वीवो प्रयोगों में प्रदर्शन करने से पहले मैंने एनग्रेफ्टमेंट के 4-6 सप्ताह बाद प्रतीक्षा करें।
  3. नसों में (i.v.) इंजेक्शन द्वारा Engraftment।
    नोट: एमसी की कमी चूहों में i.v. इंजेक्शन द्वारा BMCMCs के दत्तक हस्तांतरण माउस प्रति 5 x 106 कोशिकाओं के एक इंजेक्शन की आवश्यकता होगी । एमसी की कमी वाले चूहों में बीएमसीएमसी के नसों में (i.v.) इंजेक्शन का उपयोग कई समूहों द्वारा मूत्राशय संक्रमण34, अस्थमा 35,फेफड़ों के फाइब्रोसिस 36 और एंटीबॉडी-मध्यस्थता गठिया37के मॉडल सहित विभिन्न रोग मॉडलों में एमसी की भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए किया गया है।
    1. ठंडे डीएमईएम में 2.5 x 107 बीएमसीएमसी/एमएल (5 x 106 बीएमसीएमसी/200 माइक्रोन) पर कोशिकाओं और पुनर्सुस्ल की उचित संख्या की गणना करें। 30 जी सुई से लैस 1 मिलीलीटर सिरिंज में बीएमसीएमसी समाधान स्थानांतरित करें। इंजेक्शन तक बर्फ पर रखें।
    2. एनेस्थेटाइज 4-6 सप्ताह पुराने एमसी की कमी चूहों का उपयोग कर आइसोफ्लुन (२.५% v/v) । अंगुली चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की जांच करें, यदि संकेत दिया जाता है तो आइसोफ्लाणे को समायोजित करें और प्रक्रिया के दौरान श्वास और अंगुली चुटकी प्रतिक्रिया की निगरानी जारी रखें। आंखों के सूखापन को रोकने के लिए क्यू-टिप के साथ नेत्र मरहम लगाएं।
    3. एमसी-कमी वाले माउस की पूंछ नस (या वैकल्पिक रूप से, रेट्रो-ऑर्बिटल नस) में बीएमसीएमसी समाधान के 200 माइक्रोन का एक इंजेक्शन करें। वीवो प्रयोगों में प्रदर्शन करने से पहले i.v. engraftment के 12 सप्ताह बाद प्रतीक्षा करें।

