Summary
イン ビトロ 由来肥満細胞の生成方法、肥満細胞欠損マウスへのそれらの生着、異なる解剖学的部位における生着マスト細胞の表現型、数および分布の分析について述べた。このプロトコルは、 生体内のマストセルの機能を評価するために使用することができます。
Abstract
マスト細胞(MC)は、様々な組織に存在する造血細胞であり、特に皮膚、気道、消化管などの外部環境に曝露される部位に豊富に存在する。IgE依存性アレルギー反応における有害な役割で最もよく知られているMCは、毒や侵入細菌や寄生虫に対するホスト防御の重要なプレーヤーとしても出現しています。MC表現型および機能は、解剖学的位置によって異なる可能性がある微小環境要因、または免疫応答の発達のタイプまたは段階に基づいて影響を受ける可能性がある。このため、MC機能に関する洞察を得るために、インビトロ法よりもインビボアプローチを支持してきました。ここでは、マウス骨髄由来培養MC(BMC)の生成方法、遺伝的MC欠損マウスへの導入、異なる解剖学的部位における養子転移の数と分布の分析について述べた。この方法は、"マストセルノックイン"アプローチと名付けられ、過去30年間、生体内のMCおよびMC由来製品の機能を評価するために広く使用されてきました。近年開発された代替アプローチに照らして、この方法の利点と限界について議論する。
Introduction
マスト細胞(MC)は、多能性骨髄前駆物質1-3から生じる造血細胞である。骨髄の進入に続いて、MCの前駆体は、局所的な成長因子1-3の影響を受けて成熟したMCに発展する様々な組織に移行する。組織常駐型のMCは、皮膚、気道、胃腸管などのホスト環境のインターフェースに戦略的に位置し、外部侮辱に対する第一線の防御線として3-6と動作する。多くの場合、MCは「ベースライン」の表向きの特性と解剖学的位置に基づいてサブ分類されます。マウスでは、「結合組織型」のMC(CTMC)および粘膜MC(MC)1~3,7,8という2種類のMCが記載されている。CTMCは、しばしば、小脳および神経線維の近くに位置し、滑膜腔に存在し、MMCは腸内および呼吸粘膜1-3の上皮内位置を占める。
多くの方法論が、MC9-13の生物学的機能を研究するために適用されてきた。多くのグループは、細胞株(ヒトMCラインHMC114またはLAD215,16など)、インビトロ由来MC(ヒト末梢血由来MC17、マウス骨髄由来など)のいずれかを使用してインビトロアプローチに焦点を当てています。 培養したMC[BCMCs]18、胎児皮膚由来培養MC[FSCCs]19および腹膜細胞由来MC[PCMC]20)または異なる解剖学的部位から単離されたMC。これらのモデルはすべて、MC活性化に関与するシグナル伝達経路など、MC生物学の分子的詳細を研究するために広く使用されています。しかし、MC生物学の重要な側面は、その表現型および機能的特性(例えば、細胞質顆粒プロテアーゼ含有量または異なる刺激に対する応答)が解剖学的位置および微小環境2,7によって変調され得る点である。生体内で遭遇するこのような要因の正確な混合物は、in vitroで再現することが困難な場合があるので、我々は、MC機能9に関する洞察を得るためにin vivoアプローチを使用して好む。
遺伝的MC欠乏症を有する複数のマウス株が存在し、広く使用されているWBB6F1-キットW/W-vまたはC57BL/6-キットW-sh/W-shマウスなど。これらのマウスはKIT(CD117)の発現および/または活性を欠いているが、主MC成長因子幹細胞因子(SCF)21,22の受容体である。その結果、これらのマウスは深いMC欠乏症を有するが、また、c−キット突然変異(WBB6F1-キットW/W-vマウス)またはc-キット発現の減少をもたらす大きな染色体反転の影響(C57BL/6-キットW-sh-C-s)9,122222222222222222222年12月12日に関連する表現型異常を有する。さらに最近では、c-キット-独立した構成MC欠乏症を有するマウスのいくつかの株が24-26に報告されている。これらすべてのマウスおよびいくつかの追加の新しいタイプの誘導可能なMC欠乏マウスは、最近詳細に9,10,13で見直された。
ここでは、マウス骨髄由来培養MC(BMC)の生成方法、MC欠損マウスへの導入、異なる解剖部位における養子転移MCの数と分布の分析について述べた。このいわゆる 「マストセルノックイン」 法は 、生体内のMCおよびMC由来製品の機能を評価するために使用することができます。近年開発された代替アプローチに照らして、この方法の利点と限界について議論する。
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Protocol
すべての動物のケアと実験は、国立衛生研究所のガイドラインに従い、スタンフォード大学の制度的動物ケアと使用委員会の具体的な承認を得て行われました。
1. 骨髄由来培養マスト細胞(BMC)の生成と特性評価
注:ドナーBMCCsは、レシピエントMC欠損マウスと同じ遺伝的背景の骨髄細胞から生成されるべきである。男性由来ドナーBMCは、雌マウスの生着には適していない。女性由来ドナーBMCは、男性と女性の両方のレシピエントに正常に生着します。
- 骨髄抽出.
