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Immunology and Infection

Análisis De Las Funciones De Los MastOcitos In Vivo Usando ' MastCell Knock-in' Ratones

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52753
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

Summary

Describimos un método para la generación de células de mástil derivadas in vitro, su engraftment en ratones célula-deficientes del mástil, y el análisis del fenotipo, de los números y de la distribución de las células de mástil engrafted en diversos sitios anatómicos. Este protocolo se puede utilizar para evaluar las funciones de los mastocitos in vivo.

Abstract

Los mastocitos (MCs) son células hematopoyéticas que residen en diversos tejidos, y son especialmente abundantes en sitios expuestos al medio externo, como la piel, las vías respiratorias y el tracto gastrointestinal. Mejor conocidos por su papel perjudicial en las reacciones alérgicas dependientes de IgE, los MCs también han surgido como actores importantes en la defensa del huésped contra el veneno y las bacterias y parásitos invasores. El fenotipo y la función del mc pueden ser influenciados por los factores microambientales que pueden diferir según la localización anatómica y/o basado en el tipo o la etapa del desarrollo de inmunorespuestas. Por esta razón, nosotros y otros hemos favorecido los acercamientos in vivo sobre métodos ines vitro para ganar la penetración en funciones de la bujía métrica. Aquí, se describen los métodos para la generación de ratón derivado de la médula ósea cultivada MCs (BMCMCs), su transferencia adoptiva en ratones genéticamente deficientes en MC, y el análisis de los números y la distribución de MCs transferidos adoptivamente en diferentes sitios anatómicos. Este método, denominado el enfoque'mast cell knock-in', se ha utilizado ampliamente en los últimos 30 años para evaluar las funciones de los MC y los productos derivados de MC in vivo. Discutimos las ventajas y las limitaciones de este método, a la luz de los acercamientos alternativos que se han desarrollado en los últimos años.

Introduction

Los mastocitos (MCs) son células hematopoyéticas que surgen de progenitores pluripotentes de la médula ósea1-3. Después de la egressión de la médula ósea, los progenitores de las MCs migran a varios tejidos donde se convierten en MCs maduros bajo la influencia de factores de crecimiento locales1-3. Los MCs residentes en tejidos están estratégicamente ubicados en interfaces huésped-ambiente, como la piel, las vías respiratorias y el tracto gastrointestinal, donde se comportan como una primera línea de defensa contra los insultos externos3-6. Los MCs se subclasifiquen a menudo basados en sus características fenotípicas de la "línea de fondo" y sus localizaciones anatómicas. En ratones, se han descrito dos tipos de MCs: "tipo tejido conectivo" MCs (CTMCs) y MCs de la mucosa (MMCs)1-3,7,8. Los CTMCs a menudo se encuentran alrededor de las vénulas y cerca de las fibras nerviosas, y residen en cavidades serosales, mientras que los MMCs ocupan ubicaciones intraepiteliales en el intestino y la mucosa respiratoria1-3.

Se han aplicado numerosas metodologías para estudiar las funciones biológicas de las MCs9-13. Muchos grupos se han centrado en enfoques in vitro utilizando líneas celulares (como las líneas de MC humanas HMC114 o LAD215,16),MCs derivados in vitro (como MCs derivados de sangre periférica humana17,o MCs cultivados derivados de médula ósea de ratón [BMCMCs]18,MCs cultivados derivados de la piel fetal [FSCMCs]19 y MCs derivados de células peritoneales [PCMCs]20)o MCs aislados ex vivo de diferentes sitios anatómicos. Todos estos modelos son ampliamente utilizados para estudiar los detalles moleculares de la biología mc, tales como vías de señalización implicadas en la activación mc. Sin embargo, un aspecto importante de la biología de los MCs es que sus características fenotípicas y funcionales (porejemplo,el contenido de proteasa de gránulos citoplasmáticos o la respuesta a diferentes estímulos) pueden ser moduladas por la ubicación anatómica y el microambiente2,7. Dado que la mezcla exacta de tales factores que se encuentran in vivo puede ser difícil de reproducir in vitro,favorecemos el uso de enfoques in vivo para obtener información sobre las funciones de los MCs9.

Existen varias cepas de ratón con deficiencia genética de MC, como los ampliamente utilizados WBB6F1-Kit W/W-v o C57BL/6-Kit W-sh/W-sh ratones. Estos ratones carecen de expresión y/o actividad de KIT (CD117), el receptor del principal factor de crecimiento MC factor de células madre (SCF)21,22. Como resultado, estos ratones tienen una profunda deficiencia de MC, pero también tienen anomalías fenotípicas adicionales relacionadas con sus mutacionesc-kit (en los ratones WBB6F1-Kit W/W-v) o con los efectos de la gran inversión cromosómica que resulta en una reducción de la expresión de c-kit (en los ratones C57BL/6-Kit W-sh/W-sh) 9,10,12,23. Más recientemente, se han reportado varias cepas de ratones con deficiencia de MC constitutiva independiente dec-kit24-26. Todos estos ratones y algunos nuevos tipos adicionales de ratones inducibles deficientes en MC han sido revisados recientemente en detalle9,10,13.

Aquí, se describen los métodos para la generación de ratón derivado de la médula ósea MCs cultivados (BMCMCs), su transferencia adoptiva en ratones deficientes en MC, y el análisis de los números y la distribución de MCs transferidos adoptivamente en diferentes sitios anatómicos. Este método llamado "knock-in de mastocitos" se puede utilizar para evaluar las funciones de los MC y los productos derivados de MC in vivo. Discutimos las ventajas y las limitaciones de este método, a la luz de los acercamientos alternativos que se han desarrollado en los últimos años.

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Protocol

Todo el cuidado y la experimentación animal se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud y con la aprobación específica del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Stanford.

1. Generación y Caracterización De Mastocitos Cultivados Derivados De La Médula Ósea (BMCMCs).

Nota: Los BMCMCs dispensadores de aceite se deben generar de las células de la médula del mismo fondo genético que los ratones MC-deficientes receptores. BMCMCs donante Varón-derivado no es conveniente para el engraftment de ratones femeninos. Los BMCMCs donantes derivados de mujeres se injertarán con éxito en receptores masculinos y femeninos.

  1. Extracción de médula ósea.
    1. Vierta solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) en 6 placas de cultivo de pozos (1 pozo por ratón) y colóquelo sobre hielo.
    2. Remoje los instrumentos de disección en etanol al 70% para la esterilización.
    3. Eutanasia ratones donantes por inhalación de dióxido de carbono (CO2)seguido de dislocación cervical, luego rocíe a los ratones con etanol al 70% en los sitios de manipulación.
    4. Use instrumentos de disección estériles para extraer los huesos del fémur, la tibia y el peroné sin cortar ninguna epífis ósea.
    5. Mientras asegura los huesos con un fórceps, raspe todo el tejido de los huesos (y deseche el peroné) usando tijeras estériles (o cuchillas de bisturí). Coloque los huesos en PBS sobre hielo hasta que se recojan todos los huesos.
    6. Lleve a cabo todos los pasos restantes en la campana de cultivo de tejido estéril. Usando instrumentos estériles, asegure los huesos con fórceps y corte ambas epífimas para exponer la cavidad medular.
    7. Usando jeringas de 3 ml y agujas de 30 G, y medio de lavado en frío (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] complementado con suero fetal de terneros al 10% [FCS, inactivado por calor], 2 mM de L-glutamina, 1% de solución antibiótico-antimicótica, 50 μM de Β-mercaptoetanol), enjuague la médula ósea roja en una placa de Petri.
    8. Use la misma jeringa para disociar los grupos de células de médula ósea enrojecidas por aspiración y eyección suaves repetidas.
    9. Piscina de médula ósea femoral y tibial de cada ratón en un tubo de centrífuga de 15 ml. Llene el tubo con un medio de lavado en frío para lavar las células de la médula ósea y la centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
  2. Cultura de BMCMCs.
    1. Retire el sobrenadante y recupere las células peletadas de la médula ósea en 10 ml de medio de cultivo (DMEM complementado con suero fetal de terneros al 10% [FCS, inactivado por calor], 2 mM de L-glutamina, 1% de solución antibiótica, 50 μM de Β-mercaptoetanol y 20% de medio acondicionado de células WEHI-3 [como fuente de IL-3; alternativamente, use IL-3 de ratón recombinante a 10 ng/ml]).
    2. Coloque las células en el matraz de cultivo de tejidos de tamaño adecuado(por ejemplo,T25 para 1 ratón, T75 para 2 ratones, etc.).
    3. 1-2 días después del revestimiento de las células, transfiera las células del medio y de suspensión (dejando los restos y las células adherentes pegadas al fondo del matraz) a un nuevo matraz y agregue el medio de cultivo fresco (10 ml / ratón).
    4. Durante las semanas siguientes, las células de alimentación cada 3-4 días (añadir 10 ml de medio de cultivo por ratón). Mantener la densidad celular entre 2,5 x 105-1 x 106 células/ml. Transfiera las células no adherentes a un nuevo matraz una vez a la semana hasta que no haya células adherentes presentes en el matraz de cultivo. Pruebe la madurez de las células (ver más abajo) antes de su uso para ensayos in vitro o injertos en ratones deficientes en MC.
      NOTA: La diferenciación completa de BMCMCs tomará 4-6 semanas.
  3. Evaluación de la madurez de BMCMC.
    1. Uso de citometría de flujo.
      1. Lave las células (5 x 104-5 x 105 células/condición) con tampón FACS helado (PBS, 0,5% FCS) en tubo inferior redondo de poliestireno de 5 ml. Centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Sobrenadante aspirado.
      2. Diluir anticuerpos monoclonales anti-ratón CD16/32 (clon 93 o 2.4G2) 1:200 (2.5 μg/ml) en tampón FACS. Añadir 10 μl a cada pellet y resuspend por vórtice breve. Incubar 5 min sobre hielo para bloquear la unión a Fc.
        NOTA: Proteja las muestras de la luz directa para todos los pasos restantes.
      3. Diluir ficoeritrina (PE) conjugada anti-ratón Fc εRI α (clon MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) y fluoresceína isotiocianato (FITC) conjugado anti-ratón KIT (CD117; clon 2B8) 1:200 (2.5 μg/ml) ("solución de tinción"), o los respectivos anticuerpos de control de isotipo etiquetados en el tampón FACS ("solución de control de isotipo").
      4. Dividir la mitad de las células bloqueadas de la etapa 1.3.1.2) en un tubo inferior redondo de poliestireno adicional y añadir 20 μl de "solución de tinción" en un tubo y 20 μl de "solución de controles de isotipo" en el otro tubo. Incubar 30 min sobre hielo.
      5. Añadir 3 ml de tampón facs helado y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y resuspiente el pellet en tampón FACS de 300 μl que contenga 1 μg/ml de yoduro de propidio (PI, para la identificación de células muertas). Proceder al análisis de citometría de flujo (ver Figura 2A).
    2. Uso de tinción azul de toluidina.
      1. Lavar 1 x 105 células una vez con PBS por centrifugación a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente, luego aspirar y resuspend las células en 200 μl de PBS.
      2. Transfiera la suspensión celular a un citofunnel preparado unido a un portaobjetos de microscopio y proceda con la citocentrifugación usando una citocentrífuga (40 x g durante 5 min).
      3. Seque al aire los portaobjetos durante 10 minutos y dibuje un círculo de cera alrededor de las células usando una pluma pap. Añadir solución azul de toluidina al 0,1% para cubrir las células. Incubar durante 1 min. Lave los portaobjetos en agua corriente del grifo durante 1 minuto, luego seque al aire los portaobjetos durante 10 min.
      4. Celdas coverslip utilizando medio de montaje. Proceder al análisis de microscopio de luz (ver Figura 2B)

2. Engraftment de ratones deficientes en mastocitos con BMCMCs.

  1. Injerto de oído por inyección intradérmica (i.d.).
    NOTA: Para la transferencia adoptiva de BMCMCs en los pabellones auriculares de ratones deficientes en MC, recomendamos realizar dos inyecciones de 1 x 106 células cada una (para un total de 2 x 106 células) por pabellón auricular. El injerto intradérmico de BMCMCs en los pabellones auriculares de ratones con deficiencia de MC ha sido utilizado por muchos investigadores en varios modelos, incluidos modelos de anafilaxia cutánea pasiva (PCA)24,27,defensa del huésped contra venenos28y reacciones de hipersensibilidad crónica (CHS)29,30.
    1. Contar y resuspend las células a 4 x 107 BMCMCs/ml (1 x 106 BMCMCs/ 25 μl) en DMEM frío. Transfiera la solución de BMCMCs en una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 30 G. Mantenga el hielo hasta la inyección.
    2. Anestesiar ratones deficientes en MC de 4-6 semanas de edad usando isoflurano (2,5% v/v). Compruebe la profundidad de la anestesia con pellizco en los dedos de los artículos, ajuste el isoflurano si está indicado y continúe supervisando la respuesta respiratoria y del pellizco de los dedos de los dedos durante todo el procedimiento. Aplique ungüento oftálmico con una punta Q para prevenir la sequedad de los ojos.
    3. Con el dedo índice, cree presión vertical sobre la cara dorsal del pabellón auricular para exponer y estirar la cara ventral.
    4. Realice dos inyecciones de 25 μl i.d. de solución de BMCMC en dos sitios diferentes de la cara ventral del pabellón auricular, la primera inyección en el centro del oído y la segunda inyección hacia la punta del pabellón auricular. Espere 4-6 semanas después del injerto de i.d. antes de realizar experimentos in vivo.
      Nota: En nuestra experiencia, en ese momento el número de MCs/mm2 de dermis en la parte central del pabellón auricular generalmente es similar al de la ubicación correspondiente en ratones de tipo salvaje, mientras que el número de MCs/mm2 en la periferia de los pabellones auriculares es típicamente sustancialmente menor que los de los ratones de tipo salvaje correspondientes27,28. Esto debe tenerse en cuenta al diseñar experimentos con tales ratones con mc-engrafted(e.g.,los agentes con efectos posibles sobre la función de la bujía métrica se deben inyectar en la parte central de los pabellones auriculares, y el análisis de los efectos de tales tratamientos debe también centrarse en esa área).
  2. Engraftment peritoneal de la cavidad por la inyección intraperitoneal (i.p.).
    NOTA: La transferencia adoptiva de BMCMCs en la cavidad peritoneal de ratones MC-deficientes requerirá una inyección de 2 x 106 células por ratón. Tales inyecciones de i.p. de BMCMCs en ratones con deficiencia de MC han sido utilizadas por muchos grupos para estudiar el papel de los MCs peritoneales en varios modelos, incluidos los modelos de defensa del huésped contra los venenos31 o la sepsis bacteriana32,33.
    1. Contar el número adecuado de células y resuspend a 1 x 107 BMCMCs/ml (2 x 106 BMCMCs/ 200 μl) en DMEM frío. Transfiera la solución de BMCMCs en una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 25 G. Mantenga el hielo hasta la inyección.
    2. Realizar 1 inyección de 200 μl de solución de BMCMCs en la cavidad peritoneal de ratones deficientes en MC de 4-6 semanas de edad. Espere 4-6 semanas después del injerto de i.p. antes de realizar experimentos in vivo.
  3. Engraftment por la inyección intravenosa (i.v.).
    NOTA: La transferencia adoptiva de BMCMCs por inyección de i.v. en ratones con deficiencia de MC requerirá una inyección de 5 x 106 células por ratón. Las inyecciones intravenosas (i.v.) de BMCMCs en ratones con deficiencia de MC han sido utilizadas por muchos grupos para estudiar el papel de los MCs en varios modelos de enfermedades, incluidos los modelos de infección vesical34,asma35,fibrosis pulmonar36y artritis mediada por anticuerpos37.
    1. Contar el número adecuado de células y resuspend a 2,5 x 107 BMCMCs/ml (5 x 106 BMCMCs/200 μl) en DMEM frío. Transfiera la solución de BMCMCs en una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de 30 G. Mantenga el hielo hasta la inyección.
    2. Anestesiar ratones deficientes en MC de 4-6 semanas de edad usando isoflurano (2,5% v/v). Compruebe la profundidad de la anestesia con pellizco en los dedos de los artículos, ajuste el isoflurano si está indicado y continúe supervisando la respuesta respiratoria y del pellizco de los dedos de los dedos durante todo el procedimiento. Aplique ungüento oftálmico con una punta Q para prevenir la sequedad de los ojos.
    3. Realice una inyección de 200 μl de solución de BMCMC en la vena de la cola (o, alternativamente, la vena retro-orbital) de un ratón deficiente en MC. Espere 12 semanas después del injerto de i.v. antes de realizar experimentos in vivo.

3. Análisis de ratones deficientes en mastocitos en injertados.

  1. Análisis del engraftment del oído.
    1. Al final del experimento, eutanasia ratones por inhalación de CO2 seguido de dislocación cervical.
    2. Aísle los pabellones auriculares y fije en formalina tamponada al 10% (vol/vol) durante la noche a 4 °C. Incruste pinnas de oreja fijas en parafina, corte secciones de 4 μm de pinnas de oreja y monte en diapositivas de vidrio.
    3. Manche los portaobjetos con una solución azul de toluidina al 0,1% durante 1 min a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos en agua del grifo durante 1 minuto, luego los portaobjetos secos al aire durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    4. Portaobjetos de cubrebocas utilizando el medio de montaje, luego cuente el número de MCs engrafted por secciones de pines usando un microscopio de luz. Evalúe la eficacia del engraftment comparando el porcentaje y la distribución de MCs en la piel del oído de ratones engrafted contra ratones del tipo salvaje.
  2. Análisis del engraftment de la cavidad peritoneal.
    1. Evaluación del número de mastocitos en la cavidad peritoneal.
      1. Al final del experimento, eutanasia ratones por inhalación de CO2 seguido de dislocación cervical. Retire cuidadosamente la piel ventral de los ratones sin romper la cavidad peritoneal.
      2. Inyecte 5 ml de PBS frío o a temperatura ambiente en la cavidad peritoneal usando una jeringa de 5 ml equipada con una aguja de 25 G. Utilice PBS frío para reducir el riesgo de activación de las células peritoneales (esto es muy importante al evaluar la degranulación peritoneal de mc o los niveles de algunos productos derivados de MC en el líquido de lavado peritoneal). Realizar un masaje del abdomen durante 20 segundos para cosechar las células peritoneales.
      3. Aspirar lentamente el lavado peritoneal usando una jeringa de 5 ml equipada con una aguja de 22 G. Registre el volumen de lavado aspirado (espere recuperar hasta el 80% del volumen inyectado).
      4. Transferir líquido de lavado peritoneal a un tubo inferior redondo de poliestireno de 5 ml y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Sobrenadante aspirado. Recuperar el pellet en PBS frío de 400 μl.
      5. Contar el número total de células peritoneales utilizando una cámara de hemocitómetro. Utilice la mitad de la suspensión celular para un análisis de citometría de flujo (como se describe en el paso 1.3.1), para evaluar el porcentaje y la expresión de marcadores de MCs engrafted en la cavidad peritoneal. Multiplique el número total de células peritoneales por el porcentaje de MCs para obtener el número absoluto de MCs peritoneales.
      6. Realizar una citocentrifugación con las células restantes como se describe en el paso 1.3.2.2. Seque al aire los portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente y dibuje un círculo de cera alrededor de las células usando una pluma pap.
      7. Cubra las células con solución de tinción de May-Grünwald sin diluir durante 5 min, seguida de lavado en PBS durante 5 min, ambos a temperatura ambiente. Cubrir las células con tinción de Giemsa diluida 1:20 con agua desionizada e incubar 20 min a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos 2 veces en agua del grifo durante 1 minuto, luego los portaobjetos secos al aire.
      8. Cubre las células que utilizan el medio de montaje y calcula el porcentaje de MCs injertados utilizando un microscopio de luz (contando al menos 400 células en total). Evalúe la eficiencia del injerto comparando el porcentaje de MCs en el lavado peritoneal de ratones injertados versus ratones de tipo salvaje.
    2. Evaluación de mastocitos en las ventanas mesentéricas.
      1. Tras el lavado peritoneal descrito en el paso 3.2.1, se abre la membrana peritoneal para exponer el tracto intestinal de los ratones. Organice de 4 a 5 ventanas mesentéricas por mouse en una diapositiva.
      2. Fije las guías durante 1 hora en solución de Carnoy (3:2:1 vol/vol/vol de etanol, cloroformo y ácido acético glacial) a temperatura ambiente. Seque al aire los portaobjetos y retire el intestino (las ventanas mesentéricas fijas permanecerán unidas a los portaobjetos).
      3. Manche las preparaciones durante 20 minutos a temperatura ambiente con solución de tinción de Csaba (Azul alciano / Safranin O).
        1. Para hacer 500 ml de tinción de Csaba, preparar 500 ml de tampón de acetato mezclando 100 ml de solución de acetato de sodio 1 M con 120 ml de HCl de 1 M. Encuadernar hasta 500 ml con agua desionizada y ajustar el pH a 1,42. A continuación, disuelva 90 mg de Safranin [identifica 'MCs maduros' en rojo], 1,8 g de azul alciano [identifica 'MCs inmaduros' en azul] y 2,4 g de sulfato férrico de amonio NH4Fe (SO4)2 en 500 ml de tampón de acetato.
      4. Cubreboganes con medio de montaje, luego cuente el número de MCs engrafted por ventana mesentérica usando un microscopio de luz. Evalúe la eficiencia del injerto comparando el porcentaje y la distribución de los MCs en las ventanas mesentéricas de ratones engrafted contra ratones de tipo salvaje.
  3. I.v. análisis del engraftment.
    1. Al final del experimento, eutanasiar ratones por inhalación de CO2 seguida de dislocación cervical, y cosechar tejido de interés (porejemplo, pulmón, piel o bazo) y fijar durante la noche en 10% (vol / vol) formol tamponado a 4 ° C.
    2. Incruste tejidos fijos en la parafina, corte secciones de 4 μm y monte en portaobjetos de vidrio. Manche los portaobjetos con una solución azul de toluidina al 0,1% durante 1 min a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos en agua del grifo durante 1 minuto, luego seque al aire los portaobjetos durante 10 min.
    3. Cubreboganes con medio de montaje y evaluar el número y la distribución de los MCs injertados por secciones de tejido utilizando un microscopio de luz.

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Representative Results

En la Figura 1se muestra una visión general del enfoque de'knock-in de mastocitos'e incluye la generación de BMCMCs, el número de células que deben injertrse i.p., i.d. o i.v. en ratones deficientes en MC (el número puede variar si se indica en función del diseño experimental) y el intervalo entre el injerto y el experimento dependiendo del sitio de inyección (este intervalo también puede variar, si se indica; por ejemplo,el contenido de mediadores almacenados en los gránulos citoplasmáticos MC aumenta constantemente con el tiempo38). La Figura 2 muestra análisis representativos de citometría de flujo y tinción de azul de toluidina de los MMC después de 1, 15 y 45 días de cultivo en medio DMEM que contiene en un medio condicionado por células WEHI-3 al 20% como fuente de IL-3. Tenga en cuenta que los BMCMCs cultivados durante 45 días son 95% puros, contienen un alto número de gránulos citoplasmáticos y se pueden utilizar para experimentos de injerto, mientras que las células cultivadas durante 15 días no son adecuadas para el injerto. La Figura 3 muestra un injerto representativo exitoso en los pabellones auriculares 4 semanas después del injerto i.d.(Figura 3A),en ventanas mesentéricas(Figura 3B)y cavidad peritoneal(Figura 3C)6 semanas después del injerto i.p., y en el pulmón(Figura 3D)12 semanas después del injerto i.v.

Figure 1
Figura 1: Modelo deratón'Mast cell knock-in'para análisis de funciones mc in vivo. El tipo salvaje o el mutante médula-derivado MCs cultivado (BMCMCs) son generados cultivando las células de la médula durante por lo menos 4-6 semanas en medio célula-condicionado WEHI-3 del 20% como fuente de IL-3 (o alternativamente en el medio que contiene 10 ng/ml que el ratón recombinante IL-3). Estos BMCMCs pueden ser injertados en ratones deficientes en MC para crear los llamados ratones 'mast cell knock-in'. Los BMCMCs se pueden inyectar vía diversas rutas (intravenoso [i.v.], intraperitoneal [i.p.] o intradérmico [i.d.]) para la reconstitución local (i.d., i.p.) o sistémica (i.v.) de varias poblaciones del buje métrica. La(s) función(es) mc en varias respuestas biológicas pueden ser analizadas comparando las respuestas en ratones de tipo salvaje, ratones deficientes en MC y ratones 'mastocitos knock-in'. La(s) contribución(es) de productos específicos de MC pueden ser analizadas comparando las respuestas de los ratones 'mastocitos knock-in' injertados con BMCMCs de tipo salvaje o BMCMCs derivados de ratones que carecen, o expresan formas genéticamente alteradas de, tales productos. (Esta es una versión modificada de la Figura 1 de la ref.12).

Figure 2
Figura 2: Evaluación de la pureza de las preparaciones de BMCMC por citometría de flujo y microscopía. (A)Análisis representativos de citometría de flujo de FcεRIα y KIT (CD117) expresión en la superficie de 1 día (panel izquierdo), 15 días (panel medio) y 45 días (panel derecho) BMCMCs viejos. Células muertas positivas de yoduro de propidio (PI) se excluyeron del análisis (no se muestra). Los números indican el porcentaje de FcεRIα+KIT+ BMCMCs bloqueados en el cuadrado azul. (B)Imágenes representativas de BMCMCs teñidos con azul toluidina, el panel inferior es un aumento de las regiones del panel superior definido en líneas punteadas negras. Barras = 10 μm.

Figure 3
Figura 3: Evaluación de la eficiencia del injerto de MC en varios sitios anatómicos. (A) Imágenes representativas de secciones de 4 μm de pinnas de oreja teñidas de azul toluidina. (B)Imágenes representativas de ventanas mesentéricas teñidas con Safranin/Acian Blue (mancha 'Csaba'). (C)Imágenes representativas de células presentes en líquidos de lavado peritoneal y teñidas con May-Grünwald Giemsa (MGG). (D) Imágenes representativas de secciones pulmonares de 4 μm teñidas de azul toluidina. Barras = 50 μm (A, B y D) o 20 μm (C). Las imágenes son de ratones de tipo salvaje C57BL/6 (panel superior), ratonesW-sh/W-sh deficientes en MC (panel central) y ratones deficientes en MC injertados con BMCMCs de tipo salvaje: BMCMCs KitW-sh/W-sh (panel inferior). Los MCs se indican con flechas.

ratón Fondos disponibles Números MC
(estado estacionario)		 Otros fenotipos (revisados en9,10,13) Injertos reportados con BMCMCs
KitW/W-v (WB/Re x C57BL/6) F1
(Laboratorios Jackson –
WBB6F1/J-KitW/KitW-v/J)		 Ausencia de tejido conectivo y MCs de la mucosa Anemia, reducción del número de basófilos y neutrófilos, deficiencias en melanocitos y células intersticiales de Cajal, estériles, etc. i.v.35,37; i.p.31,62; i.d.28,29; i.c.50,51; es decir,49; fp.i. 63
KitW-sh/W-sh C57BL/6
(Laboratorios Jackson –
B6. Cg-KitW-sh/HNihrJaeBsmJ) El análisis de polimorfismo de nucleótido único realizado en los laboratorios Jackson muestra que estos ratones son sólo ~ 87% C57BL / 6-fondo genético.		 Ausencia de tejido conectivo y MCs de la mucosa Aumento moderado del número de basófilos y neutrófilos, aumento del número de células supresoras derivadas de mieloides64,deficiencias en melanocitos y células intersticiales de Cajal i.v.23,34-36; i.p.31,62; i.d.28,29; i.a.49
C57BL/6J62
(Laboratorios Jackson –
B6. Cg-KitWsh/HNihrJaeBsmGlliJ) Estos ratones han sido retrocruzados >11 veces en el fondo C57BL/6J.
BALB/c65
(C.B6-KitW-sh)
Mcpt5-Cre;
R-DTA 		C57BL/625
(Tg(Cma1-cre) ARoer; B6.129P2-Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Lky/J)		 Marcadas reducciones en peritoneal (98%) y piel (89-96,5%) MCs, MCs de la mucosa que es poco probable que se agoten Probable presencia de MCs de la mucosa; ratones reportero revela la deleción mediada por Cre del transgén YFP 'floxed' en ~ 30% células NK del bazo66 ninguno
Cpa3Cre/+ C57BL/626
(B6.129P2-Cpa3tm3(icre)Hrr)		 Ausencia de tejido conectivo y MCs de la mucosa Cpa3 expresado en otros tipos de células; número reducido de basófilos i.v.26
BALB/c26
(B6.129P2/OlaHsd.BALB/c-Cpa3tm3(icre)Hrr)
Cpa3-Cre;
Mcl-1fl/fl 		C57BL/624
(Tg(Cpa3-cre)3Glli; B6;129-Mcl1tm3sjkJ)		 Ausencia de tejido conectivo y MCs de la mucosa Cpa3 expresado en otros tipos de células; aumento de neutrófilos del bazo & anemia leve;
número reducido de basófilos		 i.d.24;
i.a.49
i.v. (nuestros datos no publicados)

Tabla 1: Cepas de ratones con deficiencias constitutivas de MC. Varias cepas de ratones con deficiencia de MC constitutiva dependiente de c- kit oc- kit-independienteestán disponibles. En principio, todas estas cepas pueden ser utilizadas para generar ratones 'mastocitos knock-in' (aunque, hasta el mejor de nosotros, esto aún no ha sido reportado para Mcpt5-Cre; Ratones de R-DTA). Sin embargo, cada una de estas cepas presenta otras anomalías y limitaciones fenotípicas que deben tenerse en cuenta a la hora de interpretar los resultados obtenidos con estos ratones. Algunos ejemplos del engraftment acertado MC se pueden encontrar en las referencias. (Esta es una versión modificada y actualizada de la Tabla 1 de la ref.9).

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Discussion

Casi 30 años después de su descripción inicial38, el enfoque'mast cell knock-in'sigue proporcionando información valiosa sobre lo que los MCs pueden o no pueden hacer in vivo. Las funciones de MCs eran de largo probablemente limitadas a su papel en alergia. Los datos generados utilizando el enfoque'mast cell knock-in'han cambiado esta visión, al proporcionar evidencia de que los MCs pueden, entre otras funciones, desempeñar papeles críticos en la defensa del huésped contra ciertos patógenos4,39 o venenos28,31, o incluso pueden suprimir ciertas respuestas inmunes29,34,40.

En nuestra descripción del protocolo, decidimos centrarnos en la generación y el engraftment de MCs cultivados médula-derivados (BMCMCs), porque un gran número de estas células se pueden generar in vitro de la médula de tipo salvaje o ratones del mutante. Sin embargo, los MC también se pueden cultivar directamente a partir de células madre embrionarias (MCs cultivados derivados de células madre embrionarias [ESCMCs])41 y, cuando son genéticamente compatibles, estas células también se pueden utilizar para el injerto en ratones deficientes en MC. Este enfoque alternativo es particularmente interesante para estudiar el papel de una proteína cuya deficiencia induce letalidad embrionaria en ratones, y por lo tanto para la cual no se pueden generar BMCMCs deficientes para esta proteína. Tanto los BMCMCs como los ESCMCs también pueden ser transducidos in vitro con lentivirus que codifican genes de interés o shRNA para silenciar genes de interés, antes de la injertación de estas células en ratones deficientes en MC31,33.

Por lo general, utilizamos un medio condicionado al 20% de WEHI-3 como fuente de IL-3 para el cultivo de BMCMCs. Sin embargo, también se puede utilizar il-3 recombinante (10 ng/ml, como se describe en el paso 1.2.1), y la adición de factor de células madre recombinantes (SCF) al medio de cultivo puede aumentar sustancialmente el número de BMCMCs generados42,43. Dependiendo del estudio, se han utilizado de 10 a 100 ng/ml de SCF recombinante, además de IL-3, para generar BMCMCs36,44,45. Hay que tener en cuenta que las preparaciones murinas recombinantes SCF disponibles en el comercio de diferentes proveedores pueden diferir en su potencia para influir en el desarrollo de los MCMC. También es importante reconocer que los detalles del enfoque utilizado para generar BMCMCs (como si se agrega SCF recombinante al medio que contiene IL-3, la duración del período de cultivo, etc.)pueden influir en el fenotipo y la función de dichas células. Por ejemplo, se ha reportado que los BMCMCs expuestos crónicamente a SCF han aumentado los niveles de histamina y ciertas proteasas44,46,pero muestran una marcada atenuación de la degranulación mediada por FcεRI y la producción de citoquinas in vitro45. Finalmente, además de il-3, wehi-3-conditioned medio contiene muchas moléculas biológicamente activas que pueden afectar a las funciones de MC. Por lo tanto, es probable que los BMCMCs obtenidos con el medio WEHI-3-conditioned difieran de los BMCMCs obtenidos con IL-3 recombinante (o con IL-3 recombinante más SCF). Ha habido pocos estudios de si o durante cuánto tiempo tales diferencias en los fenotipos de BMCMCs generados en diversos tipos de medio de cultivo se conservan después del engraftment de las células en diversos sitios anatómicos in vivo,y los estudios adicionales de este tipo pueden ser de interés. Sin embargo, independientemente de las condiciones de cultivo elegidas, se debe utilizar la misma receta de medio de cultivo para generar todos los BMCMCs que se utilizarán para el injerto en experimentos a partir de los cuales se agruparán los resultados para el análisis. Por otra parte, los MCs se deben cultivar por lo menos 4 a 6 semanas antes de su engraftment en ratones MC-deficientes, para alcanzar una pureza de 95-98% (Figura 2). Esto es para reducir la posibilidad de que la presencia, en las "poblaciones de BMCMC", de células hematopoyéticas distintas de las comprometidas con el linaje de mastocitos (que están presentes en los cultivos a intervalos tempranos después de colocar las células de la médula ósea in vitro)podría resultar en la aparición de células derivadas de donantes, además de MCs en los ratones 'mast cell knock-in'.

Presentamos aquí un protocolo detallado para injerto de ratones deficientes en MC con tipo salvaje o mutante BMCMCs por vía intraperitoneal (i.p.), por vía intravenosa (i.v.) o por vía intradérmica (i.d.) en el pabellón auricular, ya que estas vías de inyección han sido utilizadas por muchos investigadores. Sin embargo, los BMCMCs también se han injertado con éxito en la piel posterior47,en el footpad48,intra-articularly49 o intra-cranially50,51. El número de BMCMCs a engraft, así como el intervalo entre engraftment y experimento, puede variar dependiendo de la ruta de inyección y del órgano apuntado a engraft (Figura 1). Es muy importante respetar tales intervalos después de injertor los BMCMCs antes de comenzar el experimento para dar tiempo suficiente para que los BMCMCs (que no son MCs completamente maduros) lleguen a ser más maduros in vivo. Debido a que el contenido de mediadores almacenados en los gránulos citoplasmáticos de la MC puede continuar aumentando durante el transcurso de la vida útil de la célula38,52,para ciertos experimentos se puede desear aumentar el intervalo entre el injerto de MC y el inicio del experimento para evaluar la función de MC.

Dependiendo de la vía de inyección y/o del número de MCMC inyectados, los números y/o la distribución anatómica de los MC transferidos adoptivamente pueden diferir de los de las poblaciones nativas de MC correspondientes en ratones de tipo salvaje12,23,53,54. Los ratones con deficiencia de MC injertados i.p. o i.d. con BMCMCs pueden tener aproximadamente los mismos números y distribución de MCs que la población nativa de MC en ratones de tipo salvaje, en la cavidad peritoneal y mesenterio y en la dermis, respectivamente, cuando se evalúan de 4 a 8 semanas después de la transferencia de MC12,23. La transferencia intravenosa de BMCMCs no lleva a los números normales de la bujía métrica y/o a la distribución en la mayoría de los tejidos. Por ejemplo, no se encuentran o muy pocos MCs en la piel de tales ratones 'mast cell knock-in' engrafted i.v.-engrafted. En 4-28 semanas después de la inyección de i.v. de BMCMCs en ratones MC-deficientes, los números de MCs en la tráquea son substancialmente más bajos que ésos en el tipo salvaje correspondiente ratones. Por el contrario, el número de MCs en la periferia del pulmón es típicamente mayor que los de los ratones de tipo salvaje correspondientes12,23,53,55. La transferencia de I.v. de BMCMCs también da lugar a altos niveles de MCs en el bazo, mientras que muy pocos MCs nativos se encuentran típicamente en este órgano en ratones de tipo salvaje23,56. Importantemente, los informes anteriores demostraron que la inyección de i.v. de BMCMCs en ratones Mc-deficientes no puede dar lugar al engraftment de las poblaciones de la bujía métrica en sitios anatómicos específicos tales como la médula espinal, los nodos de linfa oel corazón 54,57. Varios grupos también han observado que tal i.v. engraftment no da lugar al engraftment de la mucosa intestinal MC (MMC) población23,58-60. Estas diferencias en los números de MC y/o la distribución de los MC transferidos por adopción frente a los MCs nativos deben tenerse en cuenta al interpretar los datos obtenidos utilizando el modelo9de MC 'mast cell knock-in'.

Existen varias cepas de ratones deficientes en MC, y es importante elegir cuál (s) usar en un proyecto en particular. c-kit mutante MC-deficiente ratones, tales como KitW/W-v o KitW-sh/W-sh ratones, han sido utilizados tradicionalmente por muchos investigadores. Sin embargo, tales ratones sufren de muchas c-kit- anormalidades fenotípicas relacionadas además de su deficiencia profunda de la bujía métrica (tabla 1). En los últimos años, se han reportado varias cepas de ratones con deficiencia de MC constitutiva independiente dec-kit24-26. Algunos de estos ratones también exhiben otras anormalidades fenotípicas al lado de su deficiencia de bujíamétrica (tabla 1),y las anormalidades adicionales se pudieron también descubrir pues el fenotipo de estas tensiones nuevamente descritas todavía está bajo investigación. Todos estos ratones y algunos nuevos tipos adicionales de ratones deficientes en MC han sido revisados recientemente en detalle9,10,13.

Dadas las limitaciones de cada una de las cepas deficientes en MC actualmente disponibles, recomendamos intentar probar hipótesis sobre la función de MC utilizando más de un modelo de deficiencia de MC9. En nuestro laboratorio, generalmente realizamos experimentos piloto en KitW-sh/W-sh y Cpa3-Cre; Mcl-1fl/fl ratones. Si obtenemos resultados concordantes en ambos tipos de ratones MC-deficientes, entonces procedemos a los experimentos del engraftment para determinar el papel de MCs y para evaluar los papeles potenciales de ciertos productos Mc-derivados. Por último, cabe señalar que también se han descrito recientemente varias cepas que permiten el agotamiento inducible de los MCs o la deleción mediada por recombinasa cre de genes "floxed" en los MCs25,49,61. Estas cepas se han revisado en detalle en otras partes9,10,13 y representan enfoques alternativos o complementarios prometedores para estudiar las funciones de MC in vivo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

N.G. ha recibido becas de la "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" francesa y de la Fundación Philipp; R.S. cuenta con el apoyo de la Fundación Lucile Packard para la Salud infantil y el premio CTSA de los NIH/NCRR de Stanford número UL1 RR025744; P.S. cuenta con el apoyo de una beca Max Kade de la Fundación Max Kade y la Academia Austríaca de Ciencias y una beca Schroedinger del Fondo Austriaco para la Ciencia (FWF): J3399-B21; S.J.G. reconoce el apoyo de las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud U19 AI104209, NS 080062 y del Programa de Investigación de Enfermedades Relacionadas con el Tabaco de la Universidad de California; L.L.R. reconoce el apoyo de la Arthritis National Research Foundation (ANRF) y la subvención K99AI110645 de los Institutos Nacionales de Salud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25 G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30 G x 1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1% Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03

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Análisis De Las Funciones De Los MastOcitos <em>In Vivo</em> Usando ' Mast<em>Cell Knock-in</em>' Ratones
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Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, … More

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).

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