3. Engrafted मस्तूल सेल की कमी चूहों का विश्लेषण।

  1. कान एनग्रेफ्टमेंट विश्लेषण।
    1. प्रयोग के अंत में, सीओ 2 साँस लेना द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु दें औरइसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था हो।
    2. कान पिनाने को अलग करें और 10% (vol/vol) में फिक्स करें, रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर फॉर्मेलिन बफर करें। पैराफिन में फिक्स्ड इयर पिनाने को एम्बेड करें, कान पिनाने के 4 माइक्रोन सेक्शन को काटें और ग्लास स्लाइड पर माउंट करें।
    3. कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 0.1% Toluidine नीले समाधान के साथ स्लाइड दाग। 1 मिनट के लिए नल के पानी में स्लाइड धोएं, फिर कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए हवा-सूखी स्लाइड।
    4. बढ़ते माध्यम का उपयोग करके कवर्लिप स्लाइड, फिर हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रति पिनाई वर्गों में संलग्न एमसी की संख्या गिनें। एंग्रीफ्ट चूहों बनाम जंगली प्रकार के चूहों के कान की त्वचा में एमसी के प्रतिशत और वितरण की तुलना करके एनग्रेफ्टमेंट दक्षता का मूल्यांकन करें।
  2. पेरिटोनियल गुहा एनग्रफ्टमेंट विश्लेषण।
    1. पेरिटोनियल गुहा में मस्तूल कोशिकाओं की संख्या का मूल्यांकन।
      1. प्रयोग के अंत में, सीओ 2 साँस लेना द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु दें औरइसके बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था हो। पेरिटोनियल गुहा को तोड़े बिना चूहों की वेंट्रल त्वचा को ध्यान से हटा दें।
      2. 25 जी सुई से लैस 5 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके पेरिटोनियल गुहा में 5 मिलीलीटर ठंडा या कमरे का तापमान पीबीएस इंजेक्ट करें। पेरिटोनियल कोशिकाओं को सक्रिय करने के जोखिम को कम करने के लिए ठंडे पीबीएस का उपयोग करें (पेरिटोनियल एमसी डीग्रेनुलेशन या पेरिटोनियल लावेज तरल पदार्थ में कुछ एमसी-व्युत्पन्न उत्पादों के स्तर का मूल्यांकन करते समय यह बहुत महत्वपूर्ण है)। पेरिटोनियल कोशिकाओं को फसल करने के लिए 20 सेकंड के लिए पेट की मालिश करें।
      3. धीरे-धीरे 22 जी सुई से लैस 5 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करके पेरिटोनियल लावगे को एस्पिरेट करें। एस्पिरेटेड लावेज की मात्रा रिकॉर्ड करें (इंजेक्शन मात्रा के 80% तक ठीक होने की उम्मीद करें)।
      4. पेरिटोनियल लावेज तरल पदार्थ को 5 मिली पॉलीस्टीरिन राउंड बॉटम ट्यूब में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें। एस्पिरेट सुपरनेट। 400 माइक्रोन ठंड पीबीएस में गोली ठीक करें।
      5. हीमोसाइटोमीटर कक्ष का उपयोग करके पेरिटोनियल कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करें। पेरिटोनियल गुहा में संलग्न एमसी के प्रतिशत और मार्कर अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण (जैसा कि चरण 1.3.1 में वर्णित) के लिए सेल निलंबन के आधे का उपयोग करें। पेरिटोनियल एमसी की पूर्ण संख्या प्राप्त करने के लिए एमसी के प्रतिशत से पेरिटोनियल कोशिकाओं की कुल संख्या गुणा करें।
      6. चरण 1.3.2.2 में वर्णित शेष कोशिकाओं के साथ एक साइटोसेंट्रफ्यूगेशन करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए हवा सूखी स्लाइड और एक पीएपी कलम का उपयोग कर कोशिकाओं के चारों ओर एक मोम सर्कल आकर्षित ।
      7. 5 मिनट के लिए बिना पतला मई-ग्रुनवाल्ड स्टेनिंग समाधान के साथ कवर कोशिकाओं, 5 मिनट के लिए PBS में धोने के बाद, दोनों कमरे के तापमान पर । गिमसा दाग के साथ कवर कोशिकाओं को 1:20 डिओनाइज्ड पानी के साथ पतला और कमरे के तापमान पर 20 मिनट इनक्यूबेट । 1 मिनट के लिए नल के पानी में 2 बार स्लाइड धोएं, फिर हवा-सूखी स्लाइड।
      8. बढ़ते माध्यम का उपयोग करके कवर्लिप कोशिकाएं, और हल्के माइक्रोस्कोप (कम से कम 400 कुल कोशिकाओं की गणना करके) का उपयोग करके संलग्न एमसी के प्रतिशत की गणना करें। एनग्रेंफ्ट चूहों बनाम जंगली प्रकार के चूहों के पेरिटोनियल लाव्ज में एमसी के प्रतिशत की तुलना करके एनग्रेफ्टमेंट दक्षता का मूल्यांकन करें।
    2. मेसेंटेरिक खिड़कियों में मस्त कोशिकाओं का मूल्यांकन।
      1. चरण 3.2.1 में वर्णित पेरिटोनियल लावगे के बाद, चूहों के आंतों के पथ को उजागर करने के लिए पेरिटोनियल झिल्ली को खोलें। एक स्लाइड पर माउस प्रति 4 से 5 मेसेंटेरिक खिड़कियों की व्यवस्था करें।
      2. कमरे के तापमान पर कार्नॉय समाधान (3:2:1 vol/vol/vol ofethanol, क्लोरोफॉर्म, और हिमनदों एसिटिक एसिड) में 1 घंटे के लिए स्लाइड्स को ठीक करें । एयर-ड्राई स्लाइड्स और आंत को हटाएं (फिक्स्ड मेसेंटेरिक खिड़कियां स्लाइड्स से जुड़ी रहेंगी)।
      3. Csaba (Alcian ब्लू/Safranin O) धुंधला समाधान के साथ कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए तैयारी दाग ।
        1. 500 मिलीलीटर सीसाबा दाग बनाने के लिए 1 एम एचसीएल के 120 मिली लीटर के साथ 100 मिलीलीटर सोडियम एसीटेट घोल मिलाकर 500 मिलीलीटर एसीटेट बफर तैयार करें। 500 मिलीलीटर तक को डिओनाइज्ड पानी से बनाएं और पीएच को 1.42 में एडजस्ट करें। फिर, 90 मिलीग्राम सैफरानिन को भंग करें [लाल रंग में 'परिपक्व एमसी' की पहचान करता है], 1.8 ग्राम एल्सियन ब्लू [नीले रंग में 'अपरिपक्व एमसी' की पहचान करता है] और 2.4 ग्राम फेरिक अमोनियम सल्फेट एनएच4एफई (एसओ4)2 में 500 मिलीलीटर एसीटेट बफर।
      4. बढ़ते माध्यम का उपयोग करके कवरलिप स्लाइड, फिर हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रति मेसेन्टेरिक विंडो एनग्रेंफ्टेड एमसी की संख्या गिनें। engrafted चूहों बनाम जंगली प्रकार चूहों की mesenteric खिड़कियों में एमसी के प्रतिशत और वितरण की तुलना करके engraftment दक्षता का मूल्यांकन करें।
  3. I.v. engraftment विश्लेषण।
    1. प्रयोग के अंत में, सीओ 2 साँस लेना द्वारा चूहों इच्छामृत्यु के बादगर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था, और ब्याज की फसल ऊतक(जैसे फेफड़े, त्वचा या तिल्ली) और 10% (vol/vol) में रात भर ठीक 4 डिग्री सेल्सियस पर फॉर्मेलिन बफर ।
    2. पैराफिन में फिक्स्ड ऊतकों को एम्बेड करें, 4 माइक्रोन सेक्शन काटें, और ग्लास स्लाइड पर माउंट करें। कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 0.1% Toluidine नीले समाधान के साथ स्लाइड दाग। 1 मिनट के लिए नल के पानी में स्लाइड धोएं, फिर 10 मिनट के लिए हवा-सूखी स्लाइड।
    3. बढ़ते माध्यम का उपयोग करके कवर्लिप स्लाइड और प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रति ऊतक अनुभागों में एनग्रेंफ्ट किए गए एमसी की संख्या और वितरण का मूल्यांकन करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

'मास्ट सेलनॉक-इन'दृष्टिकोण का अवलोकन चित्र 1में दिखाया गया है, और इसमें बीएमसीएमसी की पीढ़ी शामिल है, एमसी-कमी वाले चूहों में आईपी, आईसीडी या यानी को शामिल किया जाना चाहिए (यदि प्रायोगिक डिजाइन के आधार पर संकेत दिया जाता है तो संख्या भिन्न हो सकती है) और इंजेक्शन साइट के आधार पर एनग्रेफ्टमेंट और प्रयोग के बीच अंतराल (यह अंतराल भी भिन्न हो सकता है; उदाहरण के लिए,एमसी साइटोप्लाज्मिक कणिकाओं में संग्रहीत मध्यस्थों की सामग्री समय38के साथ तेजी से बढ़ जाती है) । चित्रा 2 डीएमईएम माध्यम में 1, 15 और 45 दिनों की संस्कृति के बाद बीएमसीएमसी के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण और टोलुइडीन ब्लू धुंधला दिखाता है जिसमें आईएल-3 के स्रोत के रूप में 20% WEHI-3 सेल-वातानुकूलित माध्यम शामिल है। ध्यान दें कि 45 दिनों के लिए सुसंस्कृत बीएमसीएमसी 95% शुद्ध हैं, इसमें साइटोप्लाज्मिक कणिकाओं की उच्च संख्या होती है और इसका उपयोग एनग्रफ्टमेंट प्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जबकि 15 दिनों के लिए सुसंस्कृत कोशिकाएं एनग्रफ्टमेंट के लिए उपयुक्त नहीं हैं। चित्रा 3 कान pinnae में प्रतिनिधि सफल engraftment से पता चलता है 4 सप्ताह के बाद i.d. engraftment(चित्रा 3A),mesenteric खिड़कियों में(चित्रा 3B)और पेरिटोनियल गुहा(चित्रा 3C)6 सप्ताह के बाद i.p. engraftment, और फेफड़ों में(चित्रा 3 डी)12 सप्ताह के बाद i.v. engraftment ।

Figure 1
चित्रा 1: वीवोमेंएमसी कार्यों के विश्लेषण के लिए 'मस्त सेल नॉक-इन'माउस मॉडल। जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न सुसंस्कृत एमसी (BMCMCs) आईएल-3 के स्रोत के रूप में 20% WEHI-3 सेल-वातानुकूलित माध्यम में कम से कम 4-6 सप्ताह के लिए अस्थि मज्जा कोशिकाओं को बनाने से उत्पन्न होते हैं (या वैकल्पिक रूप से मध्यम में 10 एनजी/एमएल रिकॉम्बिनेंट माउस आईएल-3) होते हैं। इसके बाद इन बीएमसीएमसी को एमसी की कमी वाले चूहों में उलझाकर तथाकथित'मास्ट सेल नॉक-इन'चूहों को बनाया जा सकता है। बीएमसीएमसी को विभिन्न मार्गों (नसों में [i.v.], इंट्रापेरिटोनियल [i.p.] या इंट्राडरमल [i.d.]) के माध्यम से स्थानीय (यानी, यानी) या विभिन्न एमसी आबादी के प्रणालीगत (i.v.) पुनर्गठन के माध्यम से इंजेक्ट किया जा सकता है। इसके बाद विभिन्न जैविक प्रतिक्रियाओं में एमसी फंक्शन (एस) का विश्लेषण जंगली प्रकार के चूहों, एमसी की कमी वाले चूहों और'मस्त सेल नॉक-इन'चूहों में प्रतिक्रियाओं की तुलना करके किया जा सकता है। विशिष्ट एमसी उत्पादों के योगदान का विश्लेषण चूहों से प्राप्त जंगली प्रकार के बीएमसीएमसी या बीएमसीएमसी के साथ संलग्न'मास्ट सेल नॉक-इन'चूहों की प्रतिक्रियाओं की तुलना करके किया जा सकता है, जो ऐसे उत्पादों की कमी या आनुवंशिक रूप से परिवर्तित रूपों को व्यक्त करते हैं। (यह रेफरी 12 से चित्रा1का एक संशोधित संस्करण है) ।

