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Immunology and Infection

Analisando as funções das células de mastro em Vivo usando 'Mast Cell Knock-in' Ratos

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52753
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

Summary

Descrevemos um método para a geração de células de mastro derivadas in vitro, seu enenxerto em camundongos deficientes de células de mastro, e a análise do fenótipo, números e distribuição de células de mastro engrafadas em diferentes sítios anatômicos. Este protocolo pode ser usado para avaliar as funções das células de mastro in vivo.

Abstract

As células de mastro (MCs) são células hematopoiéticas que residem em vários tecidos, e são especialmente abundantes em locais expostos ao ambiente externo, como pele, vias aéreas e trato gastrointestinal. Mais conhecidos por seu papel prejudicial em reações alérgicas dependentes de IgE, os MCs também surgiram como atores importantes na defesa do hospedeiro contra veneno e bactérias invasoras e parasitas. O fenótipo e a função do MC podem ser influenciados por fatores microambientais que podem diferir de acordo com a localização anatômica e/ou com base no tipo ou estágio de desenvolvimento das respostas imunes. Por essa razão, nós e outros temos favorecido abordagens in vivo sobre métodos in vitro para obter insights sobre funções mc. Aqui, descrevemos métodos para a geração de MCs cultivados derivados da medula óssea do camundongo (BMCMCs), sua transferência adotiva para camundongos geneticamente deficientes em MC, e a análise dos números e distribuição de MCs adotivamente transferidos em diferentes locais anatômicos. Este método, chamado de abordagem de"knock-in" de células de mastro, tem sido amplamente utilizado nos últimos 30 anos para avaliar as funções de MCs e produtos derivados de MC in vivo. Discutimos as vantagens e limitações desse método, à luz de abordagens alternativas que vêm sendo desenvolvidas nos últimos anos.

Introduction

As células de mastro (MCs) são células hematopoiéticas que surgem de progenitores pluripotentes da medula óssea1-3. Após a egressão da medula óssea, os progenitores de MCs migram para vários tecidos onde se desenvolvem em MCs maduros sob a influência de fatores de crescimento locais1-3. Os MCs residentes em tecidos estão estrategicamente localizados em interfaces de ambiente hospedeiro, como a pele, as vias aéreas e o trato gastrointestinal, onde se comportam como uma primeira linha de defesa contra insultos externos3-6. Os MCs são frequentemente sub-classificados com base em suas características fenotípicas "base" e suas localizações anatômicas. Em camundongos, dois tipos de MCs foram descritos: MCs (CTMCs) e MUCOSal MCs (MMCs)1-3,7,8. Os CTMCs são frequentemente localizados em torno de venules e fibras nervosas próximas, e residem em cavidades sorosais, enquanto os MMCs ocupam locais intraepiteliol no intestino e mucosa respiratória1-3.

Inúmeras metodologias têm sido aplicadas para estudar funções biológicas dos MCs9-13. Muitos grupos se concentraram em abordagens in vitro usando linhas celulares (como as linhas mc humanas HMC114 ou LAD215,16),MCs derivados in vitro (como MCs17derivados do sangue periféricos humanos ou M cultivados de medula óssea do rato CS [BMCMCs]18, MCs cultivados derivados da pele fetal [FSCMCs]19 e MCs derivados de células peritoneais [PCMCs]20) ou MCs isolados ex vivo de diferentes sítios anatômicos. Todos esses modelos são amplamente utilizados para estudar detalhes moleculares da biologia mc, como sinalizar caminhos envolvidos na ativação do MC. No entanto, um aspecto importante da biologia dos MCs é que suas características fenotípicas e funcionais (por exemplo,conteúdo de granase de grânulo citoplasmônico ou resposta a diferentes estímulos) podem ser moduladas por localização anatômica e microambiente2,7. Uma vez que a mistura exata de tais fatores que são encontrados in vivo pode ser difícil de reproduzir in vitro,favorecemos o uso de abordagens in vivo para obter insights sobre as funções de MCs9.

Existem várias cepas de camundongos com deficiência genética de MC, como os amplamente utilizados WBB6F1-Kit W/W-v ou C57BL/6-Kit W-sh/W-sh. Estes camundongos carecem de expressão e/ou atividade do KIT (CD117), o receptor para o principal fator de crescimento do MC fator de células-tronco (SCF)21,22. Como resultado, esses camundongos têm uma deficiência de MC profunda, mas também têm anormalidades fenotípicas adicionais relacionadas às suas mutações dekit c (nos camundongos WBB6F1-Kit W/W-v) ou aos efeitos da grande inversão cromossômica que resulta em expressão reduzida dokit C (no C57BL/6-Kit W-sh/W-sh mouses)9,10,12,23. Mais recentemente, várias cepas de camundongos comc-kit-deficiência de MC constitutivo independente foram relatadas24-26. Todos esses camundongos e alguns novos tipos adicionais de camundongos deficientes de MC indutíveis foram recentemente revisados em detalhes9,10,13.

Aqui, descrevemos métodos para a geração de MCs cultivados derivados da medula óssea do camundongo (BMCMCs), sua transferência adotiva para camundongos deficientes em MC, e a análise dos números e distribuição de MCs adotivamente transferidos em diferentes locais anatômicos. Este método chamado "mastro celular knock-in" pode ser usado para avaliar as funções de MCs e produtos derivados de MC in vivo. Discutimos as vantagens e limitações desse método, à luz de abordagens alternativas que vêm sendo desenvolvidas nos últimos anos.

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Protocol

Todos os cuidados e experimentações em animais foram realizados em conformidade com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e com a aprovação específica do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Stanford.

1. Geração e Caracterização de Células de Mastros Cultivados Derivados da Medula Óssea (BMCMCs).

Nota: Os BMCMCs doadores devem ser gerados a partir de células de medula óssea do mesmo fundo genético que os camundongos receptores com deficiência de MC. BMCMCs doadores derivados do sexo masculino não são adequados para enxerto de camundongos fêmeas. Os BMCMCs doadores derivados de mulheres terão sucesso em receptores masculinos e femininos.

  1. Extração de medula óssea.
    1. Despeje a solução salina tamponada de fosfato estéril (PBS) em 6 placas de cultura de poço (1 bem por rato) e coloque no gelo.
    2. Mergulhe os instrumentos de dissecção em 70% de etanol para esterilização.
    3. Eutanize camundongos doadores por inalação de dióxido de carbono (CO2), seguido de deslocamento cervical, depois pulverizar os camundongos com 70% de etanol nos locais de manipulação.
    4. Use instrumentos de dissecção estéreis para extrair os ossos do fêmur, tíbia e fíbula sem cortar nenhuma epífise óssea.
    5. Ao proteger os ossos com um fórceps, raspe todos os tecidos dos ossos (e descarte fíbulas) usando tesouras estéreis (ou lâminas de bisturi). Coloque ossos em PBS no gelo até que todos os ossos sejam coletados.
    6. Realize todas as etapas restantes na capa de cultura tecidual estéril. Usando instrumentos estéreis, proteja os ossos com fórceps e corte ambas as epífitas para expor a cavidade medular.
    7. Usando seringas de 3 ml e agulhas de 30 G, e meio de descarga a frio (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] suplementado com soro de bezerro fetal de 10% [FCS, inativado pelo calor], 2 mM L-glutamina, 1% solução antimicópica antibiótico-antimíctica, 50 μM Β-mercaptoethanol), lave a medula óssea vermelha em uma placa de Petri.
    8. Use a mesma seringa para dissociar aglomerados de células de medula óssea lavadas por aspiração e ejeção suave repetidas.
    9. Piscina femoral e medula óssea tibial de cada rato em um tubo centrífuga de 15 ml. Encha o tubo com meio de descarga a frio para lavar as células da medula óssea e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C.
  2. Cultura BMCMCs.
    1. Remova o supernascer e recupere células de medula óssea pelleted em 10 ml de meio de cultura (DMEM suplementado com soro de bezerro fetal de 10% [FCS, inativado pelo calor], 2 mM L-glutamina, 1% solução antibiótico-antimicocética, 50 μM Β-mercaptoetanol e 20% meio wehi-3 condicionado celular [como fonte de IL-3; usar alternativamente o rato recombinante IL-3 a 10 ng/ml]).
    2. Coloque células no frasco de cultura tecidual de tamanho apropriado (por exemplo,T25 para 1 mouse, T75 para 2 ratos, etc.).
    3. 1-2 dias após as células de chapeamento, transfira células médias e suspensas (deixando detritos e células aderentes grudados no fundo do frasco) para um novo frasco e adicione meio de cultura fresco (10 ml/mouse).
    4. Durante as semanas seguintes, as células de alimentação a cada 3-4 dias (adicione 10 ml de cultura média por rato). Manter a densidade celular entre 2,5 x 105-1 x 106 células/ml. Transfira células não aderentes para um novo frasco uma vez por semana até que nenhuma célula aderente esteja presente no frasco de cultura. Teste a maturidade das células (veja abaixo) antes de usar para ensaios in vitro ou engraftment em camundongos deficientes de MC.
      NOTA: A completa diferenciação dos BMCMCs levará de 4 a 6 semanas.
  3. Avaliação da maturidade da BMCMC.
    1. Usando citometria de fluxo.
      1. Lave as células (5 x 104-5 x 105 células/condição) com tampão FACS gelado (PBS, 0,5% FCS) em tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml. Centrifugar a 400 x g por 5 min a 4 °C. Aspirante supernante.
      2. Diluir anticorpos monoclonais anti-rato CD16/32 (clone 93 ou 2.4G2) anticorpos monoclonais 1:200 (2,5 μg/ml) no buffer FACS. Adicione 10 μl a cada pelota e resuspend por um breve vórtice. Incubar 5 minutos no gelo para bloquear a ligação fc.
        NOTA: Proteja as amostras contra luz direta para todas as etapas restantes.
      3. Ficoerythrin diluída (PE) conjugado anti-rato Fc εRI α (clone MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) e isocitonato conjugado de fluoresceína (FITC) anti-rato conjugado KIT (CD117; clone 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("solução de coloração"), ou os respectivos anticorpos de controle de isótipo rotulados no buffer FACS ("solução de controle de isótipo").
      4. Divida metade das células bloqueadas da etapa 1.3.1.2) em um tubo inferior redondo de poliestireno adicional e adicione 20 μl de "solução de coloração" em um tubo e 20 μl de "solução de controles de isótipo" no outro tubo. Incubar 30 minutos no gelo.
      5. Adicione 3 ml de tampão FACS gelado e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernascimento e resuspenque a pelota em 300 μl de tampão FACS contendo 1 μg/ml de iodeto de propídio (PI, para identificação de células mortas). Proceder à análise de citometria de fluxo (ver Figura 2A).
    2. Usando coloração azul toluidina.
      1. Lave 1 x 105 células uma vez com PBS por centrifugação a 400 x g por 5 min a temperatura ambiente, depois aspire e resuspend células em 200 μl de PBS.
      2. Transfira a suspensão celular para um citofunnel preparado ligado a um slide de microscópio e prossiga com cito-centrifugação usando um cytocentrifuge (40 x g por 5 min).
      3. Slides secos de ar por 10 minutos e desenham um círculo de cera ao redor das células usando uma caneta PAP. Adicione 0,1% solução azul toluidina para cobrir as células. Incubar por 1 min. Lave lâminas em água da torneira por 1 min, depois lâminas secas por 10 minutos.
      4. Células de deslizamento de cobertura usando meio de montagem. Proceder à análise do microscópio leve (ver Figura 2B)

2. Engraftment de camundongos deficientes de células de mastro com BMCMCs.

  1. Enxerto de ouvido por injeção intradérmica (i.d.).
    NOTA: Para a transferência adotiva de BMCMCs para o pináculo de ouvido de camundongos deficientes de MC, recomendamos realizar duas injeções de 1 x 106 células cada (para um total de 2 x 106 células) por pina de ouvido. O enxerto intradérmico de BMCMCs no pináculo auditivo de camundongos deficientes de MC tem sido usado por muitos pesquisadores em vários modelos, incluindo modelos de anafilaxia cutânea passiva (PCA)24,27, defesa hospedeira contra venenos28, e reações de hipersensibilidade crônica (CHS)29,30.
    1. Contar e resuspend células em 4 x 107 BMCMCs/ml (1 x 106 BMCMCs/ 25 μl) em DMEM frio. Transfira a solução BMCMCs em uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de 30 G. Mantenha no gelo até a injeção.
    2. Anestesiar camundongos deficientes mc de 4-6 semanas usando isoflurane (2,5% v/v). Verifique a profundidade da anestesia por beliscar o dedo do sol, ajuste isoflurane se indicado e continue monitorando a respiração e a resposta de beliscar o dedo durante todo o procedimento. Aplique pomada oftálmica com uma ponta Q para evitar o ressecamento dos olhos.
    3. Com o dedo indicador, crie pressão vertical na face dorsal do pináculo auditivo para expor e esticar a face ventral.
    4. Realize duas injeções de 25 μl de i.d. da solução BMCMC em dois locais diferentes da face ventral do pina da orelha, a primeira injeção no meio da orelha e a segunda injeção em direção à ponta do pina auditivo. Aguarde de 4 a 6 semanas após o enxerto de identidade antes de realizar experimentos in vivo.
      Nota: Em nossa experiência, nesse momento o número de MCs/mm2 de dermis na parte central do pina ouvido geralmente é semelhante ao da localização correspondente em camundongos do tipo selvagem, enquanto os números de MCs/mm2 na periferia do pináculo auditivo são tipicamente substancialmente inferiores aos dos camundongos do tipo selvagemcorrespondentes 27,28. Isso deve ser mantido em mente ao projetar experimentos com tais camundongos mc-engrafados (por exemplo,agentes com possíveis efeitos na função MC devem ser injetados na parte central do pinnae do ouvido, e a análise dos efeitos desses tratamentos também deve se concentrar nessa área).
  2. Enxerto de cavidade peritoneal por injeção intraperitoneal (i.p.).
    NOTA: A transferência adotiva de BMCMCs para a cavidade peritoneal de camundongos deficientes de MC exigirá uma injeção de 2 x 106 células por rato. Tais injeções i.p. de BMCMCs em camundongos deficientes de MC têm sido usadas por muitos grupos para estudar os papéis dos MCs peritoneal em vários modelos, incluindo modelos de defesa do hospedeiro contra venenos31 ou sepse bacteriana32,33.
    1. Conte o número adequado de células e resuspend em 1 x 107 BMCMCs/ml (2 x 106 BMCMCs/ 200 μl) em DMEM frio. Transfira a solução BMCMCs em uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de 25 G. Mantenha no gelo até a injeção.
    2. Realize 1 injeção de 200 μl de solução de BMCMCs na cavidade peritoneal de camundongos deficientes mc de 4-6 semanas de idade. Aguarde de 4 a 6 semanas após o engraftment i.p. antes de realizar experimentos in vivo.
  3. Engraftment por injeção intravenosa (i.v.).
    NOTA:A transferência adotiva de BMCMCs por injeção i.v. em camundongos deficientes de MC exigirá uma injeção de 5 x 106 células por rato. Injeções intravenosas (i.v.) de BMCMCs em camundongos deficientes de MC têm sido usadas por muitos grupos para estudar os papéis dos MCs em vários modelos de doenças, incluindo modelos de infecção da bexiga34,asma35,fibrose pulmonar36e artrite mediada por anticorpos37.
    1. Conte o número adequado de células e resuspend em 2,5 x 107 BMCMCs/ml (5 x 106 BMCMCs/200 μl) em DMEM frio. Transfira a solução BMCMCs em uma seringa de 1 ml equipada com uma agulha de 30 G. Mantenha no gelo até a injeção.
    2. Anestesiar camundongos deficientes mc de 4-6 semanas usando isoflurane (2,5% v/v). Verifique a profundidade da anestesia por beliscar o dedo do sol, ajuste isoflurane se indicado e continue monitorando a respiração e a resposta de beliscar o dedo durante todo o procedimento. Aplique pomada oftálmica com uma ponta Q para evitar o ressecamento dos olhos.
    3. Realize uma injeção de 200 μl de solução BMCMC na veia traseira (ou, alternativamente, a veia retro-orbital) de um rato deficiente de MC. Aguarde 12 semanas após o engraftment i.v. antes de realizar experimentos in vivo.

3. Análise de camundongos deficientes de células de mastro engrafados.

  1. Análise de enxerto de ouvido.
    1. No final do experimento, eutanize camundongos por inalação de CO2 seguida de luxação cervical.
    2. Isole o pináculo da orelha e fixe em formalina tamponada de 10% (vol/vol) durante a noite a 4 °C. Incorpore pinnae de ouvido fixo em parafina, corte 4 μm seções de pináculo de ouvido e monte em lâminas de vidro.
    3. Manche os slides com uma solução azul toluidina de 0,1% por 1 min a temperatura ambiente. Lave lâminas na água da torneira por 1 min, depois deslizes secos por 10 minutos à temperatura ambiente.
    4. Slides de deslizamento de cobertura usando meio de montagem, em seguida, conte o número de MCs engrafados por seções pinnae usando um microscópio de luz. Avalie a eficiência de engraftment comparando a porcentagem e distribuição de MCs na pele do ouvido de camundongos engrafados versus camundongos do tipo selvagem.
  2. Análise de enxerto de cavidade peritoneal.
    1. Avaliação do número de células de mastro na cavidade peritoneal.
      1. No final do experimento, eutanize camundongos por inalação de CO2 seguida de luxação cervical. Remova cuidadosamente a pele ventral dos camundongos sem quebrar a cavidade peritoneal.
      2. Injete 5 ml de PBS de temperatura fria ou ambiente na cavidade peritoneal usando uma seringa de 5 ml equipada com uma agulha de 25 G. Use PBS frio para reduzir o risco de ativação de células peritoneais (isso é muito importante na avaliação da degranulação peritoneal mc ou níveis de alguns produtos derivados de MC no fluido de lavagem peritoneal). Faça uma massagem no abdômen por 20 segundos para colher células peritoneais.
      3. Aspire lentamente o lavage peritoneal usando uma seringa de 5 ml equipada com uma agulha de 22 G. Registo o volume de lavagem aspirada (espere recuperar até 80% do volume injetado).
      4. Transfira o fluido de lavage peritoneal em um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 ml e centrífuga a 400 x g por 5 min a 4 °C. Aspirante supernante. Recupere a pelota em PBS frio de 400 μl.
      5. Conte o número total de células peritoneais usando uma câmara hemótmica. Utilize metade da suspensão celular para uma análise de citometria de fluxo (conforme descrito na etapa 1.3.1), para avaliar a expressão percentual e marcador de MCs engrafados na cavidade peritoneal. Multiplique o número total de células peritoneais pelo percentual de MCs para obter número absoluto de MCs peritoneal.
      6. Realize uma citocentrifugação com as demais células, conforme descrito na etapa 1.3.2.2. Slides secos de ar por 10 minutos em temperatura ambiente e desenham um círculo de cera ao redor das células usando uma caneta PAP.
      7. Cubra células com solução de coloração may-grünwald não diluída por 5 minutos, seguida de lavagem em PBS por 5 min, ambas em temperatura ambiente. As células de cobertura com mancha de Giemsa diluídas 1:20 com água deionizada e incubam 20 min em temperatura ambiente. Lave lâminas 2 vezes na água da torneira por 1 min e, em seguida, lâminas secas a ar.
      8. As células de deslizamento cobrem usando meio de montagem e calculam a porcentagem de MCs engrafados usando um microscópio de luz (contando pelo menos 400 células totais). Avalie a eficiência de engraftment comparando a porcentagem de MCs na lavagem peritoneal de camundongos engrafados versus camundongos do tipo selvagem.
    2. Avaliação de células de mastro nas janelas mesentéricas.
      1. Seguindo o lavage peritoneal descrito na etapa 3.2.1, abra a membrana peritoneal para expor o trato intestinal dos camundongos. Disponha de 4 a 5 janelas mesentéricas por mouse em um slide.
      2. Fixar os slides por 1 hora na solução Carnoy (3:2:1 vol/vol/vol de etanol, clorofórmio e ácido acético glacial) à temperatura ambiente. Lâminas secas a ar e removem o intestino (as janelas mesentéricas fixas permanecerão presas aos slides).
      3. Manche os preparos por 20 minutos em temperatura ambiente com a solução de coloração csaba (azul alciano/safranin o).
        1. Para fazer 500 ml de mancha de Csaba, prepare 500 ml de tampão de acetato misturando 100 ml de solução de acetato de sódio de 1 M com 120 ml de 1 M HCl. Faça até 500 ml com água desionizada e ajuste pH para 1,42. Em seguida, dissolver 90 mg Safranin [identifica 'MCs maduros' em vermelho], 1,8 g azul alciano [identifica 'MCs imaturos' em azul] e 2,4 g sulfato de amônio férico NH4Fe(SO4)2 em 500 ml de tampão de acetato.
      4. Slides de deslizamento de cobertura usando meio de montagem, em seguida, conte o número de MCs engrafados por janela mesentric usando um microscópio de luz. Avalie a eficiência de engraftment comparando a porcentagem e distribuição de MCs nas janelas mesentéricas de camundongos engrafados versus ratos do tipo selvagem.
  3. I.v. análise de engraftment.
    1. Ao final do experimento, eutanize camundongos por inalação de CO2 seguida de luxação cervical, e colher tecido de interesse(por exemplo, pulmão, pele ou baço) e fixar durante a noite em 10% (vol/vol) formalina tamponada a 4 °C.
    2. Incorpore tecidos fixos em parafina, corte seções de 4 μm e monte em lâminas de vidro. Manche os slides com uma solução azul toluidina de 0,1% por 1 min a temperatura ambiente. Lave lâminas na água da torneira por 1 min, depois deslizes secos por 10 minutos.
    3. Slides de deslizamento de cobertura usando meio de montagem e avaliação do número e distribuição de MCs engrafados por seções de tecido usando um microscópio leve.

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Representative Results

Uma visão geral da abordagem 'mastro célula knock-in' é mostrada na Figura 1, e inclui a geração de BMCMCs, o número de células que devem ser engrafadas i.p., i.d. ou i.v. em camundongos deficientes de MC (o número pode ser variado se indicado com base no design experimental) e o intervalo entre engraftment e experimento dependendo do local da injeção (este intervalo também pode variar, se indicado; por exemplo,o conteúdo dos mediadores armazenados em grânulos citoplasmológicos MC aumenta constantemente com o tempo38). A Figura 2 mostra análises representativas de citometria de fluxo e coloração azul toluidina de BMCMCs após 1, 15 e 45 dias de cultura no meio DMEM contendo em 20% meio wehi-3 condicionado a células como fonte de IL-3. Observe que os BMCMCs cultivados por 45 dias são 95% puros, contêm altos números de grânulos citoplasmicos e podem ser usados para experimentos de enenxerção, enquanto células cultivadas por 15 dias não são adequadas para engrafamento. A Figura 3 mostra enxerto representativo bem sucedido no pináculo do ouvido 4 semanas após o engraftment i.d.(Figura 3A), em janelas mesentéricas(Figura 3B) e cavidade peritoneal(Figura 3C) 6 semanas após o engrafamento i.p. e no pulmão(Figura 3D) 12 semanas após i.v. engraftment.

Figure 1
Figura 1: 'Mast cell knock-in' mouse modelo para análises de funções MC in vivo. MCs cultivados de medula óssea (BMCMCs) são gerados por células de medula óssea cultivadas por pelo menos 4-6 semanas em 20% meio wehi-3 condicionado a células como fonte de IL-3 (ou, alternativamente, em meio contendo 10 ng/ml recombinante mouse IL-3). Estes BMCMCs podem então ser engrafados em camundongos deficientes de MC para criar os chamados ratosde knock-in ' células de mastro. BMCMCs podem ser injetados por diferentes rotas (intravenosas [i.v.], intraperitoneal [i.p.] ou intradérmica [i.d.]) para reconstituição local (i.d., i.p.) ou sistêmica (i.v.) de várias populações de MC. As funções mc(s) em várias respostas biológicas podem então ser analisadas comparando as respostas em ratos do tipo selvagem, camundongos deficientes de MC e ratos' knock-in ' células de mastro. A contribuição(s) de produtos específicos de MC pode ser analisada comparando respostas de ratos' mastros de células de mastro' engrafados com bmcmcs tipo selvagem ou BMCMCs derivados de camundongos que não têm, ou expressam formas geneticamente alteradas de tais produtos. (Esta é uma versão modificada da Figura 1 do ref.12).

Figure 2
Figura 2: Avaliação da pureza das preparações do BMCMC por citometria de fluxo e microscopia. (A) Análises representativas da citometria de fluxo da expressão FcεRIα e KIT (CD117) na superfície de 1 dia (painel esquerdo), 15 dias (painel médio) e 45 dias (painel direito) antigas células mortas de propidium (PI) foram excluídas da análise (não mostrada). Os números indicam a porcentagem de FcεRIα+KIT+ BMCMCs fechados no quadrado azul. (B) Fotos representativas de BMCMCs manchados com azul toluidina, painel inferior é uma ampliação das regiões do painel superior definidas em linhas pontilhadas pretas. Barras = 10 μm.

Figure 3
Figura 3: Avaliação da eficiência do engrafamento mc em vários locais anatômicos. (A) Fotos representativas de seções de pináculo de ouvido de 4 μm manchadas com azul toluidina. (B) Fotos representativas de janelas mesentéricas manchadas com Safranin/Acian Blue (mancha de Csaba). (C) Fotos representativas de células presentes em fluidos de lavage peritoneal e manchadas com May-Grünwald Giemsa (MGG). (D) Fotos representativas de seções pulmonares de 4 μm manchadas com azul toluidina. Barras = 50 μm(A, B e D) ou 20 μm(C). As imagens são de ratos do tipo selvagem C57BL/6 (painel superior), kitw-sh/W-sh (painel médio) e camundongos deficientes mc engrafados com BMCMCs tipo selvagem: BMCMCs KitW-sh/W-sh (painel inferior). Os MCs são indicados com setas.

mouses Fundos disponíveis Números mc
(estado estável)		 Outros fenótipos (revisados em9,10,13) Engraftments relatados com BMCMCs
KitW/W-v (WB/Re x C57BL/6) F1
(Jackson Laboratories –
WBB6F1/J-KitW/KitW-v/J)		 Ausência de MCs de tecido conjuntivo e mucosa Anemia, números reduzidos de basófilos e neutrófilos, deficiências em melanócitos e células intersticiciais de Cajal, estéril, etc. i.v.35,37; i.p.31,62; i.d.28,29; i.c.50,51; i.a.49; fp.i. 63
KitW-sh/W-sh C57BL/6
(Jackson Laboratories –
O B6. Cg-KitW-sh/HNihrJaeBsmJ) Análise de polimorfismo de nucleotídeo único realizada nos laboratórios de Jackson mostra que esses camundongos têm apenas ~87% de C57BL/6-genética.		 Ausência de MCs de tecido conjuntivo e mucosa Aumento moderado no número de basófilos e neutrófilos, aumento do número de células supressoras derivadas de mieloides64, deficiências em melanócitos e células intersticiais de Cajal i.v.23,34-36; i.p.31,62; i.d.28,29; i.a.49
C57BL/6J62
(Jackson Laboratories –
O B6. Cg-KitWsh/HNihrJaeBsmGlliJ) Estes ratos foram cruzados >11 vezes no fundo C57BL/6J.
BALB/c65
(C.B6-KitW-sh)
Mcpt5-Cre;
R-DTA 		C57BL/625
(Tg(Cma1-cre) ARoer; B6.129P2-Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Lky/J)		 Reduções acentuadas no peritoneal (98%) e pele (89-96,5%) MCs, MCs mucosas improváveis de serem esgotados Provável presença de MCs mucosas; ratos repórteres revelam exclusão mediada por Cre de transgene YFP 'floxed' em ~30% de baço células NK66 nenhum
Cpa3Cre/+ C57BL/626
(B6.129P2-Cpa3tm3(icre)Hrr)		 Ausência de MCs de tecido conjuntivo e mucosa Cpa3 expresso em outros tipos de células; números reduzidos de basófilos i.v.26
BALB/c26
(B6.129P2/OlaHsd.BALB/c-Cpa3tm3(icre)Hrr)
Cpa3-Cre;
Mcl-1fl/fl 		C57BL/624
(Tg(Cpa3-cre)3Glli; B6;129-Mcl1tm3sjkJ)		 Ausência de MCs de tecido conjuntivo e mucosa Cpa3 expresso em outros tipos de células; aumento do spleen neutrófilos e anemia leve;
números reduzidos de basófilos		 I.D.24;
i.a.49
i.v. (nossos dados não publicados)

Tabela 1: Cepas de camundongos com deficiências de MC constitutivos. Várias cepas de camundongos comc-kit-dependente ouc-kit- deficiência de MC constitutivo independente estão disponíveis. Em princípio, todas essas cepas podem ser usadas para gerar ratos' mastros de células knock-in' (embora, pelo que sabemos, isso ainda não foi relatado para Mcpt5-Cre; Ratos R-DTA). No entanto, cada uma dessas cepas tem outras anormalidades fenotípicas e limitações que devem ser mantidas em mente ao interpretar os resultados obtidos com esses camundongos. Alguns exemplos de enxerto mc bem sucedido podem ser encontrados nas referências. (Esta é uma versão modificada e atualizada da Tabela 1 a partir do ref.9).

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Discussion

Quase 30 anos após sua descrição inicial38, a abordagem 'mastro célula knock-in' continua a fornecer informações valiosas sobre o que os MCs podem ou não fazer in vivo. As funções dos MCs foram há muito tempo pensadas para se limitar ao seu papel na alergia. Os dados gerados usando a abordagem 'mastro célula knock-in' mudaram essa visão, fornecendo evidências de que os MCs podem, entre outras funções, desempenhar papéis críticos na defesa do hospedeiro contra certos patógenos4,39 ou venenos28,31, ou podem até mesmo suprimir certas respostas imunes29,34,40.

Em nossa descrição do protocolo, decidimos focar na geração e engrafia de MCs cultivados derivados da medula óssea (BMCMCs), porque um grande número dessas células pode ser gerada in vitro a partir da medula óssea de tipo selvagem ou camundongos mutantes. No entanto, os MCs também podem ser cultivados diretamente a partir de células-tronco embrionárias (MCs cultivados por células-tronco embrionárias [ESCMCs])41 e, quando geneticamente compatíveis, essas células também podem ser usadas para enxertment em camundongos deficientes em MC. Esta abordagem alternativa é particularmente interessante para estudar o papel de uma proteína cuja deficiência induz a letalidade embrionária em camundongos e, portanto, para a qual bMCMCs deficientes para essa proteína não podem ser gerados. Tanto BMCMCs quanto ESCMCs também podem ser transduzidos in vitro com lentivírus codificando genes de interesse ou shRNA para silenciar genes de interesse, antes de o enxerto dessas células em camundongos deficientes de MC31,33.

Geralmente usamos 20% de meio WEHI-3 como fonte de IL-3 para a cultura de BMCMCs. No entanto, o IL-3 recombinante (10 ng/ml, conforme descrito na etapa 1.2.1) também pode ser usado, e a adição de fator de célula-tronco recombinante (SCF) ao meio da cultura pode aumentar substancialmente o número de BMCMCs gerados42,43. Dependendo do estudo, foram utilizados 10 a 100 ng/ml de SCF recombinante, além do IL-3, para gerar BMCMCs36,44,45. Deve-se ter em mente que os preparativos de SCF recombinantes murine disponíveis comercialmente de diferentes fornecedores podem diferir em sua potência em influenciar o desenvolvimento de BMCMCs. Também é importante reconhecer que detalhes da abordagem utilizada para gerar BMCMCs (como se se adiciona SCF recombinante ao meio contendo IL-3, a duração do período cultural, etc.) podem influenciar o fenótipo e a função dessas células. Por exemplo, foi relatado que os BMCMCs cronicamente expostos à SCF aumentaram os níveis de histamina e certos proteases44,46, mas exibem uma atenuação acentuada da degranulação mediada por FcεRI e produção de citocina in vitro45. Finalmente, além do IL-3, o meio WEHI-3-conditioned contém muitas moléculas biologicamente ativas que podem afetar as funções mc. Os BMCMCs obtidos com meio WEHI-3-conditioned são, portanto, propensos a diferir de BMCMCs obtidos com IL-3 recombinante (ou com IL-3 mais SCF recombinante). Há poucos estudos sobre se ou por quanto tempo tais diferenças nos fenótipos de BMCMCs gerados em diferentes tipos de meio de cultura são retidos após o enenerxerto das células em diferentes sítios anatômicos in vivo,e estudos adicionais desse tipo podem ser de interesse. No entanto, independentemente das condições de cultura escolhidas, a mesma receita média de cultura deve ser usada para gerar todos os BMCMCs a serem utilizados para engraftment em experimentos dos quais os resultados serão agrupados para análise. Além disso, os MCs devem ser cultivados por pelo menos 4 a 6 semanas antes de seu enxerto em camundongos deficientes de MC, a fim de atingir uma pureza de 95-98%(Figura 2). Isto é para reduzir a possibilidade de que a presença, nas "populações BMCMC", de células hematopoiéticas que não sejam aquelas comprometidas com a linhagem de células de mastro (que estão presentes nas culturas em intervalos iniciais após a colocação das células de medula óssea in vitro) possa resultar no aparecimento de células derivadas de doadores, além de MCs nos ' camundongosde células de mastro' knock-in.

Apresentamos aqui um protocolo detalhado para engrafar camundongos deficientes de MC com tipo selvagem ou BMCMCs mutantes intraperitoneally (i.p.), intravenosamente (i.v.) ou intradermicamente (i.d.) no pina de ouvido, uma vez que essas rotas de injeção têm sido usadas por muitos investigadores. No entanto, os BMCMCs também foram enxertados com sucesso na peletraseira 47, no footpad48, intra-articular49 ou intra-cranially50,51. O número de BMCMCs para engrafar, bem como o intervalo entre engraftment e experimento, pode variar dependendo da rota da injeção e do órgão alvo para engraft(Figura 1). É muito importante respeitar esses intervalos após o enxerto dos BMCMCs antes de iniciar o experimento, a fim de permitir tempo suficiente para os BMCMCs (que não são MCs totalmente maduros) se tornarem mais maduros in vivo. Como o conteúdo dos mediadores armazenados nos grânulos citoplasmados do MC pode continuar aumentando durante a vida útil da célula38,52, para certos experimentos pode-se desejar aumentar o intervalo entre o engrafamento mc e o início do experimento para avaliar a função MC.

Dependendo da rota de injeção e/ou dos números de BMCMCs injetados, os números e/ou distribuição anatômica dos MCs adotivamente transferidos podem diferir dos dos mcs nativos correspondentes em camundongos do tipo selvagem12,23,53,54. Camundongos deficientes mc engrafados i.p. ou i.d. com BMCMCs podem ter cerca dos mesmos números e distribuição de MCs do que a população nativa de MC em camundongos do tipo selvagem, na cavidade peritoneal e mesentery e na derme, respectivamente, quando avaliados 4 a 8 semanas após a transferência de MC12,23. A transferência intravenosa de BMCMCs não leva a números normais de MC e/ou distribuição na maioria dos tecidos. Por exemplo, não ou muito poucos MCs são encontrados na pele de tais ratos i.v.-engrafted 'mastro 'mastro' célula knock-in' . Em 4-28 semanas após a injeção i.v. de BMCMCs em camundongos deficientes de MC, o número de MCs na traqueia são substancialmente menores do que aqueles nos camundongos do tipo selvagem correspondentes. Em contrapartida, o número de MCs na periferia do pulmão é tipicamente maior do que os dos camundongos do tipo selvagemcorrespondentes 12,23,53,55. A transferência de BMCMCs também resulta em altos níveis de MCs no baço, enquanto pouquíssimos MCs nativos são tipicamente encontrados neste órgão em camundongos do tipo selvagem23,56. É importante ressaltar que relatórios anteriores demonstraram que a injeção i.v. de BMCMCs em camundongos deficientes de MC não resulta em engrafamento das populações de MC em locais anatômicos específicos, como medula espinhal, linfonodos ou coração54,57. Vários grupos também observaram que tal engraftment i.v. não resulta em engraftment da população de mucosal intestinal MC (MMC)23,58-60. Tais diferenças nos números de MC e/ou distribuição de MCs adotivamente transferidos versus MCs nativos devem ser levadas em conta ao interpretar dados obtidos usando o modelo9'de célula de mastrodo MC ' .

Existem várias cepas de camundongos deficientes de MC e escolher qual deles usar em um determinado projeto é importante. c-kit mutante MC-deficiente ratos, como KitW/W-v ou KitW-sh/W-sh ratos, têm sido tradicionalmente usados por muitos investigadores. No entanto, tais camundongos sofrem de muitas anormalidades fenotípicas relacionadas aokitao lado de sua profunda deficiência de MC(Tabela 1). Nos últimos anos, várias cepas de camundongos comc-kit-deficiência constitutiva independente de MC foram relatadas24-26. Alguns desses camundongos também apresentam outras anormalidades fenotípicas ao lado de sua deficiência de MC(Tabela 1),e anormalidades adicionais também podem ser descobertas, pois o fenótipo dessas cepas recém-descritas ainda está sob investigação. Todos esses camundongos e alguns novos tipos adicionais de camundongos deficientes de MC foram recentemente revisados em detalhes9,10,13.

Dadas as limitações de cada uma das cepas deficientes de MC atualmente disponíveis, recomendamos tentar testar hipóteses sobre a função MC usando mais de um modelo de deficiência de MC9. Em nosso laboratório, geralmente realizamos experimentos piloto em KitW-sh/W-sh e Cpa3-Cre; Mcl-1fl/fl ratos. Se obtivermos resultados concordantes em ambos os tipos de camundongos deficientes de MC, então procedemos a experimentos de engraftment para determinar o papel dos MCs e avaliar os papéis potenciais de certos produtos derivados de MC. Finalmente, deve-se notar que várias cepas que permitem o esgotamento indutível de MCs ou a exclusão mediada por Cre de genes "floxed" em MCs também foram recentemente descritas25,49,61. Essas cepas foram revisadas detalhadamente em outros lugares9,10,13 e representam abordagens alternativas promissoras - ou complementares - para estudar as funções de MC in vivo.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

N.G. é o beneficiário de bolsas da francesa "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" e da Fundação Philipp; A R.S. é apoiada pela Lucile Packard Foundation for Children's Health e pelo prêmio Stanford NIH/NCRR CTSA, número UL1 RR025744; P.S. é apoiado por uma Bolsa Max Kade da Fundação Max Kade e da Academia Austríaca de Ciências e uma Bolsa Schroedinger do Fundo Austríaco de Ciência (FWF): J3399-B21; S.J.G. reconhece apoio de institutos nacionais de saúde doem U19 AI104209, NS 080062 e do Programa de Pesquisa de Doenças Relacionadas ao Tabaco na Universidade da Califórnia; L.L.R. reconhece o apoio da Fundação Nacional de Pesquisa da Artrite (ANRF) e dos Institutos Nacionais de Saúde doem K99AI110645.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25 G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30 G x 1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1% Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03

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Analisando as funções das células de mastro <em>em Vivo</em> usando '<em>Mast Cell Knock-in</em>' Ratos
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Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, … More

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).

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