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Immunology and Infection

Analisi delle funzioni delle mastociti in vivo usando topi ' Mast Cell Knock-in'

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52753
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

Summary

Descriviamo un metodo per la generazione di mastociti derivate in vitro, il loro innesto in topi carenti di mastociti, e l'analisi del fenotipo, dei numeri e della distribuzione delle mastociti innestati in diversi siti anatomici. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare le funzioni delle mastociti in vivo.

Abstract

Le mastociti (MC) sono cellule ematopoietiche che risiedono in vari tessuti e sono particolarmente abbondanti in siti esposti all'ambiente esterno, come la pelle, le vie aeree e il tratto gastrointestinale. Meglio noti per il loro ruolo dannoso nelle reazioni allergiche dipendenti dall'IgE, i MC sono anche emersi come attori importanti nella difesa dell'ospite contro il veleno e invadendo batteri e parassiti. Il fenotipo e la funzione MC possono essere influenzati da fattori microambientali che possono differire a seconda della posizione anatomica e/o in base al tipo o allo stadio di sviluppo delle risposte immunitarie. Per questo motivo, noi e altri abbiamo favorito approcci in vivo rispetto ai metodi in vitro per ottenere informazioni sulle funzioni MC. Qui descriviamo i metodi per la generazione di MC coltivati derivati dal midollo osseo del topo (BCMCC), il loro trasferimento adottivo in topi geneticamente carenti di MC e l'analisi del numero e della distribuzione di MC trasferiti adottivamente in diversi siti anatomici. Questo metodo, chiamato approccio"mast cell knock-in", è stato ampiamente utilizzato negli ultimi 30 anni per valutare le funzioni dei MC e dei prodotti derivati da MC in vivo. Discutiamo dei vantaggi e dei limiti di questo metodo, alla luce degli approcci alternativi sviluppati negli ultimi anni.

Introduction

Le mastociti (MC) sono cellule ematopoietiche che derivano da progenitori pluripotenti del midolloosseo 1-3. A seguito dell'egressione del midollo osseo, i progenitori di MC migrano in vari tessuti dove si sviluppano in MC maturi sotto l'influenza di fattori dicrescita locali 1-3. I MC residenti nei tessuti si trovano strategicamente nelle interfacce host-ambiente, come la pelle, le vie aeree e il tratto gastrointestinale, dove si comportano come una prima linea di difesa contro gli insultiesterni 3-6. I MC sono spesso sottoclassificato in base alle loro caratteristiche fenotipiche "basale" e alle loro posizioni anatomiche. Nei topi sono stati descritti due tipi di TC: I MAT (CTMC) di tipo tessuto connettivo e i MC mucosi (MMC)1-3,7,8. I CTMC si trovano spesso intorno alle vene e vicino alle fibre nervose e risiedono in cavità sierosali, mentre gli MLC occupano posizioni intraepiteliali nell'intestino e nella mucosarespiratoria 1-3.

Numerose metodologie sono state applicate per studiare le funzioni biologiche dei MC9-13. Molti gruppi si sono concentrati su approcci in vitro utilizzando linee cellulari (come le linee MC umane HMC114 o LAD215,16),MC derivati in vitro (come MC17derivati dal sangue periferici umani o derivati dal midollo osseo del topo MC coltivati [BCMCC]18, MC coltivati derivati dalla pelle fetale [FCMCC]19 e MC peritoneali derivati da cellule [PCPC]20) o MC isolati ex vivo provenienti da diversi siti anatomici. Tutti questi modelli sono ampiamente utilizzati per studiare i dettagli molecolari della biologia MC, come le vie di segnalazione coinvolte nell'attivazione MC. Tuttavia, un aspetto importante della biologia delle CCI è che le loro caratteristiche fenotipiche e funzionali(ad esempio,contenuto di proteasi del granulo citoplasmatico o risposta a diversi stimoli) possono essere modulate dalla posizione anatomica e dal microambiente2,7. Poiché l'esatta miscela di tali fattori che si incontrano in vivo può essere difficile da riprodurre in vitro,favoriamo l'utilizzo di approcci in vivo per ottenere informazioni sulle funzioni9 delle TC.

Esistono diversi ceppi di topi con carenza genetica di MC, come i topi WBB6F1-Kit W/W-v o C57BL/6-Kit W-sh/W-sh. Questi topi mancano di espressione e/o attività di KIT (CD117), il recettore per il principale fattore di crescita MC fattore di crescita fattore di cellule staminali (SCF)21,22. Di conseguenza, questi topi hanno una profonda carenza di MC ma hanno anche anomalie fenotipiche aggiuntive legate alle loro mutazioni delkit c- (nei topi WBB6F1-Kit W/W-v) o agli effetti della grande inversione cromosomica che si traduce in una ridotta espressione delkit c- (nei topi C57BL/6-Kit W-sh/W-sh) 9,10,12,23. Più recentemente, diversi ceppi di topi con carenza di MC costitutiva indipendente dalkitc- sono stati segnalati24-26. Tutti questi topi e alcuni nuovi tipi aggiuntivi di topi inducibili a disinvolto mc sono stati recentemente esaminati indettaglio 9,10,13.

Qui descriviamo i metodi per la generazione di MC coltivati derivati dal midollo osseo del topo (BBMCMC), il loro trasferimento adottivo in topi a disacienti mc e l'analisi del numero e della distribuzione di MC trasferiti adottivamente in diversi siti anatomici. Questo cosiddetto metodo "mast cell knock-in" può essere utilizzato per valutare le funzioni dei MC e dei prodotti derivati da MC in vivo. Discutiamo dei vantaggi e dei limiti di questo metodo, alla luce degli approcci alternativi sviluppati negli ultimi anni.

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Protocol

Tutta la cura e la sperimentazione degli animali sono state condotte nel rispetto delle linee guida dei National Institutes of Health e con l'approvazione specifica dell'Institutional Animal Care and Use Committee della Stanford University.

1. Generazione e caratterizzazione di mastociti coltivati derivati dal midollo osseo (BBMCMC).

Nota: I BBMCMC donatori devono essere generati da cellule del midollo osseo dello stesso background genetico dei topi riceventi carenti di MC. I BBMCMC donatori di derivazione maschile non sono adatti per l'innesto di topi femmine. I BBMCMC donatori di derivazione femminile si innesteranno con successo sia nei riceventi maschi che in quello femminile.

  1. Estrazione del midollo osseo.
    1. Versare la salina sterile tamponata con fosfato (PBS) in 6 piastre di coltura del pozzo (1 pozzo per topo) e posizionarla sul ghiaccio.
    2. Immergere gli strumenti di dissezione in etanolo al 70% per la sterilizzazione.
    3. Eutanasia dei topi donatori per inalazione dianidride carbonica(CO 2) seguita da lussazione cervicale, quindi spruzzare i topi con il 70% di etanolo nei siti di manipolazione.
    4. Utilizzare strumenti sterili di dissezione per estrarre le ossa di femore, tibia e fibula senza tagliare epifisi ossee.
    5. Mentre si fissano le ossa con una flesso, raschiare via tutto il tessuto dalle ossa (e scartare la fibula) usando forbici sterili (o lame bisturi). Posizionare le ossa in PBS sul ghiaccio fino a quando tutte le ossa non vengono raccolte.
    6. Eseguire tutti i passaggi rimanenti nella cappa di coltura dei tessuti sterili. Utilizzando strumenti sterili, fissare le ossa con le forcep e tagliare entrambe le epifisi per esporre la cavità midollare.
    7. Utilizzando siringhe da 3 ml e aghi da 30 G e mezzo di lavaggio a freddo (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] integrato con siero di vitello fetale al 10% [FCS, inattivato dal calore], 2 mM L-glutammina, soluzione antibiotico-antimicotica all'1%, 50 μM Β-mercaptoetanolo), lavare il midollo osseo rosso in una piastra di Petri.
    8. Utilizzare la stessa siringa per dissociare i grappoli di cellule del midollo osseo lavato mediante ripetute aspirazione ed espulsione delicata.
    9. Mettere in piscina il midollo osseo femorale e tibiale di ogni topo in un tubo di centrifuga da 15 ml. Riempire il tubo con mezzo di lavaggio a freddo per lavare le cellule del midollo osseo e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 °C.
  2. Cultura BMCMC.
    1. Rimuovere il supernatante e recuperare le cellule del midollo osseo a pellet in 10 ml di mezzo di coltura (DMEM integrato con siero fetale al polpaccio al 10% [FCS, inattivato termicamente], 2 mM L-glutammina, soluzione antibiotico-antimicotica all'1%, 50 μM Β-mercaptoetanolo e 20% di supporto condizionato alle cellule WEHI-3 [come fonte di IL-3; in alternativa utilizzare il topo ricombinante IL-3 a 10 ng/ml]).
    2. Posizionare le cellule nel pallone di coltura tissutale di dimensioni appropriate(ad esempio,T25 per 1 topo, T75 per 2 topi, ecc.).
    3. 1-2 giorni dopo la placcatura delle cellule, trasferire cellule medie e sospese (lasciando detriti e cellule aderenti attaccate al fondo del pallone) in un nuovo pallone e aggiungere un mezzo di coltura fresco (10 ml/ topo).
    4. Durante le settimane successive, nutrire le cellule ogni 3-4 giorni (aggiungere 10 ml di mezzo di coltura per topo). Mantenere la densità cellulare tra 2,5 x 105-1 x 106 cellule/ml. Trasferire le cellule non aderenti in un nuovo pallone una volta alla settimana fino a quando non sono presenti cellule aderenti nel pallone di coltura. Testare la maturità delle cellule (vedi sotto) prima dell'uso per saggi in vitro o innesto in topi a basso consumo di MC.
      NOTA: La differenziazione completa dei BBMCMC richiederà 4-6 settimane.
  3. Valutazione della maturità di BMCMC.
    1. Usando la citometria a flusso.
      1. Lavare le celle (5 x 104-5 x 105 celle/condizione) con tampone FACS ghiacciato (PBS, 0,5% FCS) in tubo inferiore rotondo in polistirolo da 5 ml. Centrifuga a 400 x g per 5 min a 4 °C. Aspira il supernatante.
      2. Diluire gli anticorpi monoclonali anti-mouse CD16/32 (clone 93 o 2.4G2) 1:200 (2,5 μg/ml) nel tampone FACS. Aggiungere 10 μl ad ogni pellet e ripresorsi con un breve vortice. Incubare 5 minuti sul ghiaccio per bloccare l'attacco Fc.
        NOTA: proteggere i campioni dalla luce diretta per tutti i passaggi rimanenti.
      3. Fieerythrin coniugato diluire (PE) l'anti-mouse Coniugato Fc εRI α (clone MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) e l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) COjugate anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("soluzione di colorazione"), o i rispettivi anticorpi di controllo dell'isotipo etichettati nel buffer FACS ("soluzione di controllo dell'isotipo").
      4. Dividere metà delle celle bloccate dal passaggio 1.3.1.2) in un tubo inferiore rotondo in polistirolo aggiuntivo e aggiungere 20 μl di "soluzione di colorazione" in un tubo e 20 μl di "soluzione di controllo dell'isotipo" nell'altro tubo. Incubare 30 minuti sul ghiaccio.
      5. Aggiungere 3 ml di tampone FACS ghiacciato e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il supernatante e resospendare il pellet in tampone FACS da 300 μl contenente 1 μg/ml di ioduro di propidio (PI, per l'identificazione di cellule morte). Procedere all'analisi della citometria del flusso (vedere figura 2A).
    2. Usando la colorazione blu toluidina.
      1. Lavare 1 x 105 celle una volta con PBS per centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare e rimorsire le cellule in 200 μl di PBS.
      2. Trasferire la sospensione cellulare in un citofunnel preparato collegato a uno scivolo del microscopio e procedere con la citocentrifugazione usando un citocentrifugo (40 x g per 5 min).
      3. Scivoli ad aria secca per 10 minuti e disegnare un cerchio di cera intorno alle celle utilizzando una penna PAP. Aggiungere la soluzione blu toluidina allo 0,1% per coprire le cellule. Incubare per 1 minuto. Lavare gli scivoli in acqua corrente del rubinetto per 1 minuto, quindi asciugare l'aria per 10 minuti.
      4. Copre le celle di sospensione utilizzando il supporto di montaggio. Procedere all'analisi del microscopio luminoso (vedere figura 2B)