- 滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を6ウェル培養プレート(1回1個)に注ぎ、氷の上に置きます。
- 解剖器を70%エタノールに浸して殺菌する。
- 二酸化炭素(CO2)吸入によってドナーマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行い、その後、操作部位に70%エタノールをマウスに噴霧する。
- 骨の骨の骨を切断せずに大腿骨、脛骨および脛骨を抽出するために無菌解剖器を使用してください。
- 鉗子で骨を固定しながら、滅菌はさみ(またはメスの刃)を使用して骨からすべての組織を削り取る(そしてフィブラを捨てる)。すべての骨が収集されるまで氷の上にPBSに骨を置きます。
- 滅菌組織培養フード内の残りのステップをすべて実行します。滅菌器具を使用して、鉗子で骨を固定し、髄腔を露出させるために両方の骨を切断する。
- 3 ml注射器および30G針を使用し、冷たい紅潮媒体(Dulbecco修正イーグルミディアム[DMEM]10%胎児子牛血清[FCS、熱不活性化]、2 mM L-グルタミン、1%抗生物質抗ミコティック溶液、50μM β-メルカプトエタノール)を使用して、赤骨髄をペトリ皿に洗い流す。
- 穏やかな吸引と放出を繰り返すことによって、フラッシュされた骨髄細胞クラスターを解負するために同じシリンジを使用してください。
- 各マウスから15ml遠心分離管に大腿骨および脛骨骨髄をプールする。4°Cで5分間、骨髄細胞と遠心分離機を400xgで洗浄するために冷たい紅潮媒体でチューブを充填します。
- BMC文化。
- 上清を除去し、10mlの培養培地でペレット化された骨髄細胞を回収する(DMEMは10%の胎児の子牛血清を補充した[FCS、 [熱不活化]、2 mM L-グルタミン、1%抗生物質抗抗酸溶液、50 μM β-メルカプトエタノールおよび20%WEHI-3細胞調整培地[IL-3の供給源として;代わりに10 ng/mlで組み換えマウスIL-3を使用]。
- 適切なサイズの組織培養フラスコに細胞を入れる(例えば、1匹のマウスのT25、2匹のマウスの場合はT75など)。
- めっき後1~2日後、培地および懸濁細胞(フラスコの底に付着した破片や付着細胞を残す)を新しいフラスコに移し、新鮮な培養培地(10ml/マウス)を加える。
- 次の週の間に、3〜4日毎に細胞を供給する(1つのマウスにつき10mlの培地を加える)。2.5 x 105-1 x 106 細胞/mlの間で細胞密度を維持します。培養フラスコに付着細胞が存在しなくなるまで、非接着性細胞を週に1回新しいフラスコに移す。 インビトロ アッセイまたはMC欠損マウスへの生着に使用する前に細胞の成熟度(下記参照)をテストする。
注: BMC の完全な差別化には 4~6 週間かかります。
- BMCMCの成熟度の評価。
-
フローサイトメトリーを使用する。
- 5 ml ポリスチレンラウンドボトムチューブで、氷冷 FACS バッファー (PBS、 0.5% FCS) でセル(5 x 104-5 x 10 5 セル/条件) を洗浄します。4°Cで5分間400×gで遠心分離機。 吸気上清。
- FACSバッファーに薄い抗マウスCD16/32(クローン93または2.4G2)モノクローナル抗体1:200(2.5 μg/ml)を希釈。各ペレットに10μlを加え、短いボルテックスで再中断します。氷上で5分間インキュベートし、Fc結合をブロックします。
注: 残りのすべてのステップで、直接光からサンプルを保護します。 - 希薄なフィコエリスリン(PE)共役抗マウスFc εRI α(クローンMAR-1)1:200(1 μg/ml)およびフルオレセインイソチオシアネート(FITC)共役抗マウスキット(CD117; クローン2B8)1:200(2.5μg/ml)(「染色溶液」)、またはFACSバッファ内のそれぞれの標識アイソタイプ対照抗体(「アイソタイプ制御溶液」)
- ブロックされた細胞の半分をステップ1.3.1.2)から追加のポリスチレン丸底管に分割し、1つのチューブに20 μlの「染色液」を、もう一方のチューブに「アイソタイプ制御溶液」を20 μl加えます。氷の上で30分インキュベート。
- 400 x g で 3 ml の氷冷 FACS バッファーと遠心分離機を 5 °C で 5 分間追加します。 上清を捨て、ヨウ化プロピジウム1μg/ml(PI、死細胞の同定用)を含む300μl FACSバッファー内のペレットを再懸濁します。フローサイトメトリー解析に進みます( 図2Aを参照)。