Figure 2
चित्र 2: प्रवाह साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी द्वारा बीएमसीएमसी तैयारी की शुद्धता का मूल्यांकन। (A)1 दिन (लेफ्ट पैनल), 15 दिन (मिडिल पैनल) और 45 दिन (राइट पैनल) पुराने बीएमसीएमसी की सतह पर एफसीεआरIα और किट (सीडी117) अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण। प्रोपिडियम आयोडाइड (पीआई) - सकारात्मक मृत कोशिकाओं को विश्लेषण से बाहर रखा गया था (नहीं दिखाया गया)। संख्या नीले वर्ग में गेटेड FcεRIα+KIT+ BMCMCs के प्रतिशत को इंगित करती है। (ख)टोलुइडीन ब्लू, लोअर पैनल से सना बीएमसीएमसी की प्रतिनिधि तस्वीरें काले बिंदीदार लाइनों में परिभाषित ऊपरी पैनल के क्षेत्रों का आवर्धन है । सलाखों = 10 μm।

Figure 3
चित्र 3: विभिन्न शारीरिक स्थलों पर एमसी एनग्रफ्टमेंट की दक्षता का मूल्यांकन। (A)टोलुइडीन ब्लू से दाग 4 माइक्रोन इयर पिनाई सेक्शन की प्रतिनिधि तस्वीरें । (ख)मेसेंटेरिक खिड़कियों की प्रतिनिधि तस्वीरें सैफरानिन/एसीन ब्लू (' Csaba ' दाग) के साथ दाग । (ग)पेरिटोनियल लावेज तरल पदार्थों में मौजूद कोशिकाओं की प्रतिनिधि तस्वीरें और मई-ग्रुनवाल्ड गिमसा (एमजीजी) के साथ दाग । (घ)टोलुइडीन नीले रंग से सना हुआ 4 माइक्रोन फेफड़ों के खंडों की प्रतिनिधि तस्वीरें । बार = 50 माइक्रोन(ए, बी और डी)या 20 माइक्रोन(सी)। चित्र C57BL/6 जंगली प्रकार चूहों (ऊपरी पैनल), एमसी की कमी किटडब्ल्यू-श/डब्ल्यू-श चूहों (मध्य पैनल) और एमसी की कमी चूहों जंगली प्रकार BMCMCs के साथ engrafted से हैं: BMCMCs किटडब्ल्यू-एसएच/डब्ल्यू-एस (लोअर पैनल) । एमसी तीर के साथ संकेत दिया जाता है।