2. Innesto di topi carenti di mast cell con BBMCMC.

  1. Innesto dell'orecchio per iniezione intradermica (d.d.).
    NOTA: Per il trasferimento adottivo di BBMCMC nella pinna dell'orecchio di topi a disinnesto mc, si consiglia di eseguire due iniezioni di 1 x 106 cellule ciascuna (per un totale di 2 x 106 cellule) per pinna dell'orecchio. L'innesto intradermico dei BBMCMC nell'apice dell'orecchio dei topi a disinfezione MC è stato utilizzato da molti investigatori in diversi modelli, tra cui modelli di anafilassi cutanea passiva (PCA)24,27,difesa ospite contro i veleno28e reazioni di ipersensibilità cronica (CHS)29,30.
    1. Contare e rimosodire le celle a 4 x 107 BCMC/ml (1 x 106 BBMCMC/ 25 μl) in DMEM freddo. Trasferire la soluzione BMCMC in una siringa da 1 ml dotata di un ago da 30 G. Tenere sul ghiaccio fino all'iniezione.
    2. Anestetizzare topi mc carenti di 4-6 settimane usando isoflurane (2,5% v/v). Controllare la profondità dell'anestesia con il dito del dito del giorno, regolare l'isoflurane se indicato e continuare a monitorare la respirazione e la risposta delle dita dei piedi durante tutta la procedura. Applicare unguento oftalmico con una punta Q per prevenire la secchezza degli occhi.
    3. Con l'indice, creare pressione verticale sulla faccia dorsale dell'pinna dell'orecchio per esporre ed allungare la faccia ventrale.
    4. Eseguire due iniezioni di 25 μl di soluzione BMCMC in due diversi siti della faccia ventrale della pinna dell'orecchio, la prima iniezione al centro dell'orecchio e la seconda iniezione verso la punta della pinna dell'orecchio. Attendere 4-6 settimane dopo l'innesto d.d. prima di eseguire esperimenti in vivo.
      Nota: Nella nostra esperienza, a quel punto il numero di MC/mm2 di derma nella parte centrale dell'pinna dell'orecchio è generalmente simile a quello nella posizione corrispondente nei topi di tipo selvatico,mentre il numero di MC/mm 2 nella periferia dell'pinna dell'orecchio è in genere sostanzialmente inferiore a quello dei corrispondenti topi di tipo selvatico27,28. Questo dovrebbe essere tenuto presente quando si progettano esperimenti con tali topi innestati mc(ad esempio,gli agenti con possibili effetti sulla funzione MC dovrebbero essere iniettati nella parte centrale dell'pinna dell'orecchio e l'analisi degli effetti di tali trattamenti dovrebbe concentrarsi anche su quell'area).
  2. Innesto della cavità peritoneale mediante iniezione intraperitoneale (i.p.).
    NOTA: Il trasferimento adottivo di BBMCMC nella cavità peritoneale dei topi a basso consumo di MC richiederà un'iniezione di 2 x 106 cellule per topo. Tali iniezioni di IBC in topi a basso consumo di MC sono state utilizzate da molti gruppi per studiare i ruoli dei MC peritoneali in vari modelli, inclusi i modelli di difesa ospite contro i veleno31 o la sepsi batterica32,33.
    1. Contare il numero appropriato di cellule e rimosi a 1 x 107 BCMC/ml (2 x 106 BCMC/ 200 μl) in DMEM freddo. Trasferire la soluzione BMCMC in una siringa da 1 ml dotata di un ago da 25 G. Tenere sul ghiaccio fino all'iniezione.
    2. Eseguire 1 iniezione di soluzione BMCMC da 200 μl nella cavità peritoneale di topi mc-carenti di 4-6 settimane. Attendere 4-6 settimane dopo l'innesto di i.p. prima di eseguire esperimenti in vivo.
  3. Innesto per iniezione endovenosa (v.v.).
    NOTA: Il trasferimento adottivo di BBMCMC mediante iniezione i.v. in topi a disinnesto mc richiederà un'iniezione di 5 x 106 cellule per topo. Iniezioni endovenose (v.v.) di BBMCMC in topi a disinfezione MC sono state utilizzate da molti gruppi per studiare il ruolo delle MC in vari modelli di malattia, tra cui modelli di infezione della vescica34,asma35,fibrosipolmonare 36e artrite mediata da anticorpi37.
    1. Contare il numero appropriato di cellule e rimosi a 2,5 x 107 BCMC/ml (5 x 106 BCMC/200 μl) in DMEM freddo. Trasferire la soluzione BMCMC in una siringa da 1 ml dotata di un ago da 30 G. Tenere sul ghiaccio fino all'iniezione.
    2. Anestetizzare topi mc carenti di 4-6 settimane usando isoflurane (2,5% v/v). Controllare la profondità dell'anestesia con il dito del dito del giorno, regolare l'isoflurane se indicato e continuare a monitorare la respirazione e la risposta delle dita dei piedi durante tutta la procedura. Applicare unguento oftalmico con una punta Q per prevenire la secchezza degli occhi.
    3. Eseguire un'iniezione di 200 μl di soluzione BMCMC nella vena di coda (o, in alternativa, nella vena retro-orbitale) di un topo a disinvolto MC. Attendere 12 settimane dopo l'innesto di i.v. prima di eseguire esperimenti in vivo.

3. Analisi dei topi a disinnestati carenti di cellule d'albero.

  1. Analisi dell'innesto dell'orecchio.
    1. Alla fine dell'esperimento, eutanasiare i topi per inalazione di CO2 seguita da lussazione cervicale.
    2. Isolare la pinna dell'orecchio e fissarla in formalina tamponata al 10% (vol/vol) durante la notte a 4 °C. Incorporare pinna fissa dell'orecchio in paraffina, tagliare sezioni di 4 μm di pinna dell'orecchio e montare su scivoli di vetro.
    3. Macchiare gli scivoli con una soluzione blu toluidina allo 0,1% per 1 minuto a temperatura ambiente. Lavare gli scivoli in acqua del rubinetto per 1 minuto, quindi asciugare l'aria per 10 minuti a temperatura ambiente.
    4. Le diapositive di coverslip con supporto di montaggio, quindi contano il numero di MC innestati per sezioni pinnae utilizzando un microscopio a luce. Valutare l'efficienza di innesto confrontando la percentuale e la distribuzione di TC nella pelle dell'orecchio dei topi innestati rispetto ai topi di tipo selvatico.
  2. Analisi dell'innesto della cavità peritoneale.
    1. Valutazione del numero di mastociti nella cavità peritoneale.
      1. Alla fine dell'esperimento, eutanasiare i topi per inalazione di CO2 seguita da lussazione cervicale. Rimuovere con cura la pelle ventrale dei topi senza rompere la cavità peritoneale.
      2. Iniettare 5 ml di PBS a temperatura fredda o ambiente nella cavità peritoneale utilizzando una siringa da 5 ml dotata di un ago da 25 G. Utilizzare PBS freddo per ridurre il rischio di attivazione delle cellule peritoneali (questo è molto importante quando si valuta la degranulazione MC peritoneale o i livelli di alcuni prodotti derivati da MC nel liquido di lavaggio peritoneale). Eseguire un massaggio dell'addome per 20 secondi per raccogliere le cellule peritoneali.
      3. Aspirare lentamente il lavaggio peritoneale utilizzando una siringa da 5 ml dotata di un ago da 22 G. Registrare il volume di lavanda aspirata (si prevede di recuperare fino all'80% del volume iniettato).
      4. Trasferire il liquido di lavanda peritoneale in un tubo inferiore rotondo in polistirolo da 5 ml e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 °C. Aspira il supernatante. Recuperare il pellet in PBS freddo da 400 μl.
      5. Contare il numero totale di cellule peritoneali usando una camera emocitometrica. Utilizzare metà della sospensione cellulare per un'analisi della citometria di flusso (come descritto al passaggio 1.3.1), per valutare la percentuale e l'espressione marcatore delle TC innestati nella cavità peritoneale. Moltiplicare il numero totale di celle peritoneali per la percentuale di TC per ottenere il numero assoluto di TC peritoneali.
      6. Eseguire una citocentrifugazione con le cellule rimanenti come descritto al passaggio 1.3.2.2. Scivoli ad aria secca per 10 minuti a temperatura ambiente e disegnare un cerchio di cera intorno alle celle utilizzando una penna PAP.
      7. Coprire le celle con soluzione di colorazione May-Grünwald non diluita per 5 minuti, seguita da lavaggio in PBS per 5 minuti, entrambe a temperatura ambiente. Coprire le cellule con macchia di Giemsa diluita 1:20 con acqua deionizzata e incubare 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare gli scivoli 2 volte in acqua del rubinetto per 1 minuto, quindi asciugare l'aria.
      8. Copre le celle di rilipano utilizzando il supporto di montaggio e calcola la percentuale di MC innestati utilizzando un microscopio a luce (contando almeno 400 celle totali). Valutare l'efficienza di innesto confrontando la percentuale di TC nella lavanda peritoneale dei topi innestati rispetto ai topi di tipo selvatico.
    2. Valutazione delle mastociti nelle finestre mesenteriche.
      1. Seguendo il gabinetto peritoneale descritto nel passaggio 3.2.1, aprire la membrana peritoneale per esporre il tratto intestinale dei topi. Disporre da 4 a 5 finestre mesenteriche per mouse su una diapositiva.
      2. Fissare le diapositive per 1 ora in soluzione di Carnoy (3:2:1 vol/vol/vol di etanolo, cloroformio e acido acetico glaciale) a temperatura ambiente. Scivoli ad aria asciutta e rimuovere l'intestino (le finestre mesenteriche fisse rimarranno attaccate alle diapositive).
      3. Macchiare i preparati per 20 minuti a temperatura ambiente con soluzione di colorazione Csaba (Blu alciano / Safranina O).
        1. Per fare 500 ml di macchia di Csaba, preparare 500 ml di tampone di acetato mescolando 100 ml di soluzione di acetato di sodio da 1 M con 120 ml di 1 M HCl. Quindi, sciogliere 90 mg di Safranina [identifica "MC maturi" in rosso], 1,8 g blu alciano [identifica "MC immaturi" in blu] e 2,4 g di solfato di ammonio ferrico NH4Fe(SO4)2 in 500 ml di tampone di acetato.
      4. Le diapositive di coverslip con supporto di montaggio, quindi contano il numero di MC innestati per finestra mesenterica utilizzando un microscopio a luce. Valutare l'efficienza di innesto confrontando la percentuale e la distribuzione di TC nelle finestre mesenteriche dei topi innestati rispetto ai topi di tipo selvatico.
  3. Analisi dell'innesto I.v.
    1. Al termine dell'esperimento, eutanasiare i topi per inalazione di CO2 seguita da lussazione cervicale e raccogliere tessuti di interesse(ad esempio polmone, pelle o milza) e fissarsi durante la notte in formalina tamponata al 10% (vol/vol) a 4 °C.
    2. Incorporare tessuti fissi in paraffina, tagliare sezioni da 4 μm e montare su vetrini. Macchiare gli scivoli con una soluzione blu toluidina allo 0,1% per 1 minuto a temperatura ambiente. Lavare gli scivoli in acqua del rubinetto per 1 minuto, quindi asciugare all'aria gli scivoli per 10 minuti.
    3. Coverslip scorre utilizzando il supporto di montaggio e valuta il numero e la distribuzione dei MC innestati per sezioni di tessuto utilizzando un microscopio a luce.