- トルイジンブルー染色を用いた。
- 1 x 105 細胞をPBSで1回、400 x gで400 x gで遠心分離して室温で5分間洗浄し、PBS 200 μlで細胞を吸引して再懸濁します。
- 細胞懸濁液を顕微鏡スライドに取り付けた準備された細胞漏斗に移し、細胞遠心分離機(40xg)を用いて細胞遠心分離を進める。
- 空気乾燥スライドは10分間、PAPペンを使用して細胞の周りにワックスサークルを描きます。細胞を覆うために0.1%トルイジンブルー溶液を追加します。1分間インキュベートします。水道水でスライドを1分間洗浄し、10分間空気乾燥スライドします。
- 取り付け媒体を使用したカバースリップセル。軽顕微鏡分析に進みます( 図2Bを参照)
-
フローサイトメトリーを使用する。
2. 肥満細胞欠損マウスのBCMCによる生着
- 皮内(i.d.)注射による耳の生着。
注:MC欠損マウスの耳のピナエへのBMCCCsの採用移行については、耳のピナあたり1 x 106 細胞(合計2 x 106 細胞)の2回の注射を行うことをお勧めします。MC欠損マウスの耳のピナエへのBCMCの皮内生着は、受動皮膚アナフィラキシー(PCA)24,27、宿主防御28、および慢性過敏症(CHS)反応29,30を含むいくつかのモデルにおいて多くの研究者によって使用されてきた。- セルを 4 x 107 の BMCCs/ml (1 x 106 BMCCcs/ 25 μl) で冷たい DMEM でカウントおよび再懸濁します。BMCMC溶液を30G針を装備した1mlシリンジに移します。注射まで氷の上に保管してください。
- イゾフルラン(2.5%v/v)を使用して4〜6週齢のMC欠損マウスを麻酔する。つま先ピンチで麻酔の深さを確認し、指示された場合はイオブルランを調整し、手順全体を通して呼吸とつま先のピンチ応答を監視し続けます。眼の乾燥を防ぐためにQチップで眼科軟膏を塗布してください。
- 人差し指で、耳のピナの背側面に垂直圧力を加え、腹側の顔を露出して伸ばします。
- 耳のピナの腹側面の2つの異なる部位にBMCMC溶液の2つの25 μl i.d.注射を行い、耳の真ん中に最初の注射を行い、耳の先端に向かって2回目の注射を行います。 インビボ 実験を行う前に、i.d.の生着後4〜6週間待ちます。
注:我々の経験では、その時点で、耳のピナの中央部の真皮のMC/mm2の数は、一般的に野生型マウスの対応する位置と同様であるのに対し、耳のピンネの周囲のMC/mm2の数は、典型的には、対応する野生型マウス27,28の中のMC/mm2の数よりもかなり低い。このようなMC生着マウスを用いた実験を設計する際には、このことを念頭に置く必要があります(例えば、MC機能に影響を及ぼす可能性のある薬剤を耳のピナエの中央部に注入し、そのような治療の効果の分析もその領域に焦点を当てる必要があります)。
- 腹腔内注入による腹腔の生着(すなわち)注射。
注:MC欠乏マウスの腹腔へのBMCCCsの導入は、マウスあたり2 x 106 細胞の1回の注入を必要とする。このようなi.p.MMC欠損マウスへのi.p.注射は、様々なモデルにおける腹膜MCの役割を研究するために多くのグループによって使用されてきたが、毒素31 または細菌敗血症32,33に対する宿主防御のモデルを含む。- 適切な数のセルをカウントし、冷たいDMEMで1 x 107 のBMCCS/ml(2 x 106 BMCCcc/ 200 μl)で再懸濁します。BMCMC溶液を25G針を装備した1mlシリンジに移します。注射まで氷の上に保管してください。
- 4-6週齢のMC欠損マウスの腹腔内に200μl BMCMc溶液を1回注入します。 インビボ 実験を行う前に、i.p.の生着後4〜6週間待ちます。
- 静脈注射による生着(i.v.)注射。
注:MC欠損マウスへのi.v.インジェクションによるBMCCsの導入は、マウスあたり5 x 106 細胞の1回の注入を必要とする。MC欠損マウスへのBMCの静脈内(i.v.)注射は、膀胱感染34、喘息35、肺線維症36、および抗体媒介性関節炎37のモデルを含む様々な疾患モデルにおけるMCの役割を研究するために多くのグループによって使用されてきた。- 適切な数のセルをカウントし、コールド DMEM で 2.5 x 10 7 BMCCs/ml (5 x 10 6 BMCCs/200 μl) で再懸濁します。BMCMC溶液を30G針を装備した1mlシリンジに移します。注射まで氷の上に保管してください。
- イゾフルラン(2.5%v/v)を使用して4〜6週齢のMC欠損マウスを麻酔する。つま先ピンチで麻酔の深さを確認し、指示された場合はイオブルランを調整し、手順全体を通して呼吸とつま先のピンチ応答を監視し続けます。眼の乾燥を防ぐためにQチップで眼科軟膏を塗布してください。
- MC欠損マウスの尾静脈(または、あるいは、レトロ軌道静脈)に200 μlのBMCMC溶液を1回注入します。 インビボ 実験を行う前に、i.v.の生着後12週間待ちます。
3. 移植されたマスト細胞欠損マウスの分析
- 耳の生着分析。
- 実験の終わりに、マウスをCO2 吸入し、続いて子宮頸部脱臼によって安楽死させる。
- 耳のピンネーを分離し、4°Cで一晩10%(vol/vol)緩衝ホルマリンに固定します。 パラフィンに固定された耳のピナエを埋め込み、耳のピネの4μmのセクションをカットし、ガラススライドにマウントします。
- スライドを室温で1分間0.1%のトルイジンブルー溶液で染色します。水道水でスライドを1分間洗浄し、室温で10分間空気乾燥スライドします。
- 取り付け媒体を使用してカバースリップスライドし、次に光顕微鏡を使用してピンネー切片当たりの生着MCの数をカウントします。生着マウス と野生型 マウスの皮膚におけるMCの割合と分布を比較することにより、生着効率を評価する。
- 腹腔生着解析。
- 腹腔内の肥満細胞数の評価
- 実験の終わりに、マウスをCO2 吸入し、続いて子宮頸部脱臼によって安楽死させる。腹腔を壊さずに、慎重にマウスの腹側皮を除去する。
- 25G針を装着した5mlシリンジを使用して、腹腔内に5mlの冷たいまたは室温のPBSを注入します。冷たいPBSを使用して腹膜細胞を活性化するリスクを減らします(これは腹膜MC脱顆粒または腹膜洗浄液中のいくつかのMC由来製品のレベルを評価する際に非常に重要です)。腹膜細胞を収穫するために20秒間腹部のマッサージを行います。
- 22G針を装着した5mlシリンジを用いて腹膜洗浄をゆっくりと吸引する。吸引洗浄の量を記録します(注入された体積の80%まで回復すると予想されます)。
- 腹膜洗浄液を5mlポリスチレン丸底管に移し、遠心分離機を400 x gで4°Cで5分間移動させます。 吸気上清。400 μl の冷たい PBS でペレットを回収します。
- ヘモサイトメーターチャンバーを使用した腹膜細胞の総数をカウントする。フローサイトメトリー分析(ステップ1.3.1で説明されているように)に細胞懸濁液の半分を使用して、腹腔内の生着MCの割合およびマーカー発現を評価する。腹膜細胞の総数に MC の割合を掛けて、腹膜 MC の絶対数を求めます。
- ステップ1.3.2.2に記載されているように、残りの細胞で細胞遠心分離を行う。空気乾燥スライドは室温で10分間滑り、PAPペンを使用して細胞の周りにワックスサークルを描きます。
- 希釈されていないMay-グリュンヴァルト染色液で細胞を5分間覆い、続いて室温で5分間PBSで洗浄します。ギムサ染色液を1:20に脱イオン水で覆い、室温で20分間インキュベートします。2回の水道水で2回洗浄し、その後、空気乾燥スライド。
- 取り付け培地を用いたカバースリップ細胞、および(少なくとも400個の細胞を計って)光顕微鏡を用いて、生着したMCの割合を計算する。生着マウス と 野生型マウスの腹膜洗浄におけるMCの割合を比較することにより、生着効率を評価する。
- 腸間膜窓における肥満細胞の評価
- ステップ3.2.1に記載の腹膜洗浄に続いて、腹膜を切開してマウスの腸管を露出させる。スライドにマウスごとに4〜5個の腸間膜窓を配置します。
- カルノイ溶液(エタノール、クロロホルム、氷酢酸の3:2:1 vol/vol/vol)で1時間スライドを室温で固定します。空気乾燥スライドと腸を取り除きます (固定の腸間膜窓はスライドに取り付けられたままです)。
- Csaba(アルシアブルー/サフラニンO)染色液で室温で20分間の調製物を染色します。
- 500mlのCsabaステインを作るために、1M酢酸ナトリウム溶液100mlを1MHClの120mlと混合して500mlの酢酸緩衝液を調製し、脱イオン水で500mlまで調製し、pHを1.42に調整します。次に、90mgのサフラニンを溶解し(赤で「成熟したMC」を識別する)、1.8gアルシアンブルー(青で「未熟なMC」を識別する)、2.4gの硫酸アンモニウムNH4Fe(SO4)2を500mlの酢酸緩衝液に溶解する。
- 取り付け媒体を使用してカバースリップスライドし、次に、光顕微鏡を使用して、腸間膜窓あたりの生着MCの数をカウントします。生着マウス と野生型 マウスの腸間膜窓におけるMCの割合と分布を比較することにより、生着効率を評価する。
- 腹腔内の肥満細胞数の評価
- I.v. 生着分析.
- 実験の最後に、CO2 吸入によってマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼、および目的の組織(例えば 肺、皮膚または脾臓)を収穫し、4°Cでホルマリンを10%(vol/vol)緩衝したホルマリンで一晩固定する。
- パラフィンに固定組織を埋め込み、4μmのセクションをカットし、ガラススライドに取り付けます。スライドを室温で1分間0.1%のトルイジンブルー溶液で染色します。水道水でスライドを1分間洗浄し、10分間空気乾燥スライドします。
- 取り付け媒体を用いたカバースリップスライド、および光顕微鏡を用いて、組織切片当たりの生着MCの数と分布を評価する。
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Representative Results
「マスト細胞ノックイン」アプローチの概要を 図1に示し、BMCの生成、MC欠乏マウスに生着する細胞の数(実験計画に基づいて示された数を変更することができます)、および注入部位に応じて着実と実験の間隔(この場合は異なる場合)が含まれています。 例えば、MC細胞質顆粒中の保存されたメディエーターの含有量は、時間38と共に着実に増加する。 図2 は、IL-3の供給源として20%WEHI-3細胞条件培地に含有するDMEM培地における1、15および45日後のBMCの代表的なフローサイトメトリー分析およびトルイジンブルー染色を示す。なお、45日間培養したBMCMCは95%純粋で、多数の細胞質顆粒を含み、生着実験に使用できますが、15日間培養した細胞は生着に適していません。 図3 は、i.d.生着後4週間(図3A)、腸間膜窓(図3B)および腹腔(図3C)i.p.生着後6週間、およびi.vの生着後12週間後の肺(図3D)における代表的な生着を示す。
図1: 'インビボでのMC機能の分析のためのマストセルノックイン'マウスモデル.野生型または変異骨髄由来培養MC(BMC)は、IL-3の供給源として少なくとも4〜6週間の骨髄細胞をIL-3の供給源として(または10ng/ml組換えマウスIL-3を含む培地で)生成される。これらのBMCは、MC欠乏マウスに生着し、いわゆる「マスト細胞ノックイン」マウスを作成することができます。BMCは、様々なMC集団の局所(すなわち、i.p.)または全身(i.v.)再構成のための異なる経路(静脈内[i.v.]、腹腔内[i.p.]またはイントラル[i.d.])を介して注入することができる。様々な生物学的応答におけるMC機能は、野生型マウス、MC欠損マウスおよび'肥満細胞ノックイン'マウスの応答を比較することによって分析することができる。特定のMC産物の寄与は、そのような産物の遺伝的に改変された形態を欠いている、または発現するマウスに由来する野生型BMCCccまたはBMCCccのいずれかで生着した「マスト細胞ノックイン」マウスの応答を比較することによって分析することができる。(これは ref.12の図 1の修正版です。
図2:フローサイトメトリーおよび顕微鏡によるBMCMC製剤の純度の評価(A)1日(左パネル)の表面におけるFcεRIαおよびKIT(CD117)発現の代表的なフローサイトメトリー分析、15日(中央パネル)および45日(右パネル)古いBMCMCs.プロピジウムヨウ化素体(PI)陽性死細胞を分析から除外した(図示せず)。数字は、青い四角形にゲートされたFcεRIα+KIT+ BMCCCCの割合を示します。(B)トルイジンブルーで染色されたBMCの代表的な写真、下パネルは黒色点線で定義された上パネルの領域の倍率である。バー = 10 μm。
図3:様々な解剖学的部位におけるMCの生着の効率の評価(A)トルイジンブルーで染色された4μmの耳ピナエセクションの代表的な写真。(B) サフラニン/アシアンブルー('Csaba'染色)で染色された腸間窓の代表的な写真。(C) 腹膜洗浄液中に存在し、May-グリュンヴァルト・ギムサ(MGG)で染色された細胞の代表的な写真。(D)トルイジンブルーで染色された4μmの肺切片の代表的な写真。バー = 50 μm(A、B、D)または 20 μm (C) 写真は、C57BL/6野生型マウス(上パネル)、MC欠乏キットW-sh/W-shマウス(中央パネル)、野生型BMCCCsを生着させたMC欠乏マウス:BMCCsキットW-sh/W-sh(下部パネル)のものです。MC は矢印で示されます。
| マウス | 使用可能な背景 |
MC番号 (定常状態) |
その他の型(9,10,13でレビュー) | BMCとの生着の報告 |
| キットW/W-v |
(WB/Re x C57BL/6)F1 (ジャクソン研究所 – WBB6F1/J-キットW/キットW-v/J) |
結合組織および粘膜MCの不存在 | 貧血、好塩基球および好中球数の減少、カハルのメラノサイトおよび間質細胞の欠乏、生殖不能など。 | i.v.35,37;i.p.31,62;i.d.28,29;i.c.50,51;i.a.49;fp.i.63 |
| キットW-sh/W-sh |
C57BL/6 (ジャクソン研究所 – B6.Cg-KitW-sh/HNihrJaeBsmJ) ジャクソン研究所で行われた一塩基多型解析は、これらのマウスがC57BL/6遺伝子の背景を約87%だけであることを示している。 |
結合組織および粘膜MCの不存在 | 好塩基球および好中球数の中程度の増加、骨髄由来サプレッサー細胞64の数の増加、カハルのメラノサイトおよび間質細胞の欠乏 | i.v.23,34-36;i.p.31,62;i.d.28,29;i.a.49 |
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C57BL/6J62 (ジャクソン研究所 – B6.Cg-KitWsh/HNihrJaeBsmGlliJ) これらのマウスは、C57BL/6Jバックグラウンドで>11回バッククロスされています。 |
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バルブ/c65 (C.B6キットW-sh) |
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マクプ5-クレ; R-DTA |
C57BL/625 (Tg(Cma1-cre) アロア;B6.129P2-Gt(ローザ)26ソートm1(DTA)Lky/J) |
腹膜の著しい減少(98%)と皮膚 (89-96.5%)MC、粘膜MCが枯渇する可能性は低い | 粘膜の MC の可能性があります。レポーターマウスは、約30%脾臓NK細胞における「フロックス」YFPトランスジーンのCre媒介的欠失を明らかにする66 | 何一つ |
| Cpa3クレ/+ |
C57BL/626 (B6.129P2-Cpa3tm3(アイクレ)Hrr) |
結合組織および粘膜MCの不存在 | 他の細胞タイプで表現されるCpa3;減らされた好塩基球数 | i.v.26 |
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バルブ/c26 (B6.129P2/オラフスド.BALB/c-Cpa3tm3(アイクレ)Hrr) |
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Cpa3-クレ; Mcl-1fl/fl |
C57BL/624 (Tg(Cpa3-cre)3Glli;B6;129-Mcl1tm3sjkJ) |
結合組織および粘膜MCの不存在 |
他の細胞タイプで表現されるCpa3;脾臓好中球の増加 & 軽度の貧血; 減らされた好塩基球数 |
i.d.24; i.a.49 i.v. (未公開データ) |
表1:構成的なMC欠乏を有するマウスの株。c-キット依存またはc-キット-独立した構成MC欠乏を有するマウスのいくつかの株が利用可能である。原則として、これらの株はすべて「マスト細胞ノックイン」マウスを生成するために使用することができます(ただし、私たちの知る限りでは、これはMcpt5-Creにはまだ報告されていません。R-DTAマウス)。しかしながら、これらの株のそれぞれは、これらのマウスで得られた結果を解釈する際に留意すべき他の石性異常および制限を有する。成功したMCの着粉の例は、参照で見つけることができます。(これは ref.9から表 1の変更および更新されたバージョンです。
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Discussion
最初の説明 38 から約30年が経過したところで、"マスト セル ノックイン" アプローチは、MC が生体内で何ができるか、または何ができないかについての貴重な情報を提供し続けています。MCの機能は長い間アレルギーにおけるその役割に限定されると考えられていた。「マスト細胞ノックイン」アプローチを用いて生成されたデータは、MCが他の機能の中で、特定の病原体4,39または毒28,31に対する宿主防御において重要な役割を果たすことができるという証拠を提供することによって、この見解を変えたか、あるいは特定の免疫応答を抑制することができる29,34,40。
我々のプロトコル記述では、骨髄由来培養MC(BMC)の生成と生着に焦点を当てることにした。 しかし、MCは胚性幹細胞(胚性幹細胞由来培養MC[ESCCc])41から直接培養することもでき、また、遺伝的に適合する場合には、これらの細胞をMC欠損マウスへの生着にも使用することができる。この代替アプローチは、欠乏がマウスの胚致死性を誘発し、したがってこのタンパク質に対するBMCMC欠乏が生成できないタンパク質の役割を研究する上で特に興味深い。また、MCCMCおよびESCPCの両方を、目的の遺伝子をコードするレンチウイルスまたはshRNAを用いて目的の遺伝子をサイレンチにして、MC欠損マウス31,33にこれらの細胞を生着させる前に、インビトロで導入することもできる。
我々は、通常、BMCの培養のためのIL-3の供給源として20%WEHI-3コンディション培地を使用する。しかし、組換え型IL-3(10ng/ml、ステップ1.2.1に記載されているように)も使用することができ、また、培養培地に組換え幹細胞因子(SCF)を添加すると、42,43を生成するBMCMCの数を実質的に増強することができる。研究に応じて、10〜100 ng/mlの組換えSCFが使用されており、IL-3に加えて、BMC36,44,45を生成する。市販のマウス組換えSCF製剤は、異なるサプライヤーからBMCの開発に影響を与える際の効力が異なる可能性があることを覚えておいてください。また、BMCMCを生成するために使用されるアプローチの詳細(IL-3含有培地に組換えSCFを添加するかどうか、培養期間の持続時間など)は、そのような細胞の表現型および機能に影響を与える可能性があることを認識することも重要である。例えば、SCFに慢性的に曝露したBMMCはヒスタミンおよび特定のプロテアーゼのレベルを44,46に増加させたが、Vitro45におけるFcεRI媒介脱顆粒およびサイトカイン産生の顕著な減衰を示す。最後に、IL-3に加えて、WEHI-3コンディション培地には、MC機能に影響を与える可能性のある多くの生物学的活性分子が含まれています。したがって、WEHI-3コンディション培地で得られたBMCは、組換えIL-3(または組換えIL-3プラスSCF)で得られるBMCMCと異なる可能性があります。異なるタイプの培養培地で生成されたBhenocsのこのような違いが、生体内の異なる解剖学的部位への細胞の生着後に保持されるかどうか、またはどのくらいの期間の研究が行われておらず、このタイプの追加研究が興味深い場合がある。しかし、選択した培養条件に関係なく、同じ培養培地レシピを使用して、結果を分析のためにプールする実験で生着に使用されるすべてのBCMCを生成する必要があります。さらに、MCは、95〜98%の純度に達するために、MC欠損マウスに生着する前に少なくとも4〜6週間培養されるべきである(図2)。これは、「BMCMC集団」において、マスト細胞系統(骨髄細胞を体液中に置いた後の早期に培養物に存在する)にコミットするもの以外の造血細胞の存在が「マスト細胞ノックイン」マウスのMCに加えてドナー由来細胞の出現をもたらす可能性を減らすためである。
ここでは、MC欠乏マウスを野生型または変異型BMCMCを腹腔内(i.p.)、静脈内(i.v.)またはイントトレーダーマ(i.d.)を耳のピナに生着するための詳細なプロトコルを提示する。しかしながら、BCMCsは、後方皮膚47に生着しても正常に、フットパッド48、関節内49または口蓋内50,51に生着する。生着するBMCMCの数は、生着と実験の間隔と同様に、注入の経路と着生する臓器の標的となる器官によって異なる場合がある(図1)。実験を開始する前にBMCMCを移植した後、そのような間隔を尊重することは、BMCC(完全には成熟していないMC)が生体内でより成熟するのに十分な時間を確保するために非常に重要である。MCの細胞質顆粒に格納されたメディエーターの含有量は、細胞の寿命38,52の過程で増加し続けることができるので、特定の実験のためにMCの生着とMC機能を評価するための実験開始の間隔を長くしたいかもしれません。
注射経路および/または注入されるBMCの数に応じて、養子に移されたMCの数および/または解剖学的分布は、野生型マウス12、23、53、54の対応するネイティブMC集団のものと異なる場合がある。MC欠損マウスは、MC転送12,23後4~8週を評価した場合、野生型マウス、腹腔および腸間膜および真皮における天然MC集団と同じ数およびMCの分布とほぼ同じ数を有することができる。BMCの静脈内移動は、ほとんどの組織において正常なMC番号および/または分布を招かない。例えば、i.v.-engrafted '肥満細胞ノックイン'マウスの皮膚には、まったくまたは非常に少数のMCが見つからない。MC欠損マウスへのBMCCCcのi.v.注射後4〜28週で、気管内のMCの数は、対応する野生型マウスのMCよりも実質的に少ない。対照的に、肺の周辺におけるMCの数は、典型的には、対応する野生型マウス12、23、53、55のそれらよりも大きい。I.v. BMC の転送は脾臓内の MC の高レベルにもなりますが、野生型マウス23,56では、この器官に通常見られるネイティブの MC はごくわずかです。重要なことに、以前の報告は、MC欠損マウスへのMCCMCのi.v.インジェクションが脊髄、リンパ節または心臓54,57などの特定の解剖学的部位におけるMC集団の生着をもたらすことに失敗することを示した。いくつかのグループはまた、このようなi.v.の生着は腸粘膜MC(MMC)集団23,58-60の生着をもたらさないことを指摘している。MC のマスト セル ノックイン モデル9を使用して取得したデータを解釈する場合、MC 番号や、養子に転送された MCとネイティブの MC の分布の違いについて考慮する必要があります。
MC欠損マウスの株がいくつか存在し、特定のプロジェクトで使用するマウスを選択することが重要です。キットW/W-vやキットW-sh/W-shマウスなどのcキット変異MC欠損マウスは、伝統的に多くの研究者によって使用されてきた。しかしながら、このようなマウスは、それらの深いMC欠乏症の横に多くのc−キット関連の形素異常に苦しむ(表1)。近年、c-キット-独立した構成MC欠乏症を有するマウスのいくつかの株が24-26に報告されている。これらのマウスの中には、MC欠乏症の他の表現型異常(表1)を示すものもあり、新たに記載された株の表現型がまだ調査中であるため、さらなる異常も発見される可能性がある。これらすべてのマウスおよびいくつかの追加の新しいタイプのMC欠乏マウスは、最近詳細に9,10,13で見直された。
現在利用可能なMC欠損株のそれぞれの制限を考えると、MC欠乏症の複数のモデルを用いてMC機能に関する仮説をテストすることをおすすめします。当研究室では、一般的に キットW-sh/W-sh および Cpa3-Creでパイロット実験を行います。Mcl-1fl/fl マウス。MC欠損マウスの両方で一致する結果を得た場合、我々は、MCの役割を確認し、特定のMC由来製品の潜在的な役割を評価するために、生着実験に進みます。最後に、MCのMCまたはCreリコンビナーゼ媒介性のMCの「フロクス」遺伝子の欠失を可能にするいくつかの株も最近25,49,61に記載されている点に留意すべきである。これらの株は、他の場所で詳細に見直されています9,10,13 そして有望な代替を表しています - または補完的な - vivoでMC機能を研究するためのアプローチ.
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
N.G.はフランスの「フォンダシオンは、ラ・レシェルシュ・メディカルFRMを注ぐ」とフィリップ財団からのフェローシップの受領者です。R.S.は、ルシル・パッカード小児健康財団とスタンフォードNIH/NCRR CTSA賞番号UL1 RR025744によってサポートされています。P.S.はマックスケイド財団のマックスケイドフェローシップとオーストリア科学アカデミー、オーストリア科学基金(FWF):J3399-B21のシュレーディングフェローシップによってサポートされています。S.J.G.は、国立衛生研究所の助成金U19 AI104209、NS 080062、およびカリフォルニア大学のタバコ関連疾患研究プログラムからの支援を認めています。L.L.R.は、関節炎国立研究財団(ANRF)と国立衛生研究所助成金K99AI110645からの支援を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning cellgro | 30-004-Cl | |
| 3 ml Syringe | Falcon | 309656 | |
| 35 mm x 10 mm Dish | Corning cellgro | 430588 | |
| 5 ml Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | 352058 | |
| Acetic Acid Glacial | Fisher Scientific | A35-500 | |
| Alcian Blue 8GX | Rowley Biochemical Danver | 33864-99-2 | |
| Allegra 6R Centrifuge | Beckman | ||
| Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified | eBioscience | 14-0161-81 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M7522 | |
| BD 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) Needles | BD Precision Glide Needle | 205155 | |
| BD 25 G 5/8 Needles | BD Syringe | 305122 | |
| BD 30 G x 1/2 Needles | BD Precision Glide | 305106 | |
| Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352097 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cytoseal 60 Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Cytospin3 | Shandon | NA | |
| DakoCytomation pen | Dako | S2002 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Corning cellgro | 15-013-CM | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E 7023-500ml | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma Aldrich | F4135-500ml | |
| FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control | eBioscience | 14-4031-82 | |
| Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) | eBioscience | 11-1171-82 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Giemsa Stain Modified | Sigma Aldrich | GS-1L | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| May-Grunwald Stain | Sigma Aldrich | MG-1L | |
| Multiwell 6 well plates | Falcon | 35 3046 | |
| Olympus BX60 Microscope | Olympus | NA | |
| Paraplast Plus Tissue Embedding Medium | Fisher Brand | 23-021-400 | |
| PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control | eBioscience | 12-4888-81 | |
| Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) | eBioscience | 12-5898-82 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | eBioscience | 00-6990-50 | |
| Recombinant Mouse IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Safranin-o Certified | Sigma Aldrich | S8884 | |
| Tissue culture flasks T25 25 cm2 | Beckton Dickinson | 353109 | |
| Tissue culture flasks T75 75 cm2 | Beckton Dickinson | 353110 | |
| Toluidine Blue 1% Aqueous | LabChem-Inc | LC26165-2 | |
| Recombinant Mouse SCF | Peprotech | 250-03 |
References
- Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
- Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
- Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
- Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
- Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
- Galli, S. J. Mast cells as 'tunable' effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
- Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
- Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
- Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models - Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
- Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
- Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
- Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
- Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
- Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
- Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
- Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
- Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
- Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
- Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
- Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
- Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
- Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
- Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
- Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
- Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
- Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
- Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
- Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
- Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
- Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
- Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
- Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
- Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
- Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
- Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
- Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
- Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
- Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
- Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
- Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
- Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
- Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
- McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
- Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
- Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
- Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
- Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
- Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
- Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
- Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
- Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
- Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
- Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
- Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
- Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
- Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
- Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
- Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
- Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. 'Sash' mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
- Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
- Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).