रूप उपलब्ध पृष्ठभूमि एमसी नंबर
(स्थिर स्थिति)		 अन्य फेनोटाइप (9,10,13में समीक्षा की गई) बीएमसीएमसी के साथ एनग्रेफ्टमेंट्स की सूचना दी
किटडब्ल्यू/डब्ल्यू-वी (पश्चिम बंगाल/पुन: x C57BL/6) एफ1
(जैक्सन प्रयोगशालाएं -
WBB6F1/J-KitW/KitW-v/J)		 संयोजी-ऊतक और म्यूकोसल एमसी की अनुपस्थिति एनीमिया, कम बेसोफिल और न्यूट्रोफिल नंबर, मेलानोसाइट्स में कमियां और कैजल, बाँझ आदि की इंटरस्टिटियल कोशिकाएं। i.v.35,37; i.p.31,62; i.d.28,29; i.c. 50, 51; i.a.49; एफपीआई 63
किटडब्ल्यू-श/डब्ल्यू-श C57BL/6
(जैक्सन प्रयोगशालाएं -
B6. सीजी-किटडब्ल्यू-एसएच/एचनिहरजाएब्स्मजे) जैक्सन प्रयोगशालाओं में किए गए एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता विश्लेषण से पता चलता है कि ये चूहे केवल ~८७% C57BL/6-आनुवंशिक पृष्ठभूमि हैं ।		 संयोजी-ऊतक और म्यूकोसल एमसी की अनुपस्थिति बासोफिल और न्यूट्रोफिल संख्या में मध्यम वृद्धि, माइलॉयड-व्युत्पन्न दमन कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि64,मेलानोसाइट्स और कैजल की इंटरस्टिटियल कोशिकाओं में कमी i.v.23,34-36; i.p.31,62; i.d.28,29; i.a.49
C57BL/6J62
(जैक्सन प्रयोगशालाएं -
B6. Cg-KitWsh/HNihrJaeBsmGlliJ) इन चूहों C57BL/6J पृष्ठभूमि पर >11 बार बैकक्रॉस किया गया है ।
बाल्ब/सी65
(C.B6-किटडब्ल्यू-श)
मैकप्ट5-क्रे;
आर-डीटीए 		C57BL/625
(Tg (Cma1-cre) ARoer; B6.129P2-Gt(ROSA) 26Sortm1 (DTA) Lky/J)		 पेरिटोनियल में उल्लेखनीय कटौती (98%) और त्वचा (89-96.5%) एमसी, म्यूकोसल एमसी समाप्त होने की संभावना नहीं म्यूकोसल एमसी की संभावित उपस्थिति; रिपोर्टर चूहों से पता चलता है क्रे-मध्यस्थता ' floxed ' YFP ट्रांसजीन के ~ 30% तिल्ली एनके कोशिकाओं६६ में हटाने कोई नहीं
Cpa3Cre/+ C57BL/626
(B6.129P2-Cpa3tm3 (icre)Hrr)		 संयोजी-ऊतक और म्यूकोसल एमसी की अनुपस्थिति सीपीए 3 अन्य सेल प्रकारों में व्यक्त किया गया है; कम बेसोफिल संख्या i.v.26
बाल्ब/सी26
(B6.129P2/OlaHsd.BALB/c-Cpa3tm3(icre)Hrr)
Cpa3-Cre;
Mcl-1fl/fl 		C57BL/624
(Tg (Cpa3-cre) 3Glli; B6;129-Mcl1tm3sjkJ)		 संयोजी-ऊतक और म्यूकोसल एमसी की अनुपस्थिति सीपीए 3 अन्य सेल प्रकारों में व्यक्त किया गया है; बढ़ी हुई तिल्ली न्यूट्रोफिल और हल्के एनीमिया;
कम बेसोफिल संख्या		 i.d.24;
i.a.49
i.v. (हमारे अप्रकाशित डेटा)

तालिका 1: संविलियन एमसी की कमियों के साथ चूहों के उपभेदों। सी-किट-निर्भर यासी-किट-स्वतंत्रसंविलियन एमसी की कमी वाले चूहों के कई उपभेद उपलब्ध हैं। सिद्धांत रूप में, इन सभी उपभेदों का उपयोग'मास्ट सेल नॉक-इन'चूहों को उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है (हालांकि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, मैकप्ट 5-क्रे के लिए अभी तक इसकी सूचना नहीं दी गई है; आर-डीटीए चूहों) । हालांकि, इनमें से प्रत्येक उपभेदों में अन्य फेनोटाइपिक असामान्यताएं और सीमाएं हैं जिन्हें इन चूहों के साथ प्राप्त परिणामों की व्याख्या करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए। सफल एमसी एनग्रेफ्टमेंट के कुछ उदाहरण संदर्भों में पाए जा सकते हैं। (यह रेफरी9से तालिका 1 का एक संशोधित और अद्यतन संस्करण है)।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इसके आरंभिक विवरण38के लगभग 30 वर्ष बाद भी' मस्त सेल नॉक-इन' दृष्टिकोण इस बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता रहता है कि वीसी वीवो मेंक्या कर सकते हैं या नहीं कर सकते । एमसी के कार्यों को लंबे समय से एलर्जी में उनकी भूमिका तक ही सीमित माना जाता था। 'मास्ट सेलनॉक-इन'दृष्टिकोण का उपयोग करके उत्पन्न डेटा ने इस दृश्य को बदल दिया है, इस बात के सबूत देकर कि एमसी अन्य कार्यों के बीच, कुछ रोगजनकों4,39 या विष 28,31 के खिलाफ मेजबान रक्षा में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं, या यहां तक कि कुछ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को दबा सकते हैं29,34,40।