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Representative Results

Una panoramica dell'approccio "mast cell knock-in" è mostrata nella Figura 1, e include la generazione di BBMCC, il numero di cellule che dovrebbero essere innestati i.p., i.d. o i.v. in topi mc-carenti (il numero può essere variato se indicato in base al progetto sperimentale) e l'intervallo tra l'innesto e l'esperimento a seconda del sito di iniezione (anche questo intervallo può variare, se indicato; ad esempio, ilcontenuto di mediatori immagazzinati nei granuli citoplasmatici MC aumenta costantemente con il tempo38). La figura 2 mostra analisi rappresentative della citometria del flusso e colorazione blu toluidina dei BBMCC dopo 1, 15 e 45 giorni di coltura in mezzo DMEM contenente nel mezzo 20% WEHI-3 condizionato dalla cella come fonte di IL-3. Si noti che i BBMCMC coltivati per 45 giorni sono puri al 95%, contengono un elevato numero di granuli citoplasmatici e possono essere utilizzati per esperimenti di innesto, mentre le cellule coltivate per 15 giorni non sono adatte per l'innesto. La figura 3 mostra l'innesto rappresentativo riuscito nella pinna dell'orecchio 4 settimane dopo l'innesto (Figura 3A), nelle finestre mesenteriche (Figura 3B) e nella cavità peritoneale (Figura 3C) 6 settimane dopo l'innesto di i.p. e nel polmone(figura 3D) 12 settimane dopo l'innesto di i.v.

Figure 1
Figura 1: Modello ditopo knock-ina celle d'albero per l'analisi delle funzioni MC in vivo. I MC coltivati derivati dal midollo osseo mutante o mutante (BBMCMC) sono generati coltivando cellule del midollo osseo per almeno 4-6 settimane in un mezzo condizionato dalle cellule WEHI-3 al 20% come fonte di IL-3 (o in alternativa in mezzo contenente 10 ng/ml di topo ricombinante IL-3). Questi BBMCMC possono quindi essere innestati in topi a disincascati mc per creare i cosiddettitopi knock-in" mast cell". I BBMCM possono essere iniettati attraverso diverse vie (endovenosa [i.v.], intraperitoneale [i.p.] o intradermica [i.d.]) per la ricostituzione locale (i.d., i.p.) o sistemica (i.v.) di varie popolazioni MC. Le funzioni MC in varie risposte biologiche possono quindi essere analizzate confrontando le risposte nei topi di tipo selvatico, nei topi a disincazione MC e neitopi knock-indelle cellule mast. Il contributo di specifici prodotti MC può essere analizzato confrontando le risposte dei topiknock-in" mast cell innestati con BCMC di tipo selvatico o BBMCMC derivati da topi che non hanno, o esprimono forme geneticamente alterate di tali prodotti. (Si tratta di una versione modificata della figura 1 della rif.12).

