Summary
우리는 체외 유래 마스트 세포의 생성을 위한 방법, 유방 세포 결핍 마우스로그들의 이식, 및 다른 해부학 적인 사이트에 이식된 유방 세포의 표현형, 숫자 및 분포의 분석을 기술합니다. 이 프로토콜은 생체 내에서 마스트 세포의 기능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
비만 세포 (MC)는 다양한 조직에 상주하는 조혈 세포이며, 특히 피부, 기도 및 위장관과 같은 외부 환경에 노출 된 부위에 풍부합니다. IgE 의존성 알레르기 반응에서 해로운 역할로 가장 잘 알려진 MC들은 독과 침입 하는 박테리아와 기생충에 대 한 호스트 방어에 중요 한 선수로 등장 했다. MC 표현형 및 기능은 해부학적 위치에 따라 다를 수 있는 미세 환경적 요인및/또는 면역 반응의 발달의 유형 또는 단계에 따라 영향을 받을 수 있다. 이러한 이유로, 우리와 다른 MC 기능에 대 한 통찰력을 얻기 위해 체 외 메서드를 통해 생체 내 접근에 선호 했다. 여기서는 마우스골수 유래 배양MC(BMCMC), 유전자 MC-결핍 마우스로의 입양 이송, 양상에서 입양된 MC의 수 및 분포 분석 등을 설명하고 있다. '마스트 셀노크인' 접근법이라는 이름의 이 방법은 지난 30년 동안 MC와 MC 파생 제품의 기능을 생체내에서평가하는 데 광범위하게 사용되어 왔다. 우리는 최근 몇 년 동안 개발 된 대체 접근 방식에 비추어이 방법의 장점과 한계에 대해 논의합니다.
Introduction
비만 세포(MC)는 다능성 골수선조1-3에서발생하는 조혈 세포이다. 골수 회귀에 이어 MC들은 지역성장인자의영향으로 성숙한 MC로 발전하는 다양한 조직으로 이주한다. 조직 거주자 MC는 피부, 기도 및 위장관과 같은 호스트 환경 인터페이스에 전략적으로 위치하며, 외부 모욕에 대한 방어의 첫 번째 선으로행동합니다 3-6. MC는 종종 자신의 "기준"표형 특성과 해부학 위치에 따라 하위 분류된다. 마우스에서는 MC의 두 가지 유형이 설명되었습니다 : "결합 조직 형" MC (CTMC) 및 점막 MC (McC)1-3,7,8. CTMC는 종종 정맥 과 신경 섬유 근처에 위치하고, 혈청 구멍에 거주, MmCs는 창자 및 호흡점막1-3의상피 위치를 차지하는 동안.
9-13MC의생물학적 기능을 연구하기 위해 수많은 방법론이 적용되었다. 많은 그룹은 세포주(인간 MC 라인 HMC114 또는 LAD215,16)를사용하여 체외 접근법에 초점을 맞추고 있으며, 체외 유래 MC(예: 인간 말초 혈액 유래 MC17)또는 마우스 골수 유래 배양MC [BMCMC]18,태아 피부 유래 배양 MC [FSCmC]19 및 수막 세포 유래 MC [PCMC]20)또는 다른 해부학 적 사이트에서 전 생체 외 격리 MC. 이러한 모든 모델은 MC 활성화에 관여하는 신호 경로와 같은 MC 생물학의 분자 세부 사항을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 그러나, MC 생물학의 중요한 측면은 그들의 표현성 및 기능적특성(예를 들어,세포질 과립 프로테아제 함량 또는 다른 자극에 대한 반응)이 해부학적 위치 및 미세환경에 의해 변조될 수 있다는 것이다2,7. 생체 내에서 발생하는 이러한 요인의 정확한 혼합물은 시험관 내에서재현하기 어려울 수 있기 때문에, 우리는 MC 기능에 대한 통찰력을 얻기 위해 생체 내 접근 방식을 사용하는 것을선호9.
널리 사용되는 WBB6F1-키트 W/W-v 또는 C57BL/6-키트 W-sh/W-sh 마우스와 같은 유전 MC 결핍을 가진 몇몇 마우스 긴장이 존재합니다. 이들 마우스는 KIT(CD117)의 발현 및/또는 활성이 부족하며, 주 MC 성장 인자 줄기 세포 인자(SCF)21,22에대한 수용체가 부족하다. 그 결과, 이들 마우스는 심오한 MC 결핍을 가지고 있지만, 또한c-키트 돌연변이(WBB6F1-키트 W/W-v 마우스)와 관련된 추가적인 표현성 이상이 있거나 큰 염색체 반전의 영향으로 c-키트 발현(C57BL/6-키트 W-sh/W-sh/W-sh)을 감소시키는 효과가 있다. 최근에는c-kit-독립적인구성 MC 결핍을 가진 마우스의 몇몇 변종은24-26보고되었다. 이러한 모든 마우스와 유도 할 수없는 MC-결핍 마우스의 몇 가지 추가 새로운 유형은 최근 자세히 검토되었습니다9,10,13.
여기서는 마우스골수 유래 배양형 MC(BMCMC) 생성, MC-결핍 마우스로의 입양 전달, 양상분석, 양상분석 등의 방안을 설명하고 있다. 이른바 '마스트 셀 노크인' 방법을 사용하여 MC및 MC 파생 제품의 기능을 생체 내에서 평가할 수 있다. 우리는 최근 몇 년 동안 개발 된 대체 접근 방식에 비추어이 방법의 장점과 한계에 대해 논의합니다.
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Protocol
모든 동물 관리 및 실험은 건강의 국가 학회의 지침과 스탠포드 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 특정 승인을 준수하여 수행되었다.
1. 골수 유래 배양 돛대 세포의 생성 및 특성화 (BMCMC).
참고: 기증자 BMCMC는 받는 사람 MC-결핍 마우스와 동일한 유전 배경의 골수 세포에서 생성되어야 합니다. 남성 유래 기증자 BMCMC는 여성 마우스의 이식에 적합하지 않습니다. 여성 유래 기증자 BMCMC는 성공적으로 남성과 여성 받는 사람 모두에 이식합니다.
- 골수 추출.
- 멸균 인산염 완충식식염(PBS)을 6개의 웰 배양판(마우스당 1음)에 붓고 얼음 위에 놓습니다.
- 해부 기기를 70% 에탄올에 담그면 멸균을 위해 몸을 담그십시오.
- 이산화탄소(CO2)흡입에 의해 기증자 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구로 마우스를 분사한 다음 조작 부위에 70%의 에탄올로 마우스를 분사합니다.
- 멸균 해부 기구를 사용하여 뼈 에피피를 자르지 않고 대퇴골, 경골 및 비골 뼈를 추출하십시오.
- 집게로 뼈를 고정하는 동안 멸균 가위 (또는 메스 블레이드)를 사용하여 뼈에서 모든 조직을 긁어 내고 비골을 버립니다. 모든 뼈가 수집될 때까지 PBS에 뼈를 얼음 위에 놓습니다.
- 멸균 조직 배양 후드에 남아있는 모든 단계를 수행합니다. 멸균 기구를 사용하여 집게로 뼈를 고정하고 두 표피를 잘라 수질 구멍을 노출시합니다.
- 3ml 주사기와 30 G 바늘, 차가운 플러싱 배지(Dulbecco 개조 이글 매체 [DMEM]를 10% 태아 송아지 혈청[FCS, 열불활성], 2m L-글루타민, 1% 항생제-항미코틱 솔루션, 50 μM Β-메르카포에탄으로 보충하여, 페트르골에 수골에 빨강골을 넣습니다.
- 동일한 주사기를 사용하여 반복된 부드러운 포부와 배출에 의해 플러시 골수 세포 클러스터를 해리합니다.
- 각 마우스에서 15ml 원심분리기 튜브로 대퇴골과 경골 골수를 풀. 4°C에서 5분 동안 골수 세포와 원심분리기를 400 x g에서 씻어내는 차가운 홍조 배지로 튜브를 채웁니다.
- BMCMC 문화.
- 상신체를 제거하고 10 ml의 배양 배지에서 펠릿 골수 세포를 회복합니다(DMEM은 10% 태아 종아리 혈청으로 보충[FCS, 열불성], 2mM L-글루타민, 1% 항생제 항마이코스 용액, 50 μM Β-mercaptoethanol 및 20% WEHI-3 세포 조절 매체 [IL-3의 원천으로; 10 ng/ml에서 재조합 마우스 IL-3을 사용])
- 적절한 크기의 조직 배양 플라스크에 세포를 배치(예를 들어,1 마우스용 T25, 2 마우스용 T75 등).
- 도금 세포 후 1-2 일, 배지 및 현탁세포 (플라스크의 바닥에 부착 된 파편과 부착 세포를 떠나) 새로운 플라스크에 신선한 배양 배지 (10ml/마우스)를 추가합니다.
- 다음 주 동안 3-4일마다 셀을 공급합니다(마우스당 배양 배지 10ml를 추가). 세포 밀도를 2.5 x 105-1 x 106 셀/ml 사이로 유지합니다. 비 부착 된 세포를 배양 플라스크에 부착 된 세포가 없을 때까지 일주일에 한 번 새로운 플라스크로 전달합니다. MC-결핍 마우스로 체외 검사 또는 생을 위해 사용하기 전에 세포의 성숙도를 테스트합니다(아래 참조).
참고: BMCMC의 완전한 차별화는 4-6주가 소요됩니다.
- BMCMC 성숙도 평가.
-
유동 세포측정을 사용.
- 세척 셀 (5 x 104-5 x 105 셀/조건) 얼음 차가운 FACS 버퍼 (PBS, 0.5% FCS) 5 ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브. 4°C에서 5분 동안 400 x g의 원심분리기. 흡인 슈퍼 네티볼.
- FACS 버퍼에서 항마우스 CD16/32(클론 93 또는 2.4G2) 단일 클론 항체 1:200(2.5 μg/ml)을 희석한다. 각 펠릿에 10 μl을 넣고 간단한 소용돌이로 다시 중단합니다. 얼음에 5분 동안 배양하여 Fc 바인딩을 차단합니다.
참고: 나머지 모든 단계에 대해 샘플을 직접 조명으로부터 보호합니다. - 희석 물리에리트린 (PE) 공주 항 마우스 Fc θRI α (클론 MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) 및 플루오레세인 이소티오야네이트 (FITC) 공주 항 마우스 KIT (CD117; 클론 2B8) 1:200 (2.5 μg/ml) ("염색 용액"), 또는 FACS 버퍼에서 각각의 표지된 동형 제어 항체("동색 조절 용액").
- 차단된 세포의 절반을 1.3.1.2)에서 추가 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 분할하고 한 튜브에 "염색 용액"의 20 μl과 다른 튜브에 "동형 제어 용액"의 20 μl을 추가합니다. 얼음에 30 분 인큐베이션.
- 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 3ml의 얼음 차가운 FACS 버퍼와 원심분리기를 추가합니다. 1 μg/ml 프로피듐 요오드 (PI, 죽은 세포의 식별을 위해)를 포함하는 300 μl FACS 버퍼에서 슈퍼 나탄을 버리고 펠릿을 다시 중단하십시오. 순환 측정 해석을 흐름으로 진행합니다(그림 2A참조).