हमारे प्रोटोकॉल विवरण में, हमने बोन मैरो-व्युत्पन्न सुसंस्कृत एमसी (बीएमसीएमसी) की पीढ़ी और एनग्रेफ्टमेंट पर ध्यान केंद्रित करने का फैसला किया, क्योंकि इन कोशिकाओं की बड़ी संख्या जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती चूहों के अस्थि मज्जा से विट्रो में उत्पन्न की जा सकती है। हालांकि, एमसी को भ्रूणस्टेम कोशिकाओं (भ्रूणस्टेम कोशिका-व्युत्पन्न सुसंस्कृत एमसी [ESCMCs])41 से भी सीधे सुसंस्कृत किया जा सकता है और, जब आनुवंशिक रूप से संगत, इन कोशिकाओं को भी एमसी की कमी चूहों में engraftment के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह वैकल्पिक दृष्टिकोण विशेष रूप से एक प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए दिलचस्प है जिसकी कमी चूहों में भ्रूणीय घातकता लाती है, और इसलिए जिसके लिए इस प्रोटीन के लिए बीएमसीएमसी की कमी उत्पन्न नहीं की जा सकती है। दोनों BMCMCs और ESCMCs भी ब्याज या shrna के जीन encoding के साथ विट्रो में स्थानांतरित किया जा सकता है ब्याज के जीन मौन, एमसी की कमी चूहों३१,३३में इन कोशिकाओं के engraftment से पहले ।

हम आमतौर पर बीएमसीएमसी की संस्कृति के लिए आईएल-3 के स्रोत के रूप में 20% WEHI-3-वातानुकूलित माध्यम का उपयोग करते हैं। हालांकि, रीकॉम्बिनेंट आईएल-3 (10 एनजी/एमएल, जैसा कि चरण 1.2.1 में वर्णित है) का भी उपयोग किया जा सकता है, और संस्कृति माध्यम में पुनर्संयोजन स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ) के अलावा42,43उत्पन्न बीएमसीएमसी की संख्या में काफी वृद्धि हो सकती है। अध्ययन के आधार पर, आईएल-3 के अलावा, बीएमसीएमसी36,44,45उत्पन्न करने के लिए 10 से 100 एनजी/मिलीलीटर पुनर्संयोजन एससीएफ का उपयोग किया गया है। किसी को ध्यान में रखना चाहिए कि विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मुरीन रीकॉम्बिनेंट एससीएफ तैयारी बीएमसीएमसी के विकास को प्रभावित करने में उनकी शक्ति में भिन्न हो सकती है। यह पहचानना भी महत्वपूर्ण है कि बीएमसीएमसी उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोण का विवरण (जैसे कि क्या कोई आईएल-3-युक्त माध्यम में पुनः संयोजन एससीएफ जोड़ता है, संस्कृति अवधि की अवधि, आदि)ऐसी कोशिकाओं के फेनोटाइप और कार्य को प्रभावित कर सकता है। उदाहरण के लिए, यह सूचित किया गया है कि बीएमसीएमसी लंबे समय से एससीएफ के संपर्क में आने से हिस्टामाइन और कुछ प्रोटीज44,46के स्तर में वृद्धि हुई है, लेकिन विट्रो45में एफसीडब्ल्यूआरआई-मध्यस्थता डेग्रेशन और साइटोकिन उत्पादन का एक चिह्नित क्षीणता प्रदर्शित करता है। अंत में, आईएल-3 के अलावा, वीएचआई-3-वातानुकूलित माध्यम में कई जैविक रूप से सक्रिय अणु होते हैं जो एमसी कार्यों को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए वीएचआई-3-वातानुकूलित माध्यम के साथ प्राप्त बीएमसीएमसी के पुनर्संयोजन आईएल-3 (या पुनर्संयोजन आईएल-3 प्लस एससीएफ के साथ) के साथ प्राप्त बीएमसीएमसी से अलग होने की संभावना है। विभिन्न प्रकार के संस्कृति माध्यम में उत्पन्न बीएमसीएमसी के फेनोटाइप में ऐसे किसी भी अंतर को वीवोमें विभिन्न शारीरिक स्थलों में कोशिकाओं के engraftment के बाद बनाए रखा जाता है या नहीं, और इस प्रकार के अतिरिक्त अध्ययन रुचि के हो सकते हैं। हालांकि, चुने हुए संस्कृति की स्थितियों की परवाह किए बिना, एक ही संस्कृति माध्यम नुस्खा का उपयोग सभी बीएमसीएमसी उत्पन्न करने के लिए किया जाना चाहिए ताकि उन प्रयोगों में engraftment के लिए उपयोग किया जा सके जिनसे परिणाम विश्लेषण के लिए एकत्र किए जाएंगे। इसके अलावा, एमसी की कमी वाले चूहों में उनके engraftment से पहले एमसी को कम से कम 4 से 6 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत किया जाना चाहिए, ताकि 95-98%(चित्रा 2)की शुद्धता तक पहुंच सके। यह संभावना को कम करने के लिए है कि "बीएमसीएमसी आबादी" में उपस्थिति, मास्ट सेल वंश के लिए प्रतिबद्ध लोगों के अलावा हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं की (जो अस्थि मज्जा कोशिकाओं को विट्रो मेंरखने के बाद शुरुआती अंतराल पर संस्कृतियों में मौजूद हैं) के परिणामस्वरूप'मास्ट सेल नॉक-इन'चूहों में एमसी के अलावा दाता-व्युत्पन्न कोशिकाओं की उपस्थिति हो सकती है।