Figure 2
Figura 2: Valutazione della purezza dei preparati BMCMC mediante citometria a flusso e microscopia. (A) Analisi rappresentative della citometria a flusso dell'espressione FcεRIα e KIT (CD117) sulla superficie di 1 giorno (pannello sinistro), 15 giorni (pannello centrale) e 45 giorni (pannello destro) vecchi BBMCC. I numeri indicano la percentuale di FcεRIα+KIT+ BMCMC gated nel quadrato blu. (B) Immagini rappresentative di BCMC macchiate di blu toluidina, il pannello inferiore è un ingrandimento delle regioni del pannello superiore definite in linee tratteggiate nere. Barre = 10 μm.

Figure 3
Figura 3: Valutazione dell'efficienza dell'innesto MC in vari siti anatomici. (A) Immagini rappresentative di sezioni pinna dell'orecchio da 4 μm macchiate di blu toluidina. (B) Immagini rappresentative di finestre mesenteriche macchiate di blu safranina/aciano (macchia 'Csaba'). (C) Immagini rappresentative di cellule presenti in fluidi di lavanda peritoneale e macchiate con May-Grünwald Giemsa (MGG). (D)Immagini rappresentative di sezioni polmonari da 4 μm macchiate di blu toluidina. Barre = 50 μm (A, B e D) o 20 μm (C). Le immagini provengono da mouse di tipo selvaggio C57BL/6 (pannello superiore), mouseW-sh/W-sh kit mc-s carenti (pannello centrale) e mouse a basso consumo mc innestati con BBMCMC di tipo selvaggio: KitBMCMCW-sh/W-sh (pannello inferiore). I MC sono indicati con frecce.

topi Sfondi disponibili Numeri MC
(stato stazionario)		 Altri fenotipi (esaminati in9,10,13) Innesti segnalati con BBMCMC
KitW/W-v (WB/Re x C57BL/6) F1
(Jackson Laboratories –
WBB6F1/J-KitW/KitW-v/J)		 Assenza di MC connettivo-tessuto e mucosa Anemia, ridotto numero di basofili e neutrofili, carenze nei melanociti e nelle cellule interstiziali di Cajal, sterili, ecc. v.35,37; i.p.31,62; 28,29; i.c.50,51; i.a.49; La commissione per l'i.i. 63 di cui 63
KitW-sh/W-sh C57BL/6
(Jackson Laboratories –
B6. La commissione per l' Cg-KitW-sh/HNihrJaeBsmJ) L'analisi del polimorfismo mono nucleotidico eseguita nei laboratori jackson mostra che questi topi hanno solo circa l'87% di background genetico C57BL/6.		 Assenza di MC connettivo-tessuto e mucosa Moderato aumento del numero di basofili e neutrofili, aumento del numero di cellule soppressori derivate da mieloidi64, carenze nei melanociti e nelle cellule interstiziali di Cajal v.23,34-36; i.p.31,62; 28,29; i.a.49 anni
C57BL/6J62
(Jackson Laboratories –
B6. La commissione per l' Cg-KitWsh/HNihrJaeBsmGlliJ) Questi topi sono stati incrociati >11 volte sullo sfondo C57BL/6J.
BALB/c65
(C.B6-KitW-sh)
Mcpt5-Cre;
R-DTA 		C57BL/625
(Tg(Cma1-cre) ARoer; B6.129P2-Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Lky/J)		 Marcate riduzioni del peritoneale (98%) e pelle (89-96,5%) MCs, mc mucosa difficilmente esaurirsi Probabile presenza di MC mucose; topi reporter rivela la cancellazione mediata da Cre del transgene YFP "floxed" in ~30% di cellule NK milza66 nessuno
Cpa3Cre/+ C57BL/626
(B6.129P2-Cpa3tm3(icre)Hrr)		 Assenza di MC connettivo-tessuto e mucosa Cpa3 espresso in altri tipi di cellule; numero basofilo ridotto i.v.26
BALB/c26
(B6.129P2/OlaHsd.BALB/c-Cpa3tm3(icre)Hrr)
Cpa3-Cre;
Mcl-1fl/fl 		C57BL/624
(Tg(Cpa3-cre)3Glli; B6;129-Mcl1tm3sjkJ)		 Assenza di MC connettivo-tessuto e mucosa Cpa3 espresso in altri tipi di cellule; aumento dei neutrofili di milza e lieve anemia;
numero basofilo ridotto		 i.d.24;
i.a.49 anni
i.v. (i nostri dati inediti)

Tabella 1: Ceppi di topi con carenze costitutive di MC. Sono disponibili diversi ceppi ditopicon carenza di MC costitutiva dipendente dal kitc-o c-. In linea di principio, tutti questi ceppi possono essere usati per generare topiknock-in" mast cell " (anche se, per quanto ne sappiamo, questo non è stato ancora riportato per Mcpt5-Cre; Topi R-DTA). Tuttavia, ognuno di questi ceppi ha altre anomalie fenotipiche e limitazioni che dovrebbero essere tenute a mente quando si interpretano i risultati ottenuti con questi topi. Alcuni esempi di accinnesto MC di successo possono essere trovati nei riferimenti. (Si tratta di una versione modificata e aggiornata della tabella 1 della rif.9).

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Discussion

Quasi 30 anni dopo la sua descrizioneiniziale 38,l'approccio'mast cell knock-in'continua a fornire preziose informazioni su ciò che i PC possono fare o non possono fare in vivo. Si pensava che le funzioni dei TC fossero limitate al loro ruolo nell'allergia. I dati generati utilizzando l'approccio "mast cell knock-in" hanno cambiato questa visione, fornendo prove che i MC possono, tra le altre funzioni, svolgere ruoli critici nella difesa dell'ospitecontro alcuni agenti patogeni 4,39 o veleno28,31, o possono persino sopprimere determinate risposteimmunitarie 29,34,40.

Nella nostra descrizione del protocollo, abbiamo deciso di concentrarci sulla generazione e l'innesto di MC coltivati derivati dal midollo osseo (BBMCMC), perché un gran numero di queste cellule può essere generato in vitro dal midollo osseo di tipo selvatico o topi mutanti. Tuttavia, le MC possono anche essere coltivate direttamente da cellule staminali embrionali (MC coltivati derivati da cellule staminali embrionali [ESCBC])41 e, se geneticamente compatibili, queste cellule possono anche essere utilizzate per l'innesto in topi a disincrosto mc. Questo approccio alternativo è particolarmente interessante per studiare il ruolo di una proteina la cui carenza induce letalità embrionale nei topi, e quindi per la quale i BBMCMC carenti di questa proteina non possono essere generati. Sia i BBMCMC che gli ESCBC possono anche essere trasdotti in vitro con lentivirus che codificano geni di interesse o shRNA per silenziare i geni di interesse, prima dell'innesto di queste cellule in topi a disaccenti mc31,33.

Di solito usiamo un mezzo 20% condizionato WEHI-3 come fonte di IL-3 per la cultura dei BBMCMC. Tuttavia, può essere utilizzato anche il ricombinante IL-3 (10 ng/ml, come descritto nella fase 1.2.1), e l'aggiunta del fattore di cellule staminali ricombinanti (SCF) al mezzo di coltura può migliorare sostanzialmente il numero di BBMCMCgenerati 42,43. A seconda dello studio, sono stati utilizzati da 10 a 100 ng/ml di SCF ricombinante, oltre all'IL-3, per generare BBMCMC36,44,45. Si dovrebbe tenere presente che i preparati SCF ricombinanti murini disponibili in commercio da diversi fornitori possono differire nella loro potenza nell'influenzare lo sviluppo dei BBMCMC. È anche importante riconoscere che i dettagli dell'approccio utilizzato per generare BBMCMC (ad esempio se si aggiunge SCF ricombinante al supporto contenente IL-3, la durata del periodo delle impostazioni cultura, ecc.)possono influenzare il fenotipo e la funzione di tali cellule. Ad esempio, è stato riferito che i BBMCMC cronicamente esposti alla SCF hanno aumentato i livelli di istamina e alcune proteasi44,46, ma mostrano una marcata attenuazione della degranazione mediata da FcεRI e della produzione di citochine in vitro45. Infine, oltre a IL-3, il mezzo condizionato WEHI-3 contiene molte molecole biologicamente attive che possono influenzare le funzioni MC. I BBMCMC ottenuti con supporto condizionato WEHI-3 possono quindi differire dai BBMCMC ottenuti con IL-3 ricombinante (o con REcombinant IL-3 più SCF). Ci sono stati pochi studi sul fatto che o per quanto tempo tali differenze nei fenotipi di BBMCMC generati in diversi tipi di mezzi di coltura siano mantenute dopo l'innesto delle cellule in diversi siti anatomici in vivo, e ulteriori studi di questo tipo possono essere di interesse. Tuttavia, indipendentemente dalle condizioni di coltura scelte, la stessa ricetta del mezzo di coltura dovrebbe essere utilizzata per generare tutti i BBMCMC da utilizzare per l'innesto in esperimenti da cui i risultati saranno raggruppati per l'analisi. Inoltre, le MC dovrebbero essere coltivate per almeno 4-6 settimane prima del loro innesto in topi a disinnesto mc, al fine di raggiungere una purezza del 95-98%(figura 2). Questo per ridurre la possibilità che la presenza, nelle "popolazioni BMCMC", di cellule ematopoietiche diverse da quelle impegnate nella discendenza mastociticola (che sono presenti nelle colture a intervalli precoci dopo aver posizionato le cellule del midollo osseo in vitro) possa comportare la comparsa di cellule derivate da donatori oltre alle MC neitopi knock-in' delle cellule mastografiche.

Presentiamo qui un protocollo dettagliato per l'innesto di topi mc-carenti con BMCMC di tipo selvatico o mutante per via intraperitoneale (i.p.), per via endovenosa (i.v.) o intradermally (cioè) nella pinna dell'orecchio, poiché queste vie di iniezione sono state utilizzate da molti investigatori. Tuttavia, i BBMCMC sono stati anche innestati con successo nella pelleposteriore 47,nel pedone48,intra-articolarmente49 o intra-cranicamente50,51. Il numero di BBMCMC da innestarsi, così come l'intervallo tra l'innesto e l'esperimento, possono variare a seconda della via di iniezione e dell'organo mirato da innesto(Figura 1). È molto importante rispettare tali intervalli dopo aver innesto i BBMCMC prima di iniziare l'esperimento al fine di concedere tempo sufficiente affinché i BCMCC (che non sono MC completamente maturi) diventino più maturi in vivo. Poiché il contenuto dei mediatori memorizzati nei granuli citoplasmatici dell'MC può continuare ad aumentare nel corso della vita della cellula38,52, per alcuni esperimenti si potrebbe desiderare di aumentare l'intervallo tra l'innesto MC e l'inizio dell'esperimento per valutare la funzione MC.

A seconda della via di iniezione e/o del numero di BBMCMC iniettati, i numeri e/o la distribuzione anatomica dei MC trasferiti adottivamente possono differire da quelli delle corrispondenti popolazioni native mc nei topi di tiposelvatico 12,23,53,54. I topi a basso contenuto di MC innestati i.p. o i.d. con BBMCMC possono avere circa lo stesso numero e distribuzione di MC rispetto alla popolazione mc nativa nei topi di tipo selvatico, nella cavità peritoneale e mesenteria e nel derma, rispettivamente se valutati da 4 a 8 settimane dopo il trasferimento mc12,23. Il trasferimento endovenoso dei BBMCC non porta a normali numeri MC e/o distribuzione nella maggior parte dei tessuti. Per esempio, nella pelle di tali topi i.v.-innestati 'mast cell knock-in' non si trovano o si trovano pochissimi TC. A 4-28 settimane dall'iniezione di BBMCMC in topi a basso consumo di MC, il numero di MC nella trachea è sostanzialmente inferiore a quello dei corrispondenti topi di tipo selvatico. Al contrario, il numero di TC nella periferia del polmone è tipicamente maggiore di quelli dei corrispondenti topi di tiposelvatico 12,23,53,55. Il trasferimento di BBMCMC si traduce anche in alti livelli di MC nella milza, mentre pochissimi MC nativi si trovano tipicamente in questo organo nei topi di tiposelvatico 23,56. È importante sottolineare che i rapporti precedenti hanno dimostrato che l'iniezione di BBMCMC in topi a disinsufficienza MC non riesce a provocare l'innesto delle popolazioni MC in specifici siti anatomici come il midollo spinale, i linfonodio il cuore 54,57. Diversi gruppi hanno anche notato che tale i.v. l'innesto non si traducono nell'innesto della popolazione di MC (MMC) della mucosa intestinale23,58-60. Tali differenze nei numeri MC e/o nella distribuzione dei MC trasferiti adottivamente rispetto ai MC nativi devono essere prese in considerazione nell'interpretazione dei dati ottenuti utilizzando il modello9della cellaa mastdell'MC .

Esistono diversi ceppi di topi a disinnesto mc e la scelta di quale utilizzare in un particolare progetto è importante. itopi mutanti mc-carenti di c- kit, come i topi KitW/W-v o KitW-sh/W-sh, sono stati tradizionalmente utilizzati da molti investigatori. Tuttavia, tali topi soffrono di molte anomalie fenotipiche legate alkitc- oltre alla loro profonda carenza di MC(tabella 1). Negli ultimi anni, diversi ceppi di topi con carenza di MC costitutiva indipendente dalkitc- sono stati segnalati24-26. Alcuni di questi topi presentano anche altre anomalie fenotipiche oltre alla loro carenza di MC(tabella 1),e potrebbero essere scoperte anche anomalie aggiuntive poiché il fenotipo di questi ceppi appena descritti è ancora in fase di studio. Tutti questi topi e alcuni nuovi tipi aggiuntivi di topi a disinnesto mc sono stati recentemente esaminati indettaglio 9,10,13.

Date le limitazioni di ciascuno dei ceppi mc-carenti attualmente disponibili, si consiglia di tentare di testare ipotesi sulla funzione MC utilizzando più di un modello di carenza MC9. Nel nostro laboratorio, generalmente eseguiamo esperimenti pilota in KitW-sh/W-sh e Cpa3-Cre; Topi Mcl-1fl/fl. Se otteniamo risultati concordanti in entrambi i tipi di topi a disinnesto mc, procediamo agli esperimenti di innesto per accertare il ruolo delle MC e valutare i ruoli potenziali di alcuni prodotti derivati da MC. Infine, va notato che diversi ceppi che consentono l'esaurimento induttivo delle MC o la depreazione mediata dalla Cre dei geni "floxed" nei MC sono stati recentemente descritti25,49,61. Questi ceppi sono stati esaminati in dettaglio altrove9,10,13 e rappresentano approcci alternativi promettenti - o complementari - per studiare le funzioni MC in vivo.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

N.G. è il destinatario di borse di studio della "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" francese e della Fondazione Philipp; R.S. è supportato dalla Lucile Packard Foundation for Children's Health e dal numero di premio STANFORD NIH/NCRR CTSA UL1 RR025744; P.S. è sostenuta da una Borsa max Kade della Fondazione Max Kade e dall'Accademia austriaca delle scienze e da una Borsa di studio Schroedinger del Fondo scientifico austriaco (FWF): J3399-B21; S.J.G. riconosce il sostegno dei National Institutes of Health grants U19 AI104209, NS 080062 e del Tobacco-Related Disease Research Program presso l'Università della California; L.L.R. riconosce il sostegno della Arthritis National Research Foundation (ANRF) e della Sovvenzione nazionale per gli istituti sanitari K99AI110645.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25 G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30 G x 1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1% Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03

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Immunologia e infezione Numero 99 c-kit fattoredi cellule staminali FcεRI immunoglobulina E modello di topo trasferimento adottivo immunologia allergia
Analisi delle funzioni delle mastociti <em>in vivo usando</em> <em>topi ' Mast Cell Knock-in</em>'
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Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, … More

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).

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