- toluidine 블루 스테인링을 사용 하 여.
- 실온에서 5분 동안 400 x g에서 PBS로 1x 105 셀을 한 번 씻은 다음 PBS의 200 μl에서 세포를 흡인 및 재중단합니다.
- 세포 현탁액을 현미경 슬라이드에 부착된 준비된 사이토깔로 옮기고 사이토센심분리기(5분 동안 40 x g)를 사용하여 사이토 원심분리기를 진행한다.
- 공기 건조 슬라이드 10 분 PAP 펜을 사용 하 여 셀 주위 왁스 원을 그립니다. 세포를 덮기 위해 0.1% Toluidine 블루 용액을 추가합니다. 1 분 동안 인큐베이션. 흐르는 수돗물로 슬라이드를 1분 간 세척한 다음 10분 동안 공기 건조 슬라이드를 세척합니다.
- 장착 매체를 사용하여 커버 슬립 셀. 광 현미경 분석 진행(그림 2B참조)
-
유동 세포측정을 사용.
2. BMCMC와 마스트 세포 결핍 마우스의 이식.
- 인트레이더말(즉, 주사)에 의한 귀 이식.
참고: MC 결핍 마우스의 귀 정점에 BMCmC를 채택하는 경우, 이어 피나 당 각각 1 x 106 셀 (총 2 x 106 셀)의 두 개의 주사를 수행하는 것이 좋습니다. MC-결핍 마우스의 귀 정점에 BMCmC의 인트레이더말 이식은 수동 적인 무호흡 성 과민성 (PCA)24,27,숙주 방어28,만성 과민성 (CHS) 반응29,30의모델을 포함하여 여러 모델에서 많은 조사자들에 의해 사용되었습니다.- 차가운 DMEM에서 4 x 107 BMCmC/ml(1 x 106 BMCmC/ 25 μl)에서 셀을 계산하고 재중단합니다. BMCMC 용액을 30G 바늘이 장착된 1ml 주사기로 옮긴다. 주입 될 때까지 얼음을 유지합니다.
- 이소플루란(2.5% v/v)을 이용한 4-6주 된 MC 결핍 마우스를 마취한다. 발가락 핀치에 의해 마취의 깊이를 확인하고, 표시된 경우 이소플루란을 조정하고 시술 내내 호흡과 발가락 핀치 반응을 계속 모니터링하십시오. 안과 연고를 Q-tip으로 바르면 눈의 건조를 방지하십시오.
- 검지 손가락으로 귀 피나의 등쪽 면에 수직 압력을 가하여 복부 면을 노출하고 스트레칭합니다.
- BMCMC 용액의 25 μl i.d. 주사를 귀 피나의 복부 면의 두 가지 부위로, 귀 중간에 첫 번째 주사를, 이어 피나 끝을 향한 두 번째 주입을 수행한다. 생체 내 실험을 수행하기 전에 i.d. 이식 후 4-6 주를 기다립니다.
참고: 우리의 경험에서, 그 때까지 귀 피나의 중앙 부분에 진피의 MC/mm2의 수는 일반적으로 야생형 마우스의 해당 위치에서 와 유사하지만, 반면, 귀 피네의 주변에 있는 MC/mm2의 수는 일반적으로 해당 야생형 마우스27,28마리보다실질적으로 낮다. 이러한 MC 이식 마우스를 가진 실험을 설계할 때 염두에 두어야 한다(예를 들어,MC 기능에 가능한 효과 에이전트는 귀 피네의 중앙 부분에 주입 되어야 하며, 이러한 치료의 효과의 분석은 또한 그 영역에 초점을 맞추어야 한다).
- 복막 구멍 내 (i.p.) 주입에 의한 복막 구멍 이식.
참고: MC 결핍 마우스의 복막 구멍으로 BMCMC를 채택하여 마우스 당 2 x 106 세포의 1개의 주사가 필요합니다. 이러한 i.p. MC-결핍 마우스에 BMCmC를 주사하는 많은 그룹이 다양한 모델에서 복막 MC의 역할을 연구하는 데 사용되어 왔으며, 여기에는 독에 대한 숙주 방어모델(31) 또는 세균패혈증32,33이포함되어 있다.- 적절한 수의 셀수를 계산하고 차가운 DMEM에서 1 x 107 BMCMC/ml(2 x 106 BMCMC/ 200 μl)로 재중단합니다. BMCMC 용액을 25G 바늘이 장착된 1ml 주사기로 옮긴다. 주입 될 때까지 얼음을 유지합니다.
- 4-6주 된 MC-결핍 마우스의 복막 구멍에 200 μl BMCMC 용액1주입을 수행한다. 생체 내 실험을 수행하기 전에 i.p. 이식 후 4-6 주를 기다립니다.
- 정맥 (즉, 주사)에 의한 이식.
참고: MC 결핍 마우스로 i.v. 주입에 의해 BMCmC의 입양 전송은 마우스 당 5 x 106 세포의 1개의 주입을 요구할 것이다. MC-결핍 마우스로 BMCmC를 주사하는 정맥(i.v.) 주사는 방광 감염34,천식35,폐 섬유증36,항체 매개 관절염37의모델을 포함하여 다양한 질병 모델에서 MC의 역할을 연구하기 위해 많은 그룹에 의해 사용되어 왔다.- 적절한 수의 셀수를 계산하고 차가운 DMEM에서 2.5 x 107 BMCMC/ml(5 x 106 BMCMC/200 μl)로 재중단합니다. BMCMC 용액을 30G 바늘이 장착된 1ml 주사기로 옮긴다. 주입 될 때까지 얼음을 유지합니다.
- 이소플루란(2.5% v/v)을 이용한 4-6주 된 MC 결핍 마우스를 마취한다. 발가락 핀치에 의해 마취의 깊이를 확인하고, 표시된 경우 이소플루란을 조정하고 시술 내내 호흡과 발가락 핀치 반응을 계속 모니터링하십시오. 안과 연고를 Q-tip으로 바르면 눈의 건조를 방지하십시오.
- MC 결핍 마우스의 꼬리 정맥(또는 또는 레트로 궤도 정맥)에 BMCMC 용액 200 μl을 1회 주입합니다. 생체 내 실험을 수행하기 전에 i.v. 이식 후 12 주를 기다립니다.
3. 이식 된 마스트 세포 결핍 마우스의 분석.
- 귀 이식 분석.
- 실험이 끝나면, CO2 흡입으로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다.
- 귀 피네를 분리하고 4 °C에서 하룻밤 동안 10 % (vol/vol) 버퍼링 포르말린으로 고정합니다. 파라핀에 고정 된 귀 피네를 포함, 귀 피네의 4 μm 섹션을 잘라 유리 슬라이드에 마운트.
- 실온에서 1 분 동안 0.1 % Toluidine 블루 솔루션으로 슬라이드를 얼룩. 수돗물로 슬라이드를 1분 간 세척한 다음 실온에서 10분 동안 공기 건조 슬라이드를 드실 수 있습니다.
- 마운팅 매체를 사용하여 커버슬립 슬라이드를 사용한 다음, 라이트 현미경을 사용하여 피네 섹션당 이식된 MC 수를 계산합니다. 이식된 마우스의 귀 껍질에 있는 MC의 백분율 그리고 분포를 야생형 마우스대 비교하여 이식 효율을 평가합니다.
- 복막 구멍 이식 분석.
- 복막 구멍에서 마스트 세포 수의 평가.
- 실험이 끝나면, CO2 흡입으로 마우스를 안락사시키고 자궁 경부 탈구가 뒤따릅니다. 복막 구멍을 부러뜨리지 않고 마우스의 복부 피부를 주의 깊게 제거하십시오.
- 25G 바늘이 장착된 주사기 5ml를 사용하여 복막 구멍에 5 ml의 냉온 또는 실온 PBS를 주입하십시오. 복막 세포를 활성화하는 위험을 줄이기 위해 감기 PBS를 사용하십시오 (복막 용암 액에서 복막 MC 탈과또는 일부 MC 파생 제품의 수준을 평가할 때 매우 중요합니다). 복막 세포를 수확하기 위해 20 초 동안 복부 마사지를 수행하십시오.
- 22G 바늘이 장착된 5ml 주사기를 사용하여 수막 용암을 천천히 흡인시합니다. 흡량성 용암의 양을 기록하십시오 (주입 된 볼륨의 최대 80 %까지 회복 될 것으로 예상).
- 복막 용암액을 5ml 폴리스티렌 라운드 바닥 튜브로 옮기고 원심분리기를 4°C에서 5분 동안 400 x g로 옮긴다. 흡인 슈퍼 네티볼. 400 μl 감기 PBS에서 펠릿을 복구합니다.
- 혈종계 챔버를 사용하여 총 수의 다원세포를 계산합니다. 혈중 세포 측정 분석(단계 1.3.1에 설명된 대로)에 세포 현탁액의 절반을 사용하여 복막 구멍에서 이식된 MC의 백분율 및 마커 발현을 평가한다. MC의 백분율에 따라 회막 셀의 총 수를 곱하여 절대적인 수의 수입니다.
- 단계 1.3.2.2에 설명된 바와 같이 나머지 세포와 세포 원심 분리를 수행한다. 실온에서 10분 동안 공기 건조 슬라이드를 사용하고 PAP 펜을 사용하여 셀 주위에 왁스 원을 그립니다.
- 희석되지 않은 5월-그룬발트 스테닝 용액을 5분 간 커버한 다음 실온에서 PBS에서 5분 동안 세척합니다. Giemsa 얼룩으로 세포를 덮어 1:20에 탈온화된 물로 희석하고 실온에서 20분 동안 배양합니다. 수돗물로 2번 밀어 넣고 1분 간 세척한 다음 공기 건조 슬라이드를 세척합니다.
- 장착 매체를 사용하여 커버슬립 셀을 사용하고, 경현미경을 사용하여 이식된 MC의 백분율을 계산합니다(최소 400개의 총 세포를 계산하여). 생항마우스의 배막용 암포에서 MC의 비율을 야생형 마우스와 비교하여 이식 효율을 평가한다.
- 막자 창에서 비만 세포의 평가.
- 단계 3.2.1에 기술된 복막 용암에 따라 복막을 열어 마우스의 장내를 노출시킵니다. 슬라이드에 마우스 당 4 ~ 5 막연한 창을 정렬합니다.
- 카노이 용액(3:2:1 vol/vol/vol of ethanol, 클로로폼 및 빙하 아세트산)에서 1시간 동안 슬라이드를 고정합니다. 공기 건조 슬라이드및 내장을 제거 (고정 된 장간 창은 슬라이드에 부착 된 상태로 유지됩니다).
- Csaba (알시안 블루 / 사프란 O) 염색 용액으로 실온에서 20 분 동안 준비하십시오.
- 500ml의 Csaba 얼룩을 만들기 위해 1M HCl 120ml의 아세테이트 용액 100ml를 혼합하여 500ml의 아세테이트 버퍼를 준비하십시오. 그런 다음 90 mg 사프라닌 [빨간으로 '성숙한 MC'를 식별], 1.8 g 알시안 블루 [파란색으로 '미성숙한 MC'를 식별] 및 2.4 g 의 페리 암모늄 황산 NH4Fe (SO4)2 ~ 500 ml의 아세테이트 버퍼.
- 마운팅 매체를 사용하여 커버 슬립 슬라이드, 다음 가벼운 현미경을 사용하여 막연한 창 당 이식 된 MC의 수를 계산합니다. 이식된 마우스의 막질 창에서 MC의 백분율 과 분포를 야생형 마우스와 비교하여 이식 효율을 평가한다.
- 복막 구멍에서 마스트 세포 수의 평가.
- I.v. 이식 분석.
- 실험이 끝나면, 자궁경부 탈구, 수확 조직(예를들어 폐, 피부 또는 비장)에 의해 마우스를 안락사시키고 4°C에서 10%(vol/vol) 완충 된 포르말린으로 하룻밤 을 고정한다.
- 파라핀에 고정 된 조직을 포함, 4 μm 섹션을 잘라, 유리 슬라이드에 마운트. 실온에서 1 분 동안 0.1 % Toluidine 블루 솔루션으로 슬라이드를 얼룩. 수돗물로 슬라이드를 1분 간 세척한 다음 공기 건조 슬라이드를 10분 동안 세척합니다.
- 커버슬립 슬라이드는 마운팅 매체를 사용하여 슬라이드를 사용하고 가벼운 현미경을 사용하여 조직 섹션당 이식된 MC의 수와 분포를 평가합니다.
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Representative Results
'마스트 세포노크-인'접근법의 개요는 도 1에도시되며, BMCmC의 생성, i.p., 즉 mc-결핍 마우스로 이식해야 하는 세포의 수(실험 설계에 따라 표시될 경우 숫자가 달라질 수 있음) 및 주사 부위에 따라 이식 및 실험 사이의 간격을 포함할 수 있습니다(이 에 따라 달라질 수 있습니다.) 예를 들어,MC 세포질 과립에 저장된 중재자의 함량은38시에꾸준히 증가한다.) 도 2는 IL-3의 원천으로서 20%의 WEHI-3 세포 조절 배지를 함유하는 DMEM 배지에서 1, 15 및 45일 배양 후 BMCmC의 대표적인 유동 세포 분석 및 토루이딘 블루 염색을 나타낸다. 45일 동안 배양된 BMCmCs는 95% 순수하며, 세포질 과립의 수가 많으며 이식 실험에 사용할 수 있으며, 15일 동안 배양된 세포는 이식에 적합하지 않습니다. 도 3은 i.d. engraftment(도 3A),막종 창(도 3B)및 복막 구멍(도 3C)6 주 i.p. 이식 후, 및 폐(도 3D)12 주 후 i.v. 이식 후 귀 피나에 대표적인 성공적인 이식을 나타낸다.
그림 1:'마스트 셀 노크인' 생체 내MC 기능 분석을 위한 마우스모델. 야생형 또는 돌연변이골수 유래 배양MC(BMCMC)는 IL-3의 공급원으로 서 적어도 4~6주 동안 골수 세포를 배양하여 생성된다(또는 10 ng/ml 재조합 마우스 IL-3)의 원천으로서 WEHI-3 세포 조절 배지). 이러한 BMCMC는 그 때 소위'마스트 세포 노크인'마우스를 만들기 위하여 MC 결핍마우스로 이식될 수 있습니다. BMCMC는 다양한 MC 집단의 지역(즉, i.p.) 또는 전신(i.v.) 재구성을 위해 다양한 경로(정맥 내 [i.v.], 복역내 [i.p.] 또는 인트레이더피 [i.d.])를 통해 주입될 수 있다. MC 기능(들)은 야생형 마우스, MC-결핍 마우스 및'마스트 세포 노크인'마우스의 반응을 비교하여 분석할 수 있다. 특정 MC 제품의 기여도는 이러한 제품의 부족하거나 유전적으로 변형된 형태의 마우스로부터 추출한 야생형 BMCMC 또는 BMCMC로 이식된'마스트 셀 노크인'마우스의 반응을 비교하여 분석될 수 있다. (이것은 참조에서 그림 1의 수정 된 버전입니다.12).
그림 2: 혈중 세포및 현미경 검사법에 의한 BMCMC 제제의 순도 평가. (A)대표적인 유동 세포측정 분석FcθRIα 및 KIT(CD117) 발현은 1일(왼쪽 패널), 15일(중간 패널) 및 45일(오른쪽 패널) 구 BMCMCs.프로티듐 요오드(PI)-양성 사세포분석에서 제외되었다(도시되지 않음). 숫자는 파란색 사각형에 게이트FcθRIα+KIT+ BMCMC의 비율을 나타냅니다. (B)toluidine 파란색으로 염색 된 BMCMC의 대표적인 사진은 검은 점선으로 정의 된 상부 패널의 영역의 배율입니다. 바 = 10 μm.
그림 3: 다양한 해부학 현장에서 MC 이식의 효율평가. (A)토루이딘 블루로 얼룩진 4 μm 귀 피네 섹션의 대표 사진. (B)사프란/아시안 블루('카사' 얼룩)로 얼룩진 장병창의 대표적인 사진. (C)수막 용암체에 존재하는 세포의 대표적인 사진과 5월-그룬발트 지름사(MGG)로 염색하였다. (D)토루이딘 블루로 염색된 4μm 폐 섹션의 대표적인 사진. 바 = 50 μm(A, B 및 D)또는 20 μm(C). 사진은 C57BL/6 야생형 마우스(상부 패널), MC-결핍 키트W-sh/W-sh 마우스(중간 패널) 및 야생형 BMCMC로 이식된 MC-결핍 마우스: BMCMCs 키트W-sh/W-sh(하부 패널)입니다. MC는 화살표로 표시됩니다.
| 마우스 | 사용 가능한 배경 |
MC 번호 (정상 상태) |
기타 표현형(9,10,13에서 검토) | BMCMC와 이식보고 |
| 키트W/W-v |
(WB/Re x C57BL/6) F1 (잭슨 연구소 – WBB6F1/J-KitW /KitW-v/J) |
결합 조직 및 점막 MC의 부재 | 빈혈, 감소 된 혈관 세포 및 호중구 수치, 멜라닌 세포및 카잘의 간질 세포결핍, 멸균 등 | i.v.35,37; i.p.31,62; i.d.28,29; i.c.50,51; i.a.49; fp.i. 63 |
| 키트W-sh/W-sh |
C57BL/6 (잭슨 연구소 – B6. Cg-KitW-sh/HNihrJaeBsmJ) 잭슨 실험실에서 수행된 단일 뉴클레오티드 다형성 분석은 이 마우스가 단지 ~87% C57BL/6-유전 배경임을 보여준다. |
결합 조직 및 점막 MC의 부재 | 간피와 호중구 수의 적당한 증가, 골수성 유래 억제제 세포의 증가 수64,멜라닌세포 및 카잘의 간질 세포의 결핍 | i.v.23,34-36; i.p.31,62; i.d.28,29; i.a.49 |
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C57BL/6J62 (잭슨 연구소 – B6. Cg-KitWsh/HNihrJaeBsmGlliJ) 이 마우스는 C57BL/6J 배경에서 >11번 교차되었습니다. |
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BALB/c65 (C.B6-키트W-sh) |
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맥pt5-Cre; R-DTA |
C57BL/625 (Tg (Cma1-cre) ARoer; B6.129P2-Gt(로사)26Sortm1 (DTA)Lky/J) |
회대적 현저한 감소(98%) 피부 및 피부(89-96.5%) MC, 점막 MC 고갈 될 것 같지 않다 | 점막 MC의 가능한 존재; 기자 마우스는 ~30% 비장 NK 세포66에서 'floxed' YFP 트랜스진의 Cre-매개 삭제를 밝혀 | 없음 |
| Cpa3Cre/+ |
C57BL/626 (B6.129P2-Cpa3tm3 (icre)Hrr) |
결합 조직 및 점막 MC의 부재 | Cpa3는 다른 세포 유형으로 표현; 감소 된 바소필 번호 | i.v.26 |
|
BALB/c26 (B6.129P2/올라흐드.BALB/c-Cpa3tm3(icre)Hrr) |
||||
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Cpa3-Cre; 맥-1fl/fl/fl |
C57BL/624 (Tg(Cpa3-cre)3Glli; B6;129-맥1tm3sjkJ) |
결합 조직 및 점막 MC의 부재 |
Cpa3는 다른 세포 유형으로 표현; 증가 비장 호중구 및 가벼운 빈 혈; 감소 된 바소필 번호 |
i.d.24; i.a.49 i.v. (게시되지 않은 데이터) |
표 1: 구성 MC 결핍을 가진 마우스의 긴장. c-키트-의존형 또는c-키트-독립적인구성 MC 결핍을 가진 마우스의 몇몇 변종을 사용할 수 있습니다. 원칙적으로, 이러한 균주의 모든'마스트 세포노크-인' 마우스를 생성 하는 데 사용할 수 있습니다 (비록, 우리의 지식의 최선을 위해, 이것은 아직 Mcpt5-Cre에 대 한 보고 되지 않은; R-DTA 마우스). 그러나, 이 긴장의 각각에는 이 마우스로 얻은 결과를 해석할 때 염두에 두어야 할 그밖 현상상 이상 및 한계가 있습니다. 성공적인 MC 이식의 몇 가지 예는 참조에서 찾을 수 있습니다. (이것은 참조에서 표 1의 수정 및 업데이트 된 버전입니다.9).
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Discussion
초기 설명 38 년 후 거의30년,'돛대 세포 노크 -in'접근 방식은 MC가 할 수있는 일또는 생체 내에서 할 수없는 일에 대한 귀중한 정보를 계속 제공하고 있습니다. MC의 기능은 오랫동안 알레르기에 있는 그들의 역할에 국한된 것으로 생각되었습니다. '마스트 셀 노크-인'접근법을 이용하여 생성된 데이터는 MC가 특정 병원균4,39또는 독28,31에 대한 호스트 방어에 중요한역할을 할 수 있다는 증거를 제공함으로써 이러한 견해를 변화시켰으며, 또는 특정 면역 반응을 억제할 수있다 29,34,40일까지.
우리의 프로토콜 설명에서, 우리는 골수 유래 배양 MC (BMCMC)의 생성 및 이식에 집중하기로 결정했습니다, 이러한 세포의 많은 수는 야생 유형 또는 돌연변이 마우스의 골수에서 체외에서 생성 될 수 있기 때문에. 그러나, MC들은 배아 줄기세포(배아줄기세포 유래 배양MC[ESCM])로부터 직접 배양될 수 있고, 유전자적으로 호환될 때, 이들 세포는 MC-결핍 마우스로 이식하는 데도 사용될 수 있다. 이 대체 접근법은 특히 결핍이 마우스의 배아 치사성을 유도하는 단백질의 역할을 연구하기 위해 특히 흥미롭고, 따라서 이 단백질에 대한 BMCMCs 결핍은 생성될 수 없습니다. BMCmC와 ESCmC 는 또한 MC 결핍 마우스로 이 세포의 이식하기 전에 관심있는 유전자를 침묵시키기 위하여 관심있는 유전자 또는 shRNA를 코딩하는 렌즈 바이러스를 가진 시험관에서 변환될 수 있습니다31,33.
우리는 일반적으로 BMCMCs의 문화에 대한 IL-3의 소스로 20 % WEHI-3 조건 배지를 사용합니다. 그러나, 재조합 IL-3(10 ng/ml, 1.2.1단계에서 설명된 바와 같이)도 사용될 수 있으며, 배양 배지에 재조합 줄기세포인자(SCF)를 첨가하여42,43개의BmCmC 생성수를 실질적으로 향상시킬 수 있다. 연구에 따라, 재조합 SCF의 10 내지 100 ng/ml가 IL-3 이외에 BMCMC36,44,45를생성하는 데 사용되었습니다. 하나는 다른 공급 업체에서 시판 되 면 murine 재조합 SCF 준비 BMCmC의 개발에 영향을 미치는 그들의 힘에 다를 수 있습니다 명심 해야 합니다. BMCMC를 생성하는 데 사용되는 접근법의 세부 사항(예: IL-3 함유 배지에 재조합 SCF를 추가하는지 여부, 배양 기간 등)이이러한 세포의 표현형 및 기능에 영향을 미칠 수 있음을 인식하는 것이 중요하다. 예를 들어, SCF에 만성적으로 노출된 BMCMC는 히스타민과 특정 프로테아제의 수준을44,46으로증가시켰지만, 체외에서FcθRI 매개 탈과 및 사이토카인 생산의 현저한 감쇠를 표시하는 것으로 보고되었다. 마지막으로, IL-3 이외에 WEHI-3 조절 배지는 MC 기능에 영향을 미칠 수 있는 많은 생물학적 활성 분자를 함유하고 있다. WEHI-3-컨디셔닝 배지로 얻은 BMCmC는 따라서 재조합 IL-3(또는 재조합 IL-3 플러스 SCF)로 얻은 BMCMC와 다를 수 있습니다. 다른 유형의 배양 배지에서 생성된 BMCMC의 표현형에 대한 이러한 차이가 세포가 생체 내다른해부학 적 부위로 이식된 후 유지되는지 여부에 대한 연구가 거의 없었으며, 이러한 유형의 추가 연구가 흥미로울 수 있습니다. 그러나 선택된 배양 조건에 관계없이 동일한 배양 배지 레시피를 사용하여 분석을 위해 결과를 풀로 만들어 내는 실험에서 이식에 사용할 모든 BMCMC를 생성해야 합니다. 또한, MC는 95~98%의 순도에 도달하기 위해 MC-결핍 마우스로 이식하기 전에 적어도 4~6주동안 배양해야 한다. 이는 'BMCMC 인구'에서 유방세포계보(골수세포를 체외에배치한 후 초기 간격으로 배양에 존재하는) 이외의 조혈세포의 존재가 MC이외에 기증자 유래 세포의 출현을 초래할 수 있는 가능성을 줄이기 위해'유방세포 노크-마우스'에있다.
우리는 여기에 야생 유형 또는 돌연변이 BMCmC와 MC-결핍 마우스를 이식하기위한 자세한 프로토콜을 제시 (즉, 정맥 내 (i.v.) 또는 귀 피나에 상인 (즉.d.) 또는 귀 피나에서, 주사의 이 경로는 많은 조사자들에 의해 사용되었기 때문에. 그러나 BMCMC는 또한 풋패드 48, 관절 내49 또는 내-cranily50,51에서백스킨(47)에성공적으로 이식되었다. 이식할 BMCMC의 수는 이식과 실험 사이의 간격뿐만 아니라, 이식하는 주사 경로 및 표적 기관의 이식 경로에 따라 달라질 수있다(도 1). BMCMC (완전히 성숙하지 않은 MC)가 생체 내에서성숙해질 수있는 충분한 시간을 허용하기 위해 실험을 시작하기 전에 BMCMC를 이식 한 후 이러한 간격을 존중하는 것이 매우 중요합니다. MC의 세포질 과립에 저장된 중재자의 함량은 세포의 일생 동안 계속 증가 할 수 있기 때문에38,52,특정 실험에 대한 하나는 MC 이식과 MC 기능을 평가하기 위해 실험의 개시 사이의 간격을 증가하고자 할 수 있습니다.
주사 경로 및/또는 BMCmC 주입의 수에 따라, 입양적으로 전달된 MC의 숫자 및/또는 해부학적 분포는 야생형 마우스에서 해당 네이티브 MC 집단의 분포와 다를 수 있다12,23,53,54. MC-부족한 마우스는 BMCMC를 통해 MC가 이식한 i.p. 또는 i.d.를 야생형 마우스의 네이티브 MC 인구와, 복막 구멍 및 막새 및 진피에서 MC의 분포와 거의 동일한 수의 분포를 가질 수 있으며, MC 이송 후 4~8주를 각각 평가할 경우12,23년 후 12,23주후에 평가된다. BMCMC의 정맥 전송은 대부분의 조직에서 정상적인 MC 번호 및/또는 배포로 이어지지 않습니다. 예를 들어, 이러한 i.v.-engrafted'마스트 세포 노크인'마우스의 피부에서 거의 또는 극소수의 MC가 발견되지 않습니다. MC 결핍 마우스로 BMCMC를 주입한 후 4-28주에서, 기관내 MC의 수는 해당 야생형 마우스에 비해 실질적으로 낮다. 대조적으로, 폐 주변의 MC의 수는 전형적으로 해당 야생형 마우스12,23,53,55보다크다. I.v. BMCmC의 전송은 또한 비장에서 MC의 상부를 초래합니다, 아주 몇몇 네이티브 MC는 일반적으로 야생 형 마우스에서 이 기관에서 찾아낸 반면23,56. 중요한 것은, 이전 보고서는 MC-결핍 마우스로 BMCMC를 주사하는 것이 척수, 림프절 또는 심장54,57과같은 특정 해부학 적 부위에 MC 집단을 접목시키는 데 실패한다는 것을 입증했다. 몇몇 단은 또한 그러한 i.v. 이식이 장 점막 MC (MMC) 인구23,58-60의이식귀착되지 않는다는 것을 주의했습니다. MC의 번호 및/또는 오퍼링 MC의 분포차이는 MC'마스트셀 노크인'모델9를사용하여 얻은 데이터를 해석할 때 고려해야 합니다.
MC 결핍 마우스의 몇몇 긴장이 존재하고, 특정 프로젝트에서 사용할 하나(들)를 선택하는 것이 중요합니다. c-키트 돌연변이 MC-결핍 마우스, 키트W/W-v 또는 키트W-sh/W-sh 마우스와 같은, 전통적으로 많은 조사자에 의해 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 마우스는 그들의 심오한 MC 결핍(표 1)의옆에 많은 c-키트 관련 현상성 이상으로 고통받습니다. 최근 몇 년 동안,c-kit-독립적인구성 MC 결핍을 가진 마우스의 몇몇 긴장은24-26보고되었습니다. 이들 마우스 중 일부는 또한 MC 결핍(표1)옆에 다른 표현성 이상을 나타내며, 새로 설명된 균주의 표현형이 아직 조사 중이기 때문에 추가 이상이 발견될 수 있다. 이러한 모든 마우스와 MC-결핍 마우스의 몇 가지 추가 새로운 유형은 최근 자세히 검토 되었습니다9,10,13.
현재 사용 가능한 각 MC 결핍균의 한계를 감안할 때 MC 결핍9의두 개 이상의 모델을 사용하여 MC 기능에 대한 가설을 테스트하는 것이 좋습니다. 우리의 실험실에서, 우리는 일반적으로 키트W-sh / W-sh 및 Cpa3-Cre에서 파일럿 실험을 수행; Mcl-1fl/fl 마우스. 두 가지 유형의 MC 결핍 마우스에서 일치성 결과를 얻을 경우 MC의 역할을 확인하고 특정 MC 파생 제품의 잠재적 역할을 평가하기 위해 이식 실험을 진행합니다. 마지막으로, MC의 '플로스' 유전자의 MC 또는 Cre 재조합 의 결실을 허용하는 여러 균주가 최근에25,49,61로기술되었다는 점에 유의해야 한다. 이러한 균주는 다른 곳에서 자세히 검토되었습니다9,10,13 유망한 대안을 나타냅니다 - 또는 보완 - 생체 내에서MC 기능을 연구하는 접근.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
N.G.는 프랑스 "퐁디앙 부어 라 레체르체 메디칼 FRM"과 필립 재단의 펠로우십의 수혜자입니다. R.S.는 어린이 건강을 위한 루실 패커드 재단과 스탠포드 NIH/NCRR CTSA 어워드 번호 UL1 RR025744; P.S.는 막스 케이드 재단과 오스트리아 과학 아카데미의 막스 케이드 펠로우십과 오스트리아 과학 기금(FWF) 슈로딩거 펠로우십: J3399-B21의 지원을 받고 있습니다. S.J.G.는 국립 보건원의 지원을 U19 AI104209, NS 080062 및 캘리포니아 대학의 담배 관련 질병 연구 프로그램에서 승인합니다. L.L.R.은 관절염 국립 연구 재단 (ANRF)과 국립 보건 원 보조금 K99AI110645의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning cellgro | 30-004-Cl | |
| 3 ml Syringe | Falcon | 309656 | |
| 35 mm x 10 mm Dish | Corning cellgro | 430588 | |
| 5 ml Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | 352058 | |
| Acetic Acid Glacial | Fisher Scientific | A35-500 | |
| Alcian Blue 8GX | Rowley Biochemical Danver | 33864-99-2 | |
| Allegra 6R Centrifuge | Beckman | ||
| Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified | eBioscience | 14-0161-81 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M7522 | |
| BD 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) Needles | BD Precision Glide Needle | 205155 | |
| BD 25 G 5/8 Needles | BD Syringe | 305122 | |
| BD 30 G x 1/2 Needles | BD Precision Glide | 305106 | |
| Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352097 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cytoseal 60 Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Cytospin3 | Shandon | NA | |
| DakoCytomation pen | Dako | S2002 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Corning cellgro | 15-013-CM | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E 7023-500ml | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma Aldrich | F4135-500ml | |
| FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control | eBioscience | 14-4031-82 | |
| Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) | eBioscience | 11-1171-82 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Giemsa Stain Modified | Sigma Aldrich | GS-1L | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| May-Grunwald Stain | Sigma Aldrich | MG-1L | |
| Multiwell 6 well plates | Falcon | 35 3046 | |
| Olympus BX60 Microscope | Olympus | NA | |
| Paraplast Plus Tissue Embedding Medium | Fisher Brand | 23-021-400 | |
| PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control | eBioscience | 12-4888-81 | |
| Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) | eBioscience | 12-5898-82 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | eBioscience | 00-6990-50 | |
| Recombinant Mouse IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Safranin-o Certified | Sigma Aldrich | S8884 | |
| Tissue culture flasks T25 25 cm2 | Beckton Dickinson | 353109 | |
| Tissue culture flasks T75 75 cm2 | Beckton Dickinson | 353110 | |
| Toluidine Blue 1% Aqueous | LabChem-Inc | LC26165-2 | |
| Recombinant Mouse SCF | Peprotech | 250-03 |
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