हम यहां जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती BMCMCs intraperitoneally (i.p.), नसों में (i.v.) या इंट्राडरमैली (i.d.) के साथ एमसी की कमी चूहों को घेरने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, क्योंकि इंजेक्शन के इन मार्गों का उपयोग कई जांचकर्ताओं द्वारा किया गया है। हालांकि, बीएमसीएमसी को भी सफलतापूर्वक बैक स्किन47,फुटपैड48,इंट्रा-आर्टिकुलरली 49 या इंट्रा-कपाल50,51में शामिल किया गया है। एनग्रेफ्ट करने के लिए बीएमसीएमसी की संख्या, साथ ही एनग्रफ्टमेंट और प्रयोग के बीच अंतराल, इंजेक्शन के मार्ग और लक्षित अंग को एनग्रेफ्ट(चित्रा 1)के आधार पर भिन्न हो सकता है। प्रयोग शुरू करने से पहले बीएमसीएमसी को एंग्रीफ्ट करने के बाद ऐसे अंतरालों का सम्मान करना बहुत महत्वपूर्ण है ताकि बीएमसीएमसी (जो पूरी तरह से परिपक्व एमसी नहीं हैं) के लिए पर्याप्त समय दिया जा सके ताकि वीवो मेंअधिक परिपक्व हो सके। क्योंकि एमसी के साइटोप्लाज्मिक कणिकाओं में संग्रहीत मध्यस्थों की सामग्री सेल के जीवनकाल38,52के दौरान बढ़ना जारी रख सकती है, कुछ प्रयोगों के लिए कोई भी एमसी एनग्रेफ्टमेंट और एमसी फ़ंक्शन का आकलन करने के लिए प्रयोग की शुरुआत के बीच अंतराल को बढ़ाना चाहता है।

इंजेक्शन के मार्ग और/या बीएमसीएमसी इंजेक्शन की संख्या के आधार पर, दत्तक स्थानांतरित एमसी की संख्या और/या शारीरिक वितरण जंगली प्रकार चूहों में इसी देशी एमसी आबादी के उन लोगों से अलग कर सकते है१२,२३,५३,५४। एमसी की कमी चूहों ने12,23के बाद एमसी ट्रांसफर के बाद क्रमशः 4 से 8 सप्ताह का आकलन करते हुए, जंगली प्रकार के चूहों में देशी एमसी आबादी की तुलना में एमसी की एक ही संख्या और वितरण के बारे में एक ही संख्या और वितरण हो सकता है। बीएमसीएमसी के नसों में अंतरण से अधिकांश ऊतकों में सामान्य एमसी संख्या और/या वितरण नहीं होता है । उदाहरण के तौर पर ऐसे यानी एंग्रीड'मास्ट सेल नॉक-इन'चूहों की त्वचा में न तो या बहुत कम एमसी पाए जाते हैं। एमसी की कमी चूहों में BMCMCs के i.v. इंजेक्शन के बाद 4-28 सप्ताह में, श्वासनली में एमसी की संख्या इसी जंगली प्रकार चूहों की तुलना में काफी कम हैं । इसके विपरीत, फेफड़ों की परिधि में एमसी की संख्या आम तौर पर इसी जंगली प्रकार के चूहों12,23,53,55में उन लोगों की तुलना में अधिक होती है। बीएमसीएमसी के आईवी हस्तांतरण के परिणामस्वरूप तिल्ली में एमसी के उच्च स्तर भी होते हैं, जबकि बहुत कम देशी एमसी आमतौर पर इस अंग में जंगली प्रकार के चूहों23,56में पाए जाते हैं। महत्वपूर्ण बात, पिछली रिपोर्टों से पता चला है कि एमसी की कमी वाले चूहों में बीएमसीएमसी का वीएस इंजेक्शन रीढ़ की हड्डी, लिम्फ नोड्स या हार्ट54,57जैसी विशिष्ट शारीरिक साइटों में एमसी की आबादी को एनग्रेफ्ट करने में विफल रहता है। कई समूहों ने यह भी नोट किया है कि इस तरह के i.v. engraftment आंतों म्यूकोसल एमसी (एमएमसी)जनसंख्या 23,58-60के engraftment में परिणाम नहीं है । एमसी केमस्त सेल नॉक-इनमॉडल 9 का उपयोग करके प्राप्त आंकड़ों की व्याख्या करते समय एमसी नंबरों और/या दत्तक-स्थानांतरित एमसी बनाम देशी एमसी के वितरण में इसतरहके अंतर को ध्यान में रखा जाना चाहिए ।

एमसी की कमी चूहों के कई उपभेदों मौजूद हैं, और चुनने जो एक विशेष परियोजना में उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । सी-किट उत्परिवर्ती एमसी की कमी चूहों, जैसे किटडब्ल्यू/डब्ल्यू-वी या किटडब्ल्यू-श/डब्ल्यू-श चूहों, पारंपरिक रूप से कई जांचकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, ऐसे चूहे अपनी गहन एमसी की कमी(तालिका 1)के बगल में कईसी-किट-संबंधितफेनोटाइपिक असामान्यताओं से पीड़ित हैं। हाल के वर्षों में,सी-किट-स्वतंत्रसंविलियन एमसी की कमी वाले चूहों के कई उपभेदों की सूचना24-26दी गई है । इनमें से कुछ चूहे अपनी एमसी की कमी(तालिका 1)के बगल में अन्य फेनोटाइप असामान्यताओं को भी प्रदर्शित करते हैं, और अतिरिक्त असामान्यताओं की भी खोज की जा सकती है क्योंकि इन नए वर्णित उपभेदों का फेनोटाइप अभी भी जांच के अधीन है। इन सभी चूहों और एमसी की कमी चूहों के कुछ अतिरिक्त नए प्रकार हाल ही में विस्तार से9,10,13की समीक्षा की गई है ।

वर्तमान में उपलब्ध एमसी की कमी वाले उपभेदों में से प्रत्येक की सीमाओं को देखते हुए, हम एमसी की कमी9के एक से अधिक मॉडल का उपयोग करके एमसी फ़ंक्शन के बारे में परिकल्पनाओं का परीक्षण करने का प्रयास करने की सलाह देते हैं। हमारी प्रयोगशाला में, हम आम तौर पर किटडब्ल्यू-श/डब्ल्यू-श और Cpa3-Cre में प्रायोगिक प्रयोग करते हैं; एमसीएल-1fl/fl चूहों । यदि हम दोनों प्रकार के एमसी-कमी वाले चूहों में सामंजस्यपूर्ण परिणाम प्राप्त करते हैं, तो हम एमसी की भूमिका का पता लगाने और कुछ एमसी-व्युत्पन्न उत्पादों की संभावित भूमिकाओं का आकलन करने के लिए प्रयोगों को बढ़ाते हैं। अंत में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एमसी में "floxed" जीन के एमसी या क्रे रिकॉम्बेशन-मध्यस्थता हटाने की अनुमति देने वाले कई उपभेदों को भी हाल ही में25,49,61वर्णित किया गया है। इन उपभेदों की विस्तार से समीक्षा की गई हैऔर वीवोमें एमसी कार्यों का अध्ययन करने के लिए आशाजनक वैकल्पिक या पूरक दृष्टिकोणों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एनजी फ्रेंच "प्रियतम डालना ला Recherche Médicale FRM" और फिलिप फाउंडेशन से फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है; आरएस बच्चों के स्वास्थ्य के लिए ल्यूसिले पैकार्ड फाउंडेशन और स्टैनफोर्ड NIH/NCRR CTSA पुरस्कार संख्या UL1 RR025744 द्वारा समर्थित है; पुनश्च मैक्स Kade फाउंडेशन और ऑस्ट्रिया के विज्ञान अकादमी और ऑस्ट्रिया के विज्ञान कोष (FWF) के एक श्रोडिंगर फैलोशिप के एक मैक्स Kade फैलोशिप द्वारा समर्थित है: J3399-B21; S.J.G. स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों से समर्थन स्वीकार U19 AI104209, एनएस ०८००६२ और तंबाकू से संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम से कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय में; L.L.R. गठिया राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन (ANRF) और स्वास्थ्य अनुदान के राष्ट्रीय संस्थानों K99AI110645 से समर्थन स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25 G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30 G x 1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1% Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as 'tunable' effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models - Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. 'Sash' mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

Tags

इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 99 सी-किट,स्टेम सेल फैक्टर एफसीεआरआई इम्यूनोग्लोबुलिन ई माउस मॉडल दत्तक स्थानांतरण इम्यूनोलॉजी एलर्जी
'मस्त सेल<em>नॉक-इन'</em>चूहों का उपयोग कर <em>वीवो में</em> मस्त कोशिकाओं के कार्यों का विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, … More

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter