Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analysere funksjonene til mastceller In Vivo ved hjelp av 'Mast Cell Knock-in' Mus

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52753
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

Summary

Vi beskriver en metode for generering av in vitro-avledede mastceller, deres engraftment i mastcellemangelmus, og analysen av fenotypen, tallene og fordelingen av engraferte mastceller på forskjellige anatomiske steder. Denne protokollen kan brukes til å vurdere funksjonene til mastceller in vivo.

Abstract

Mastceller (MCs) er hematopoietiske celler som ligger i ulike vev, og er spesielt rikelig på steder utsatt for det ytre miljø, som hud, luftveier og mage-tarmkanalen. MCs er best kjent for sin skadelige rolle i IgE-avhengige allergiske reaksjoner, og har også dukket opp som viktige aktører i vertsforsvaret mot gift og invaderende bakterier og parasitter. MC fenotype og funksjon kan påvirkes av mikromiljøetrementale faktorer som kan variere i henhold til anatomisk plassering og/eller basert på type eller stadium av utvikling av immunresponser. Av denne grunn har vi og andre favorisert in vivo-tilnærminger over in vitro-metoder for å få innsikt i MC-funksjoner. Her beskriver vi metoder for generering av musebenmarg-avledede kultiverte MCs (BMCMCs), deres adoptivoverføring til genetisk MC-mangelfulle mus, og analysen av antall og distribusjon av adoptivt overførte MCer på forskjellige anatomiske steder. Denne metoden, kalt'mast cell knock-in' tilnærming, har blitt mye brukt de siste 30 årene for å vurdere funksjonene til MCs og MC-avledede produkter in vivo. Vi diskuterer fordelene og begrensningene ved denne metoden, i lys av alternative tilnærminger som er utviklet de siste årene.

Introduction

Mastceller (MCs) er hematopoietiske celler som oppstår fra pluripotente benmargsforfedre1-3. Etter benmargsegresjon migrerer MCs forfedre inn i ulike vev der de utvikler seg til modne MCs under påvirkning av lokale vekstfaktorer1-3. Vev-bosatte MCs er strategisk plassert på vertsmiljøgrensesnitt, for eksempel huden, luftveiene og mage-tarmkanalen, hvor de oppfører seg som en første forsvarslinje mot eksterne fornærmelser3-6. MCs er ofte sub-klassifisert basert på deres "baseline" fenotypiske egenskaper og deres anatomiske steder. Hos mus er to typer MCer beskrevet: "bindevevstype" MCs (CTMCer) og mucosal MCs (MMCs)1-3,7,8. CTMCer er ofte plassert rundt venules og nær nervefibre, og ligger i serosale hulrom, mens MMCer opptar intraepitheliale steder i tarmen og respiratorisk slimhinne1-3.

Tallrike metoder er brukt for å studere biologiske funksjoner i MCs9-13. Mange grupper har fokusert på in vitro-tilnærminger ved hjelp av enten cellelinjer (for eksempel de menneskelige MC-linjene HMC114 eller LAD215,16), in vitro-avledede MCer (for eksempel human perifere blodavledede MCer17eller musebenmarg - avledet dyrket MCs [BMCMCs]18, fetal hud-avledet kultivert MCs [FSCMCs]19 og peritoneal celle-avledet MCs [PCMCs]20) eller ex vivo isolerte MCs fra ulike anatomiske nettsteder. Alle disse modellene er mye brukt til å studere molekylære detaljer om MC-biologi, for eksempel signalveier involvert i MC-aktivering. Et viktig aspekt ved MCs biologi er imidlertid at deres fenotypiske og funksjonelle egenskaper (f.eks.cytoplasmisk granulatproteaseinnhold eller respons på forskjellige stimuli) kan moduleres ved anatomisk plassering og mikromiljø2,7. Siden den eksakte blandingen av slike faktorer som oppstår in vivo kan være vanskelig å reprodusere in vitro, favoriserer vi å bruke in vivo tilnærminger for å få innsikt i MCs funksjoner9.

Flere musestammer med genetisk MC-mangel eksisterer, for eksempel de mye brukte WBB6F1-Kit W / W-v eller C57BL / 6-Kit W-sh / W-sh mus. Disse musene mangler uttrykk og/eller aktivitet av KIT (CD117), reseptoren for den viktigste MC-vekstfaktor stamcellefaktoren (SCF)21,22. Som et resultat har disse musene en dyp MC-mangel, men har også ytterligere fenotypiske abnormiteter relatert til deresc-kit mutasjoner (i WBB6F1-Kit W / W-v mus) eller til effekten av den store kromosomale inversjon som resulterer i redusert c-kit uttrykk (i C57BL / 6-Kit W-sh / W-sh mus) 9,10,12,23. Mer nylig har flere stammer av mus medc-kit-uavhengig konstituerende MC-mangel blitt rapportert24-26. Alle disse musene og noen ekstra nye typer inducible MC-mangelfulle mus har nylig blitt gjennomgått i detalj9,10,13.

Her beskriver vi metoder for generering av musebenmarg-avledede dyrkede MCs (BMCMCs), deres adoptivoverføring til MC-mangelfulle mus, og analysen av antall og distribusjon av adoptivt overførte MCs på forskjellige anatomiske steder. Denne såkalte "mast cell knock-in" -metoden kan brukes til å vurdere funksjonene til MCs og MC-avledede produkter in vivo. Vi diskuterer fordelene og begrensningene ved denne metoden, i lys av alternative tilnærminger som er utviklet de siste årene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All dyrepleie og eksperimentering ble utført i samsvar med retningslinjene fra National Institutes of Health og med den spesifikke godkjenningen av Institutional Animal Care and Use Committee ved Stanford University.

1. Generering og karakterisering av benmarg-avledede dyrkede mastceller (BMCMCer).

Merk: Donor BMCMCs bør genereres fra benmargsceller med samme genetiske bakgrunn som mottakeren MC-mangelfulle mus. Mannlig-avledet donor BMCMCs er ikke egnet for engraftment av kvinnelige mus. Kvinne-avledet donor BMCMCs vil vellykket engraft inn i både mannlige og kvinnelige mottakere.

  1. Benmargsutvinning.
    1. Hell steril fosfatbufret saltvann (PBS) i 6 brønnkulturplate (1 brønn per mus) og legg på is.
    2. Bløtlegg disseksjonsinstrumentene i 70% etanol for sterilisering.
    3. Euthanize donor mus ved karbondioksid (CO2) innånding etterfulgt av cervical dislokasjon, deretter spray musene med 70% etanol på manipulasjonsstedene.
    4. Bruk sterile disseksjonsinstrumenter for å trekke ut lårben, tibia og fibula bein uten å kutte noen benefyser.
    5. Mens du sikrer beinene med tang, skrap av alt vev fra bein (og kast fibula) ved hjelp av steril saks (eller skalpellblader). Legg bein i PBS på is til alle bein er samlet.
    6. Utfør alle gjenværende trinn i steril vevskultur hette. Bruk sterile instrumenter, sikre bein med tang og kutt av begge epifysene for å eksponere medullærhulen.
    7. Ved hjelp av 3 ml sprøyter og 30 G nåler, og kaldspyling medium (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] supplert med 10% fosterkalvserum [FCS, varmeinaktivert], 2 mM L-glutamin, 1% antibiotika-antimykotisk løsning, 50 μM Β-mercaptoethanol), skyll den røde benmargen inn i en Petri-tallerken.
    8. Bruk den samme sprøyten til å fjerne spylte benmargscelleklynger ved gjentatt skånsom aspirasjon og utkastelse.
    9. Basseng femoral og tibial benmarg fra hver mus til en 15 ml sentrifuge rør. Fyll røret med kaldt spylemedium for å vaske benmargsceller og sentrifuger ved 400 x g i 5 min ved 4 °C.
  2. BMCMCs kultur.
    1. Fjern supernatant og gjenopprett pelleterte benmargsceller i 10 ml kulturmedium (DMEM supplert med 10% fosterkalvserum [FCS, varmeinaktivert], 2 mM L-glutamin, 1% antibiotika-antimykotisk oppløsning, 50 μM Β-mercaptoetanol og 20% WEHI-3 cellekondisjonert medium [som kilde til IL-3; alternativt bruke rekombinant mus IL-3 ved 10 ng/ml]).
    2. Plasser celler i vevskulturflaske av passende størrelse (f.eks., T25 for 1 mus, T75 for 2 mus, etc.).
    3. 1-2 dager etter plating celler, overføre medium og suspensjon celler (forlater rusk og tilhørende celler stikker til bunnen av kolbe) til en ny kolbe og legge til frisk kultur medium (10 ml / mus).
    4. I løpet av de følgende ukene, mate celler hver 3-4 dager (tilsett 10 ml kulturmedium per mus). Behold celletettheten mellom 2,5 x 105-1 x 106 celler/ml. Overfør ikke-tilhengerceller til en ny kolbe en gang i uken til ingen tilhengerceller er til stede i kulturflasken. Test modenhet av celler (se nedenfor) før bruk for in vitro analyser eller engraftment i MC-mangelfulle mus.
      MERK: Fullstendig differensiering av BMCMCer vil ta 4-6 uker.
  3. Vurdering av BMCMC modenhet.
    1. Ved hjelp av strømningscytometri.
      1. Vask celler (5 x 104-5 x 105 celler/tilstand) med iskald FACS-buffer (PBS, 0,5% FCS) i 5 ml polystyren rundt bunnrør. Sentrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C. Aspirer supernatant.
      2. Fortynn antimus CD16/32 (klone 93 eller 2,4 G2) monoklonale antistoffer 1:200 (2,5 μg/ml) i FACS-buffer. Tilsett 10 μl i hver pellets og resuspend ved kort virveling. Inkuber 5 min på is for å blokkere Fc binding.
        MERK: Beskytt prøvene mot direkte lys for alle gjenværende trinn.
      3. Fortynnet phycoerythrin (PE) konjugert antimus Fc εRI α (klone MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) og fluorescein isothiocyanate (FITC) konjugert antimus KIT (CD117; klone 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("fargeløsning"), eller de respektive merkede isotypekontrollantistoffene i FACS-bufferen ("isotype kontrollløsning").
      4. Del halvparten av de blokkerte cellene fra trinn 1.3.1.2) i et ekstra polystyren rundt bunnrør og tilsett 20 μl "fargingsløsning" i ett rør og 20 μl "isotype kontroller løsning" i det andre røret. Inkuber 30 min på is.
      5. Tilsett 3 ml iskald FACS buffer og sentrifuge ved 400 x g i 5 min ved 4 °C. Kast supernatant og resuspend pellet i 300 μl FACS buffer som inneholder 1 μg/ml propidiumjodid (PI, for identifisering av døde celler). Fortsett å strømme cytometrianalyse (se figur 2A).
    2. Ved hjelp av toluidinblå farging.
      1. Vask 1 x 105 celler en gang med PBS ved sentrifugering ved 400 x g i 5 minutter ved romtemperatur, deretter aspirere og resuspend celler i 200 μl PBS.
      2. Overfør cellefjæringen til en forberedt cytofunnel festet til et mikroskopsklie og fortsett med cyto-sentrifugering ved hjelp av en cytocentrifuge (40 x g i 5 minutter).
      3. Lufttørk glir i 10 min og tegner en vokssirkel rundt celler ved hjelp av en PAP-penn. Tilsett 0,1% Toluidin blå løsning for å dekke cellene. Inkuber i 1 min. Vask sklier i rennende vann fra springen i 1 min, deretter lufttørkende sklier i 10 min.
      4. Dekker celler ved hjelp av monteringsmedium. Gå videre til lysmikroskopanalyse (se figur 2B)

2. Engraftment av mastcellemangelmus med BMCMCer.

  1. Øre engraftment ved intradermal (dvs.) injeksjon.
    MERK: For adoptivoverføring av BMCMCer til ørepinnen til MC-mangelfulle mus, anbefaler vi å utføre to injeksjoner på 1 x 106 celler hver (for totalt 2 x 106 celler) per øre pinna. Intradermal engraftment av BMCMCer i øret pinnae av MC-mangelfull mus har blitt brukt av mange etterforskere i flere modeller, inkludert modeller av passiv kutan anafylaksi (PCA)24,27, vertsforsvar mot giftstoffer28, og kronisk overfølsomhet (CHS) reaksjoner29,30.
    1. Tell og resuspend celler ved 4 x 107 BMCMCs/ ml (1 x 106 BMCMCs / 25 μl) i kald DMEM. Overfør BMCMCs oppløsning til en 1 ml sprøyte utstyrt med en 30 G nål. Hold deg på is til injeksjon.
    2. Bedøv 4-6 uker gamle MC-mangelfulle mus ved hjelp av isofluran (2,5% v / v). Kontroller dybden på anestesi ved tåklemme, juster isofluran hvis det er indikert og fortsett å overvåke puste- og tåklemmerespons gjennom hele prosedyren. Påfør oftalmisk salve med en Q-spiss for å forhindre tørrhet i øynene.
    3. Med pekefingeren skaper du vertikalt trykk på ørepinnens dorsale ansikt for å eksponere og strekke det ventrale ansiktet.
    4. Utfør to 25 μl dvs. injeksjoner av BMCMC-oppløsning i to forskjellige steder på ørepinnens ventrale ansikt, den første injeksjonen midt i øret og den andre injeksjonen mot spissen av ørepinnen. Vent 4-6 uker etter i.d. engraftment før du utfører in vivo eksperimenter.
      Merk: Etter vår erfaring er antall MCs/mm2 av dermis i den sentrale delen av ørepinnen generelt lik det på tilsvarende sted i ville mus, mens antall MCs / mm2 i periferien av ørepinnen vanligvis er betydelig lavere enn de i tilsvarende villtypemus27,28. Dette bør huskes når du designer eksperimenter med slike MC-engraferte mus (f.eks.agenter med mulige effekter på MC-funksjonen bør injiseres i den sentrale delen av ørepinnen, og analysen av effektene av slike behandlinger bør også fokusere på det området).
  2. Peritoneal hulrom engraftment ved intraperitoneal (i.p.) injeksjon.
    MERK: Adoptivoverføring av BMCMCer i bukhulen til MC-mangelfulle mus vil kreve en injeksjon på 2 x 106 celler per mus. Slike i.p. injeksjoner av BMCMCer i MC-mangelfulle mus har blitt brukt av mange grupper for å studere rollene til peritoneale MCer i ulike modeller, inkludert modeller for vertsforsvar mot giftstoffer31 eller bakteriell sepsis32,33.
    1. Tell riktig antall celler og resuspend ved 1 x 107 BMCMC/ml (2 x 106 BMCMC/ 200 μl) i kald DMEM. Overfør BMCMCs oppløsning til en 1 ml sprøyte utstyrt med en 25 G nål. Hold deg på is til injeksjon.
    2. Utfør 1 injeksjon av 200 μl BMCMC-oppløsning i bukhulen til 4-6 uker gamle MC-mangelfulle mus. Vent 4-6 uker etter i.p. engraftment før du utfører in vivo eksperimenter.
  3. Engraftment ved intravenøs (i.v.) injeksjon.
    MERK: Adoptivoverføring av BMCMCer ved hjelp av i.v. injeksjon i MC-mangelfulle mus vil kreve en injeksjon på 5 x 106 celler per mus. Intravenøse (i.v.) injeksjoner av BMCMCer i MC-mangelfulle mus har blitt brukt av mange grupper til å studere rollene til MCs i ulike sykdomsmodeller, inkludert modeller av blæreinfeksjon34, astma35, lungefibrose36og antistoffmediert leddgikt37.
    1. Tell riktig antall celler og resuspend ved 2,5 x 107 BMCMC/ml (5 x 106 BMCMCer/200 μl) i kald DMEM. Overfør BMCMCs oppløsning til en 1 ml sprøyte utstyrt med en 30 G nål. Hold deg på is til injeksjon.
    2. Bedøv 4-6 uker gamle MC-mangelfulle mus ved hjelp av isofluran (2,5% v / v). Kontroller dybden på anestesi ved tåklemme, juster isofluran hvis det er indikert og fortsett å overvåke puste- og tåklemmerespons gjennom hele prosedyren. Påfør oftalmisk salve med en Q-spiss for å forhindre tørrhet i øynene.
    3. Utfør en injeksjon på 200 μl BMCMC-oppløsning i halevenen (eller alternativt retro-orbital vene) av en MC-mangelfull mus. Vent 12 uker etter i.v. engraftment før du utfører in vivo eksperimenter.

3. Analyse av engrafterte mastcellemangelmus.

  1. Analyse av øre-engraftment.
    1. På slutten av eksperimentet, euthanize mus ved CO2 innånding etterfulgt av cervical dislokasjon.
    2. Isoler ørepinnen og fest i 10% (vol / vol) bufret formalin over natten ved 4 °C. Bygg inn fast ørepinne i parafin, klipp 4 μm deler ørepinne og monter på glasssklier.
    3. Flekk lysbildene med en 0,1% Toluidin blå løsning i 1 min ved romtemperatur. Vask sklier i vann fra springen i 1 min, deretter lufttørkende sklier i 10 minutter ved romtemperatur.
    4. Coverlip lysbilder ved hjelp av monteringsmedium, deretter telle antall engrafted MCs per pinnae seksjoner ved hjelp av et lett mikroskop. Evaluer engraftmenteffektiviteten ved å sammenligne prosentandelen og fordelingen av MCs i ørehuden til engraftede mus kontra villtypemus.
  2. Peritoneal hulrom engraftment analyse.
    1. Evaluering av mastceller nummer i bukhulen.
      1. På slutten av eksperimentet, euthanize mus ved CO2 innånding etterfulgt av cervical dislokasjon. Fjern forsiktig musens ventrale hud uten å bryte bukhulen.
      2. Injiser 5 ml kald eller romtemperatur PBS i bukhulen ved hjelp av en 5 ml sprøyte utstyrt med en 25 G nål. Bruk kald PBS for å redusere risikoen for å aktivere bukhinneceller (dette er svært viktig når du evaluerer peritoneal MC-deriangulering eller nivåer av noen MC-avledede produkter i bukhinnens lavagevæske). Utfør en massasje av magen i 20 sek for å høste peritoneale celler.
      3. Aspirer langsomt peritoneal lavage ved hjelp av en 5 ml sprøyte utstyrt med en 22 G nål. Registrer volumet av aspirert lavage (forvent å gjenopprette opptil 80% av injisert volum).
      4. Overfør peritoneal lavagevæske til et 5 ml polystyren rundt bunnrør og sentrifuger ved 400 x g i 5 minutter ved 4 °C. Aspirer supernatant. Gjenopprett pelletsen i 400 μl kald PBS.
      5. Tell totalt antall peritoneale celler ved hjelp av et hemocytometerkammer. Bruk halvparten av cellesuspensjonen til en strømningscytometrianalyse (som beskrevet i trinn 1.3.1), for å evaluere prosentandelen og markøruttrykket til engraferte MCer i bukhulen. Multipliser det totale antallet peritoneale celler med prosentandelen MCer for å få absolutt antall peritoneale MCer.
      6. Utfør en cytocentrifugation med de resterende cellene som beskrevet i trinn 1.3.2.2. Lufttørk glir i 10 min ved romtemperatur og tegner en vokssirkel rundt celler ved hjelp av en PAP-penn.
      7. Dekk celler med ufortynnet May-Grünwald Fargingsløsning i 5 min, etterfulgt av vask i PBS i 5 minutter, begge ved romtemperatur. Dekk celler med Giemsa flekk fortynnet 1:20 med deionisert vann og inkuber 20 min ved romtemperatur. Vask sklier 2 ganger i vann fra springen i 1 min, deretter lufttørkende sklier.
      8. Dekker celler ved hjelp av monteringsmedium, og beregner prosentandelen av engraferte MCer ved hjelp av et lett mikroskop (ved å telle minst 400 totale celler). Evaluer engraftmenteffektiviteten ved å sammenligne prosentandelen av MCer i bukenal lavage av engraferte mus versus villtype mus.
    2. Evaluering av mastceller i de mesenteriske vinduene.
      1. Etter bukhinnens lavage beskrevet i trinn 3.2.1, kutt opp bukhinnen for å eksponere tarmkanalen til musene. Ordne 4 til 5 mesenteriske vinduer per mus på et lysbilde.
      2. Fest lysbildene i 1 time i Carnoy-oppløsning (3:2:1 vol/vol/vol etanol, kloroform og iseddiksyre) ved romtemperatur. Lufttørkende lysbilder og fjern tarmen (de faste mesenteriske vinduene forblir festet til lysbildene).
      3. Flekk preparatene i 20 min ved romtemperatur med Csaba (Alcian blue/Safranin O) fargingsoppløsning.
        1. For å lage 500 ml Csaba-flekk, lag 500 ml acetatbuffer ved å blande 100 ml 1 M natriumacetatoppløsning med 120 ml 1 M HCl. Lag opptil 500 ml med deionisert vann og juster pH til 1,42. Deretter oppløses 90 mg Safranin [identifiserer 'modne MCs' i rødt], 1,8 g Alcian blå [identifiserer 'umodne MCs' i blått] og 2,4 g ferric ammoniumsulfat NH4Fe(SO4)2 til 500 ml acetatbuffer.
      4. Coverslip lysbilder ved hjelp av monteringsmedium, deretter telle antall engrafted MCs per mesenterisk vindu ved hjelp av et lysmikroskop. Evaluer engraftmenteffektiviteten ved å sammenligne prosentandelen og fordelingen av MCs i de mesenteriske vinduene til engraferte mus kontra villtypemus.
  3. I.v. engraftment analyse.
    1. På slutten av eksperimentet, euthanize mus ved CO2 innånding etterfulgt av cervical dislokasjon, og høst vev av interesse(f.eks lunge, hud eller milt) og fikse over natten i 10% (vol / vol) bufret formalin ved 4 °C.
    2. Bygg inn fast vev i parafin, kutt 4 μm seksjoner og monter på glasssklier. Flekk lysbildene med en 0,1% Toluidin blå løsning i 1 min ved romtemperatur. Vask sklier i vann fra springen i 1 min, deretter lufttørkende sklier i 10 min.
    3. Coverlip lysbilder ved hjelp av monteringsmedium og evaluere antall og distribusjon av engrafted MCs per vev seksjoner ved hjelp av et lett mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En oversikt over'mastcelle knock-in' tilnærming vises i figur 1, og inkluderer generering av BMCMCer, antall celler som skal være engrafted i.p., dvs. eller i.v. i MC-mangelfulle mus (antallet kan varieres hvis angitt basert på eksperimentell design) og intervallet mellom engraftment og eksperiment avhengig av injeksjonsstedet (dette intervallet kan også variere, hvis angitt; f.eks.øker innholdet av lagrede mediatorer i MC-cytoplasmatiske granulater jevnt med tiden38). Figur 2 viser representative strømningscytometrianalyser og toluidineblå farging av BMCMCer etter 1, 15 og 45 dagers kultur i DMEM-medium som inneholder i 20% WEHI-3 cellekondisjonerte medium som kilde til IL-3. Merk at BMCMCer dyrket i 45 dager er 95% rene, inneholder høyt antall cytoplasmatiske granulater og kan brukes til engraftmenteksperimenter, mens celler dyrket i 15 dager ikke er egnet for engraftment. Figur 3 viser representativ vellykket engraftment i øret pinnae 4 uker etter i.d. engraftment (Figur 3A), i mesenteriske vinduer (Figur 3B) og bukhulen (Figur 3C) 6 uker etter i.p. engraftment, og i lungene (Figur 3D) 12 uker etter i.v. engraftment.

Figure 1
Figur 1: 'Mast celle knock-in'musemodell for analyser av MC-funksjoner in vivo. Wild type eller mutant benmarg-avledet kultivert MCs (BMCMCs) genereres ved å dyrke benmargceller i minst 4-6 uker i 20% WEHI-3 cellekondisjonerte medium som en kilde til IL-3 (eller alternativt i medium som inneholder 10 ng / ml rekombinant mus IL-3). Disse BMCMCene kan deretter engraferes til MC-mangelfulle mus for å lage såkalte 'mastcelle knock-in' mus. BMCMCer kan injiseres via forskjellige ruter (intravenøs [i.v.], intraperitoneal [i.p.] eller intradermal [i.d.]) for lokal (i.d., i.p.) eller systemisk (i.v.) rekonstituering av ulike MC-populasjoner. MC-funksjon(er) i ulike biologiske responser kan deretter analyseres ved å sammenligne svarene hos villtypemus, MC-mangelfulle mus og 'mastcelle knock-in' mus. Bidraget(e) til spesifikke MC-produkter kan analyseres ved å sammenligne svar fra' mastcelle knock-in' mus engrafted med enten vill type BMCMCs eller BMCMCs avledet fra mus som mangler, eller uttrykker genetisk endrede former for, slike produkter. (Dette er en modifisert versjon av figur 1 fra referanse12).

Figure 2
Figur 2: Evaluering av renheten av BMCMC-preparater ved strømningscytometri og mikroskopi. (A) Representative flowcytometrianalyser av FcεRIα og KIT (CD117) uttrykk på overflaten av 1 dag (venstre panel), 15 dager (midtpanel) og 45 dager (høyre panel) gamle BMCMCer. Propidiumjodid (PI)-positive døde celler ble utelukket fra analysen (ikke vist). Tall angir prosentandelen av FcεRIα+KIT+ BMCMCer inngjerdet i den blå firkanten. (B) Representative bilder av BMCMCer farget med toluidinblått, nedre panel er en forstørrelse av områdene i det øvre panelet definert i svarte stiplede linjer. Stolper = 10 μm.

Figure 3
Figur 3: Evaluering av effektiviteten til MC-engraftment på ulike anatomiske steder. (A) Representative bilder av 4 μm øre pinnae seksjoner farget med toluidin blå. (B) Representative bilder av mesenteriske vinduer farget med Safranin / Acian Blue ('Csaba ' flekk). (C) Representative bilder av celler tilstede i buksnømiddel og farget med May-Grünwald Giemsa (MGG). (D) Representative bilder av 4 μm lunge seksjoner farget med toluidin blå. Stolper = 50 μm (A, B og D) eller 20 μm (C). Bilder er fra C57BL/6 wild type mus (øvre panel), MC-mangelfull KitW-sh/W-sh mus (midtpanel) og MC-mangelfulle mus som er merket med wild type BMCMCer: BMCMCs KitW-sh/W-sh (nedre panel). MCer er indikert med piler.

Mus Tilgjengelige bakgrunner MC-numre
(steady state)		 Andre fenotyper (anmeldt i9,10,13) Rapporterte engraftmenter med BMCMCer
SettW/W-v (WB/Re x C57BL/6) F1
(Jackson Laboratorier –
WBB6F1/J-KitW/KitW-v/J)		 Fravær av bindevev og mucosal MCs Anemi, reduserte basofile og nøytrofile tall, mangler i melanocytter og interstitiale celler i Cajal, sterile, etc. i.v.35,37; i.p.31,62; i.d.28,29; i.c.50,51; i.a.49; fp.i. 63
SettW-sh/W-sh C57BL/6
(Jackson Laboratorier –
B6. Cg-KitW-sh/HNihrJaeBsmJ) Enkelt nukleotidpolymorfismeanalyse utført ved Jackson-laboratorier viser at disse musene bare er ~ 87% C57BL / 6-genetisk bakgrunn.		 Fravær av bindevev og mucosal MCs Moderat økning i basofile og nøytrofile tall, økt antall myeloid-avledede undertrykkerceller64, mangler i melanocytter og interstitielle celler i Cajal i.v.23,34-36; i.p.31,62; i.d.28,29; i.a.49
C57BL/6J62
(Jackson Laboratorier –
B6. Cg-KitWsh/HNihrJaeBsmGlliJ) Disse musene har blitt tilbaketrukket >11 ganger på C57BL/6J-bakgrunnen.
BALB/c65
(C.B6-SettW-sh)
Mcpt5-Cre;
R-DTA 		C57BL/625
(Tg(Cma1-cre) ARoer; B6.129P2-Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Lky/J)		 Markerte reduksjoner i bukhinnen (98 %) og hud (89-96,5%) MCs, mucosal MCs usannsynlig å bli utarmet Sannsynlig tilstedeværelse av mucosal MCs; reporter mus avslører Cre-mediert sletting av 'floxed' YFP transgene i ~ 30% milt NK celler66 ingen
Cpa3Cre/+ C57BL/626
(B6.129P2-Cpa3tm3(icre)Hrr)		 Fravær av bindevev og mucosal MCs Cpa3 uttrykt i andre celletyper; reduserte basofile tall i.v.26
BALB/c26
(B6.129P2/OlaHsd.BALB/c-Cpa3tm3(icre)Hrr)
Cpa3-Cre;
Mcl-1fl/fl 		C57BL/624
(Tg(Cpa3-cre)3Glli; B6;129-Mcl1tm3sjkJ)		 Fravær av bindevev og mucosal MCs Cpa3 uttrykt i andre celletyper; økt milt nøytrofiler og mild anemi;
reduserte basofile tall		 i.d.24;
i.a.49
i.v. (våre upubliserte data)

Tabell 1: Stammer av mus med konstitutive MC-mangler. Flere stammer av mus medc-kit-avhengig ellerc-kit-uavhengig konstituerende MC-mangel er tilgjengelig. I prinsippet kan alle disse stammene brukes til å generere 'mastcelle knock-in' mus (selv om dette etter beste evne ennå ikke er rapportert for Mcpt5-Cre; R-DTA mus). Imidlertid har hver av disse stammene andre fenotypiske abnormiteter og begrensninger som bør huskes når man tolker resultater oppnådd med disse musene. Noen eksempler på vellykket MC-engraftment finner du i referansene. (Dette er en endret og oppdatert versjon av tabell 1 fra referanse9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nesten 30 år etter den første beskrivelsen38fortsetter"mastcelle knock-in" -tilnærmingen å gi verdifull informasjon om hva MCer kan gjøre eller ikke kan gjøre in vivo. Funksjonene til MCs ble lenge antatt å være begrenset til deres rolle i allergi. Data generert ved hjelp av'mast celle knock-in' tilnærming har endret denne visningen, ved å gi bevis på at MCs kan, blant andre funksjoner, spille kritiske roller i vertsforsvar mot visse patogener4,39 eller giftstoffer28,31, eller kan til og med undertrykke visse immunresponser29,34,40.

I vår protokollbeskrivelse bestemte vi oss for å fokusere på generering og engraftment av benmarg-avledede kultiverte MCs (BMCMCs), fordi et stort antall av disse cellene kan genereres in vitro fra benmargen av vill type eller mutante mus. Imidlertid kan MCs også dyrkes direkte fra embryonale stamceller (embryonale stamcelle-avledede kultiverte MCs [ESCMCs])41, og når de er genetisk kompatible, kan disse cellene også brukes til engraftment i MC-mangelfulle mus. Denne alternative tilnærmingen er spesielt interessant for å studere rollen til et protein hvis mangel induserer embryonal dødelighet hos mus, og derfor som BMCMCs mangelfull for dette proteinet ikke kan genereres. Både BMCMCer og ESCMCer kan også transduseres in vitro med lentivirus som koder gener av interesse eller shRNA for å kneble gener av interesse, før engraftment av disse cellene til MC-mangelfulle mus31,33.

Vi bruker vanligvis 20% WEHI-3-betinget medium som en kilde til IL-3 for kulturen av BMCMCer. Rekombinant IL-3 (10 ng/ml, som beskrevet i trinn 1.2.1) kan imidlertid også brukes, og tilsetning av rekombinant stamcellefaktor (SCF) til kulturmediet kan forbedre antallet BMCMCer generert42,43betydelig . Avhengig av studien har 10 til 100 ng/ml rekombinant SCF blitt brukt, i tillegg til IL-3, for å generere BMCMCer36,44,45. Man bør huske på at kommersielt tilgjengelige murine rekombinante SCF-preparater fra forskjellige leverandører kan variere i deres styrke i å påvirke utviklingen av BMCMCer. Det er også viktig å erkjenne at detaljer om tilnærming som brukes til å generere BMCMCer (for eksempel om man legger til rekombinant SCF til IL-3-inneholdende medium, varigheten av kulturperioden, etc.) kan påvirke fenotypen og funksjonen til slike celler. For eksempel har det blitt rapportert at BMCMCer kronisk utsatt for SCF har økt nivåene av histamin og visse proteaser44,46, men viser en markert demping av FcεRI-mediert degranulering og cytokinproduksjon i vitro45. Til slutt, i tillegg til IL-3, inneholder WEHI-3-betinget medium mange biologisk aktive molekyler som kan påvirke MC-funksjoner. BMCMCer oppnådd med WEHI-3-betinget medium er derfor sannsynlig å avvike fra BMCMCer oppnådd med rekombinant IL-3 (eller med rekombinant IL-3 pluss SCF). Det har vært få studier av om eller hvor lenge slike forskjeller i fenotypene av BMCMCer generert i forskjellige typer kulturmedium beholdes etter cellenes engraftment i forskjellige anatomiske steder in vivo, og ytterligere studier av denne typen kan være av interesse. Men uavhengig av de valgte kulturforholdene, bør den samme kulturmediumoppskriften brukes til å generere alle BMCMC-ene som skal brukes til engraftment i eksperimenter som resultatene vil bli samlet for analyse. Videre bør MCs dyrkes i minst 4 til 6 uker før deres engraftment i MC-mangelfulle mus, for å nå en renhet på 95-98% (Figur 2). Dette er for å redusere muligheten for at tilstedeværelsen, i "BMCMC-populasjonene", av hematopoietiske celler annet enn de som er forpliktet til mastcellelinjen (som er til stede i kulturene ved tidlige intervaller etter å ha plassert benmargscellene i vitro) kan resultere i utseendet på donor-avledede celler i tillegg til MCs imastcellen knock-in' mus.

Vi presenterer her en detaljert protokoll for å engrafere MC-mangelfulle mus med vill type eller mutant BMCMCer intraperitoneally (i.p.), intravenøst (i.v.) eller intradermally (dvs.) i øret pinna, siden disse injeksjonsrutene har blitt brukt av mange etterforskere. Imidlertid har BMCMCer også blitt vellykket engrafert inn i bakhuden47, i fotputen48, intraartikulært49 eller intrakranialt50,51. Antall BMCMCer som skal engraferes, samt intervallet mellom engraftment og eksperiment, kan variere avhengig av injeksjonsveien og det målrettede organet til engraft (figur 1). Det er svært viktig å respektere slike intervaller etter å ha engrafert BMCMCene før du starter eksperimentet for å gi tilstrekkelig tid til at BMCMCer (som ikke er fullt modne MCs) blir mer modne in vivo. Fordi innholdet av mediatorer som er lagret i MC-ens cytoplasmatiske granulater kan fortsette å øke i løpet av cellens levetid38,52, for visse eksperimenter kan man ønske å øke intervallet mellom MC-engraftment og initiering av eksperimentet for å vurdere MC-funksjon.

Avhengig av injeksjonsruten og/eller antallet BMCMCer som injiseres, kan tallene og/eller anatomisk fordeling av de adoptivt overførte MCene avvike fra de tilsvarende innfødte MC-populasjonene i villtypemus12,23,53,54. MC-mangelfulle mus engrafted i.p. eller i.d. med BMCMCs kan ha omtrent samme antall og distribusjon av MCs enn den innfødte MC-befolkningen i vill type mus, i bukhulen og mesenteri og i dermis, henholdsvis når vurdert 4 til 8 uker etter MC overføring12,23. Intravenøs overføring av BMCMCer fører ikke til normale MC-tall og/eller distribusjon i de fleste vev. For eksempel finnes det ingen eller svært få MCer i huden til slike i.v.-engrafted 'mastcelle knock-in' mus. Ved 4-28 uker etter i.v. injeksjon av BMCMCer i MC-mangelfulle mus, er antall MCer i luftrøret betydelig lavere enn de i de tilsvarende villtypemusene. Til sammenligning er antall MCer i periferien av lungen vanligvis større enn de i de tilsvarende villtypemusene12,23,53,55. I.v. overføring av BMCMCer resulterer også i høye nivåer av MCs i milten, mens svært få innfødte MCs er vanligvis funnet i dette organet i vill type mus23,56. Det er viktig at tidligere rapporter viste at i.v. injeksjon av BMCMCer i MC-mangelfulle mus ikke klarer å resultere i engraftment av MC-populasjonene på spesifikke anatomiske steder som ryggmargen, lymfeknuter eller hjerte54,57. Flere grupper har også bemerket at slik i.v. engraftment ikke resulterer i engraftment av tarm mucosal MC (MMC) befolkningen23,58-60. Slike forskjeller i MC-numre og/eller distribusjon av adoptiv overførte MCer kontra innfødte MCer må tas i betraktning ved tolkning av data innhentet ved hjelp av MC'mastcelle knock-in' modell9.

Det finnes flere stammer av MC-mangelfulle mus, og det er viktig å velge hvilke(e) som skal brukes i et bestemt prosjekt. c-kit mutant MC-mangelfulle mus, for eksempel KitW/ W-v eller KitW-sh / W-sh mus, har tradisjonelt blitt brukt av mange etterforskere. Imidlertid lider slike mus av mangec-kit-relatertefenotypiske abnormiteter ved siden av deres dype MC-mangel (Tabell 1). De siste årene har flere stammer av mus medc-kit-uavhengig konstituerende MC-mangel blitt rapportert24-26. Noen av disse musene viser også andre fenotypiske abnormiteter ved siden av MC-mangelen (tabell 1), og ytterligere abnormiteter kan også oppdages da fenotypen til disse nylig beskrevne stammene fortsatt er under etterforskning. Alle disse musene og noen ekstra nye typer MC-mangelfulle mus har nylig blitt gjennomgått i detalj9,10,13.

Gitt begrensningene til hver av mc-mangelfulle stammer som for øyeblikket er tilgjengelige, anbefaler vi at du prøver å teste hypoteser om MC-funksjon ved hjelp av mer enn én modell av MC-mangel9. I vårt laboratorium utfører vi generelt piloteksperimenter i KitW-sh/W-sh og Cpa3-Cre; Mcl-1fl/fl mus. Hvis vi oppnår konkordantresultater i begge typer MC-mangelfulle mus, fortsetter vi med å engraftment eksperimenter for å fastslå rollen til MCs og vurdere de potensielle rollene til visse MC-avledede produkter. Til slutt bør det bemerkes at flere stammer som tillater inducible uttømming av MCs eller Cre recombinase-mediert sletting av "floxed" gener i MCs har også nylig blitt beskrevet25,49,61. Disse stammene har blitt gjennomgått i detalj andre steder9,10,13 og representerer lovende alternative - eller komplementære - tilnærminger for å studere MC-funksjoner in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

N.G. er mottaker av stipendiater fra den franske "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" og Philipp Foundation; R.S. støttes av Lucile Packard Foundation for Children's Health og Stanford NIH/NCRR CTSA-tildelingsnummer UL1 RR025744; P.S. støttes av et Max Kade Fellowship fra Max Kade Foundation og Det østerrikske vitenskapsakademiet og et Schroedinger Fellowship of the Austrian Science Fund (FWF): J3399-B21; S.J.G. anerkjenner støtte fra National Institutes of Health tilskudd U19 AI104209, NS 080062 og fra Tobacco-Related Disease Research Program ved University of California; L.L.R. anerkjenner støtte fra Arthritis National Research Foundation (ANRF) og National Institutes of Health grant K99AI110645.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25 G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30 G x 1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1% Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as 'tunable' effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models - Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. 'Sash' mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 99 c-kit stamcellefaktor FcεRI immunglobulin E musemodell adoptivoverføring immunologi allergi
Analysere funksjonene til mastceller <em>In Vivo</em> ved hjelp av '<em>Mast Cell Knock-in</em>' Mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, … More

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter