Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analysera funktionerna hos mastceller in vivo med hjälp av' mastcell knock-in' möss

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52753
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

Summary

Vi beskriver en metod för generering av in vitro härledda mastceller, deras engraftment i mast cell-bristfälliga möss och analysen av fenotyp, siffror och fördelning av ingrafted mastceller på olika anatomiska platser. Detta protokoll kan användas för att bedöma funktionerna i mastceller in vivo.

Abstract

Mastceller (MCs) är hematopoetiska celler som finns i olika vävnader, och är särskilt rikliga på platser som utsätts för den yttre miljön, såsom hud, luftvägar och mag-tarmkanalen. Mest kända för sin skadliga roll i IgE-beroende allergiska reaktioner har MCs också dykt upp som viktiga aktörer i värdförsvar mot gift och invaderande bakterier och parasiter. MC fenotyp och funktion kan påverkas av mikromiljömentala faktorer som kan skilja sig åt beroende på anatomisk plats och/eller baserat på typ eller utvecklingsstadium för immunsvar. Av denna anledning har vi och andra gynnat in vivo-metoder framför in vitro-metoder för att få insikt i MC-funktioner. Här beskriver vi metoder för generering av mus benmärg-härledda odlade MCs (BMCMCs), deras adoptivöverföring till genetiskt MC-bristfälliga möss och analysen av antalet och fördelningen av adoptivt överförda MCs på olika anatomiska platser. Denna metod, som kallas"mastcells-knock-in"-metoden, har använts i stor utsträckning under de senaste 30 åren för att bedöma funktionerna hos MCs och MC-härledda produkter in vivo. Vi diskuterar fördelarna och begränsningarna med denna metod, mot bakgrund av alternativa tillvägagångssätt som har utvecklats under de senaste åren.

Introduction

Mastceller (MCs) är hematopoetiska celler som uppstår från pluripotenta benmärgsprogenitorer1-3. Efter benmärgsegression migrerar MCs-stamceller till olika vävnader där de utvecklas till mogna MCs under påverkan av lokalatillväxtfaktorer 1-3. Vävnadsboende MCs är strategiskt placerade vid värdmiljögränssnitt, såsom huden, luftvägarna och mag-tarmkanalen, där de beter sig som en första försvarslinje mot yttreförolämpningar 3-6. MCs är ofta sub-classified baserat på deras "baslinje" fenotypiska egenskaper och deras funktionella platser. Hos möss har två typer av MCs beskrivits: MCs av "bindvävstyp" (CTMCs) och MCs (MCosal MCs)1-3,7,8. CTMCs ligger ofta runt venuler och nära nervfibrer, och bor i serosala håligheter, medan MMCs upptar intraepithelial platser i tarmen och andningsslemhinnan1-3.

Många metoder har tillämpats för att studera biologiska funktioner hos MCs9-13. Många grupper har fokuserat på in vitro-metoder med hjälp av antingen cellinjer (t.ex. de mänskliga MC-linjerna HMC114 eller LAD215,16), in vitro-härledda MCs (t.ex. humana perifera blodbaserade MCs17, eller musbenmärgs-härledda MCs odlade MCs [BMCMCs]18,fetala hud-härledda odlade MCs [FSCMCs]19 och peritoneal cell-härledda MCs [PCMCs]20) eller ex vivo isolerade MCs från olika anatomiska platser. Alla dessa modeller används ofta för att studera molekylära detaljer i MC-biologi, såsom signalvägar som är involverade i MC-aktivering. En viktig aspekt av MCs biologi är dock att deras fenotypiska och funktionella egenskaper(t.ex.cytoplasmic granulat proteas innehåll eller svar på olika stimuli) kan moduleras genom anatomisk plats och mikromiljö2,7. Eftersom den exakta blandningen av sådana faktorer som uppstår in vivo kan vara svår att reproducera in vitro, föredrar vi att använda in vivo-metoder för att få insikter i MCs-funktioner9.

Flera musstammar med genetisk MC-brist finns, såsom de allmänt använda WBB6F1-Kit W/ W-v eller C57BL / 6 -Kit W-sh / W-sh möss. Dessa möss saknar uttryck och/eller aktivitet av KIT (CD117), receptorn för den viktigaste MC-tillväxtfaktorn stamcellsfaktor (SCF)21,22. Som ett resultat har dessa möss en djupgående MC-brist men har också ytterligare fenotypiska avvikelser relaterade till deras c-kit mutationer (i WBB6F1-Kit W / W-v möss) eller effekterna av den stora kromosomal inversion som resulterar i minskad c-kit uttryck (i C57BL/6-Kit W-sh/W-sh möss)9,10,12,23. På senare tid har flera stammar av möss med c-kit-oberoende konstituerande MC-brist rapporterats24-26. Alla dessa möss och några ytterligare nya typer av inducerbara MC-bristfälliga möss har nyligen granskats i detalj9,10,13.

Här beskriver vi metoder för generering av mus benmärg-härledda odlade MCs (BMCMCs), deras adoptivöverföring till MC-bristfälliga möss och analysen av antalet och fördelningen av adoptiviskt överförda MCs på olika anatomiska platser. Denna så kallade "mastcellsknackning" -metod kan användas för att bedöma funktionerna hos MCs och MC-härledda produkter in vivo. Vi diskuterar fördelarna och begränsningarna med denna metod, mot bakgrund av alternativa tillvägagångssätt som har utvecklats under de senaste åren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

All djurvård och alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna från National Institutes of Health och med särskilt godkännande av Institutional Animal Care and Use Committee vid Stanford University.

1. Generering och karakterisering av benmärgsbaserade odlade mastceller (BMCMCs).

Anm.: Donator BMCMCs bör genereras från benmärgsceller med samma genetiska bakgrund som mottagarens MC-bristfälliga möss. Han-härledda givaren BMCMCs är inte lämpliga för engraftment av kvinnliga möss. Kvinnliga givaren BMCMCs kommer framgångsrikt att instärkta i både manliga och kvinnliga mottagare.

  1. Benmärgsextraktion.
    1. Häll steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 6 brunns odlingsplatta (1 brunn per mus) och lägg på is.
    2. Blötlägg dissekeringsinstrumenten i 70% etanol för sterilisering.
    3. Avliva donatormöss med koldioxid (CO2)inandning följt av livmoderhalsförskjutning och spraya sedan mössen med 70% etanol på manipulationsplatserna.
    4. Använd sterila dissektionsinstrument för att extrahera lårben, skenben och vadben utan att skära några benepisyler.
    5. När du säkrar benen med en tång, skrapa bort all vävnad från ben (och kassera vadbenet) med steril sax (eller skalpellblad). Placera benen i PBS på is tills alla ben har samlats in.
    6. Utför alla återstående steg i steril vävnadskulturhuva. Använd sterila instrument, säkra ben med tång och skär av båda epifyserna för att exponera den medullära håligheten.
    7. Använd 3 ml sprutor och 30 G nålar och kallspolningsmedium (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] kompletterat med 10% fetalt kalvserum [FCS, värmeinaktiverat], 2 mM L-glutamin, 1% antibiotisk antimykotisk lösning, 50 μM B-merkaptoethanol), spola den röda benmärgen i en Petri-maträtt.
    8. Använd samma spruta för att skilja spolade benmärgscellskluster genom upprepad mild aspiration och utmatning.
    9. Pool femoral och tibial benmärg från varje mus i ett 15 ml centrifugeringsrör. Fyll röret med kallspolningsmedium för att tvätta benmärgsceller och centrifugera vid 400 x g i 5 min vid 4 °C.
  2. BMCMCs Kultur.
    1. Ta bort supernatant och återställa pelleterade benmärgsceller i 10 ml odlingsmedium (DMEM kompletterat med 10% fetalt kalvserum [FCS, värmeinaktiverad], 2 mM L-glutamin, 1% antibiotisk-antimykotisk lösning, 50 μM B-mercaptoethanol och 20% WEHI-3 cell-konditionerat medium [som källa till IL-3; alternativt använda rekombinant mus IL-3 vid 10 ng/ml]).
    2. Placera cellerna i vävnadskulturkolven av lämpligstorlek (t.ex.T25 för 1 mus, T75 för 2 möss osv.).
    3. 1-2 dagar efter plätering av celler, överför medel- och upphängningsceller (lämnar skräp och vidhäftande celler som fastnar på kolvens botten) till en ny kolv och tillsätt nytt odlingsmedium (10 ml/mus).
    4. Under de följande veckorna matar du celler var 3-4 dagar (tillsätt 10 ml odlingsmedium per mus). Bibehåll celltätheten mellan 2,5 x 105-1 x 106 celler/ml. Överför icke-vidhäftande celler till en ny kolv en gång i veckan tills inga vidhäftande celler finns i odlingskolven. Testa cellernas mognad (se nedan) före användning för in vitro-analyser eller ingraftment i MC-bristfälliga möss.
      OBS: Fullständig differentiering av BMCMCs tar 4-6 veckor.
  3. Bedömning av BMCMC:s mognad.
    1. Använda flödescytometri.
      1. Tvätta celler (5 x 104-5 x 105 celler/tillstånd) med iskyla FACS-buffert (PBS, 0,5% FCS) i 5 ml polystyren runt bottenröret. Centrifugera vid 400 x g i 5 min vid 4 °C. Aspirera supernatant.
      2. Späd antimus-CD16/32 (klon 93 eller 2,4 G2) monoklonala antikroppar 1:200 (2,5 μg/ml) i FACS-buffert. Tillsätt 10 μl till varje pellets och återanvänd genom kort virvel. Inkubera 5 min på is för att blockera Fc-bindning.
        OBS: Skydda proverna från direkt ljus för alla återstående steg.
      3. Utspädd fykoerythrin (PE) konjugerad antimus Fc εRI α (klon MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) och fluorescein isothiocyanate (FITC) konjugerade antimus KIT (CD117; klon 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("färgningslösning") eller respektive märkta isotypkontrollantikroppar i FACS-buffert ("isotypkontrolllösning").
      4. Dela hälften av de blockerade cellerna från steg 1.3.1.2) i ett extra polystyren runt bottenröret och tillsätt 20 μl "färglösning" i ett rör och 20 μl "isotypkontrolllösning" i det andra röret. Inkubera 30 min på is.
      5. Tillsätt 3 ml iskall FACS-buffert och centrifugera vid 400 x g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatant och återanvänd pelleten i 300 μl FACS-buffert som innehåller 1 μg/ml propidiumididid (PI, för identifiering av döda celler). Fortsätt att flöda cytometrianalys (se figur 2A).
    2. Använda toluidinblå färgning.
      1. Tvätta 1 x 105 celler en gång med PBS genom centrifugering vid 400 x g i 5 min vid rumstemperatur, aspirera sedan och återanvänd celler i 200 μl PBS.
      2. Överför cellupphängningen till en beredd cytofunnel fäst vid en mikroskopbild och fortsätt med cytocentrifugering med en cytocentrifuge (40 x g i 5 min).
      3. Lufttorra diabilder i 10 minuter och rita en vaxcirkel runt celler med en PAP-penna. Tillsätt 0,1% Toluidinblå lösning för att täcka cellerna. Inkubera i 1 minut. Tvätta rutschkanor i rinnande kranvatten i 1 min och lufttorka sedan rutschkanorna i 10 minuter.
      4. Täcklipceller med monteringsmedium. Fortsätt till lätt mikroskopanalys (se figur 2B)

2. Engraftment av mastcellsbrist möss med BMCMCs.

  1. Öronen engraftment genom intradermal (dvs. injektion).
    OBS: För adoptivöverföring av BMCMCs till öronpropen hos MC-bristfälliga möss rekommenderar vi att du utför två injektioner på 1 x 106 celler vardera (för totalt 2 x 106 celler) per öronpropna. Intradermal engraftment av BMCMCs i öronen pinnae av MC-bristfälliga möss har använts av många utredare i flera modeller, inklusive modeller av passiv testning anafylaxi (PCA)24,27,värd försvar mot gift28, och kronisk överkänslighet (CHS) reaktioner29,30.
    1. Räkna och återanvänd celler vid 4 x 107 BMCMCs/ml (1 x 106 BMCMCs/ 25 μl) i kall DMEM. Överför BMCMCs lösning till en 1 ml spruta utrustad med en 30 G nål. Håll på isen tills injektionen.
    2. Söv 4-6 veckor gamla MC-bristfälliga möss med isofluran (2,5% v/v). Kontrollera anestesidjupet genom att nypa, justera isofluran om det anges och fortsätt att övervaka andningen och tånypresponsen under hela proceduren. Applicera oftalmisk salva med en Q-spets för att förhindra torrhet i ögonen.
    3. Med pekfingret, skapa vertikalt tryck på öronpropens dorsala ansikte för att exponera och sträcka ventrala ansiktet.
    4. Utför två 25 μl d. injektioner av BMCMC-lösning på två olika platser i öronproppens ventrala ansikte, den första injektionen i mitten av örat och den andra injektionen mot öronspetsen. Vänta 4-6 veckor efter i.d. engraftment innan du utför in vivo experiment.
      Observera: Enligt vår erfarenhet är antalet MCs/mm2 av dermis i den centrala delen av öronpropp i allmänhet liknande det på motsvarande plats hos vilda möss, medan antalet MCs/mm2 i öronbenens periferi vanligtvis är betydligt lägre än hos motsvarande vilda möss27,28. Detta bör hållas i åtanke när man utformar experiment med sådana MC-instärmade möss (t.ex.bör medel med möjliga effekter på MC-funktionen injiceras i den centrala delen av öronpropen, och analysen av effekterna av sådana behandlingar bör också fokusera på det området).
  2. Peritoneal hålighet engraftment genom intraperitoneal (dvs. injektion.
    OBS: Adoptivöverföring av BMCMCs till peritoneal hålighet hos MC-bristfälliga möss kommer att kräva en injektion av 2 x 106 celler per mus. Sådana i.p. injektioner av BMCMCs i MC-bristfälliga möss har använts av många grupper för att studera rollerna för peritoneal MCs i olika modeller, inklusive modeller av värd försvar mot gift31 eller bakteriell sepsis32,33.
    1. Räkna lämpligt antal celler och återanvänd vid 1 x 107 BMCMCs/ml (2 x 106 BMCMCs/ 200 μl) i kall DMEM. Överför BMCMCs lösning till en 1 ml spruta utrustad med en 25 G nål. Håll på isen tills injektionen.
    2. Utför 1 injektion av 200 μl BMCMCs lösning i peritoneal hålighet av 4-6 veckor gamla MC-bristfälliga möss. Vänta 4-6 veckor efter i.p. engraftment innan du utför in vivo experiment.
  3. Engraftment genom intravenös (i.v.) injektion.
    OBS: Adoptivöverföring av BMCMCs genom injektion i MC-bristfälliga möss kommer att kräva en injektion på 5 x 106 celler per mus. Intravenösa (i.v.) injektioner av BMCMCs i MC-bristfälliga möss har använts av många grupper för att studera MCs roller i olika sjukdomsmodeller, inklusive modeller av urinvägsinfektion34,astma35,lungfibros36, och antikroppsmedierad artrit37.
    1. Räkna lämpligt antal celler och återanvänd vid 2,5 x 107 BMCMCs/ml (5 x 106 BMCMCs/200 μl) i kall DMEM. Överför BMCMCs lösning till en 1 ml spruta utrustad med en 30 G nål. Håll på isen tills injektionen.
    2. Söv 4-6 veckor gamla MC-bristfälliga möss med isofluran (2,5% v/v). Kontrollera anestesidjupet genom att nypa, justera isofluran om det anges och fortsätt att övervaka andningen och tånypresponsen under hela proceduren. Applicera oftalmisk salva med en Q-spets för att förhindra torrhet i ögonen.
    3. Utför en injektion på 200 μl BMCMC-lösning i svans venen (eller alternativt retro-orbital venen) av en MC-bristfällig mus. Vänta 12 veckor efter i.v. engraftment innan du utför in vivo experiment.

3. Analys av instgraferade mastcellsbristande möss.

  1. Öronen engraftment analys.
    1. I slutet av experimentet avliva möss med CO2 inandning följt av massundersökning förskjutning.
    2. Isolera öronpropp och fixera i 10% (vol/vol) buffrat formalin över natten vid 4 °C. Bädda in fast öronpropp i paraffin, skär 4 μm delar av öronpropp och montera på glasrutschbanor.
    3. Färga rutschkanorna med en 0,1% Toluidinblå lösning i 1 min vid rumstemperatur. Tvätta rutschkanor i kranvatten i 1 min och lufttorka sedan rutschkanorna i 10 minuter vid rumstemperatur.
    4. Täckglasbilder med monteringsmedium och räkna sedan antalet instramade MCs per pinnae-sektioner med hjälp av ett ljusmikroskop. Utvärdera engraftmenteffektiviteten genom att jämföra procentandelen och fördelningen av MCs i öronhuden hos instgraferade möss jämfört med vilda möss.
  2. Peritoneal hålighet engraftment analys.
    1. Utvärdering av mastceller nummer i peritoneal hålighet.
      1. I slutet av experimentet avliva möss med CO2 inandning följt av massundersökning förskjutning. Ta försiktigt bort mössens ventrala hud utan att bryta den peritoneala håligheten.
      2. Injicera 5 ml kall- eller rumstemperatur PBS i bukhålan med en 5 ml spruta utrustad med en 25 G-nål. Använd kall PBS för att minska risken för aktivering av peritonealceller (detta är mycket viktigt vid utvärdering av peritoneal MC-degranulering eller nivåer av vissa MC-härledda produkter i peritoneal lavagevätska). Utför en massage av buken i 20 sekunder för att skörda peritonealceller.
      3. Aspirera långsamt den peritoneala lavagen med en 5 ml spruta utrustad med en 22 G nål. Registrera volymen av insugen lavage (förvänta dig att återhämta upp till 80% av injicerad volym).
      4. Överför peritoneal lavagevätska till ett 5 ml polystyren runt bottenröret och centrifugera vid 400 x g i 5 min vid 4 °C. Aspirera supernatant. Återvinn pelleten i 400 μl kall PBS.
      5. Räkna det totala antalet peritonealceller med hjälp av en hemocytometerkammare. Använd hälften av cellupphängningen för en flödescytometrianalys (enligt beskrivningen i steg 1. 3.1), för att utvärdera procentsatsen och marköruttrycket för inskrivna MCs i peritonealhålan. Multiplicera det totala antalet peritonealceller med procentandelen MCs för att erhålla absolut antal peritoneal MCs.
      6. Utför en cytocentrifugation med de återstående cellerna enligt beskrivningen i steg 1.3.2.2. Lufttorra diabilder i 10 minuter vid rumstemperatur och rita en vaxcirkel runt celler med en PAP-penna.
      7. Täck celler med outspädd Maj-Grünwald Färgningslösning i 5 min, följt av tvätt i PBS i 5 min, båda vid rumstemperatur. Täck celler med Giemsa fläck utspädd 1:20 med avjoniserat vatten och inkubera 20 min vid rumstemperatur. Tvätta diabilder 2 gånger i kranvatten i 1 min och lufttorka sedan rutschkanorna.
      8. Täck över celler med monteringsmedium och beräkna procentandelen instramade MCs med hjälp av ett ljusmikroskop (genom att räkna minst 400 totala celler). Utvärdera engraftmenteffektiviteten genom att jämföra procentandelen MCs i peritoneal lavage av ingrafterade möss kontra vilda möss.
    2. Utvärdering av mastceller i de mesenteriska fönstren.
      1. Efter den peritoneal lavage som beskrivs i steg 3.2.1, skär öppna peritoneal membranet för att exponera tarmkanalen hos mössen. Ordna 4 till 5 mesenteriiska fönster per mus på en bild.
      2. Fixera diabilderna i 1 timme i Carnoy-lösning (3:2:1 volym/volymprocent etanol, kloroform och glacial ättiksyra) vid rumstemperatur. Lufttorra diabilder och ta bort tarmarna (de fasta mesenteriiska fönstren förblir fästa vid bilderna).
      3. Färga preparaten i 20 min vid rumstemperatur med Csaba (Alcian blue/Safranin O) färglösning.
        1. För att göra 500 ml Csaba-fläck, bered 500 ml acetatbuffert genom att blanda 100 ml 1 M natriumacetatlösning med 120 ml 1 M HCl. Gör upp till 500 ml med avjoniserat vatten och justera pH till 1,42. Lös sedan upp 90 mg Safranin [identifierar "mogna MCs" i rött], 1,8 g alciskblått [identifierar "omogna MCs" i blått] och 2,4 g järn ammoniumsulfat NH4Fe(SO4)2 till 500 ml acetatbuffert.
      4. Täckglasbilder med monteringsmedium och räkna sedan antalet insnärjda MCs per mesenteriskt fönster med hjälp av ett ljusmikroskop. Utvärdera engraftmenteffektiviteten genom att jämföra procentandelen och fördelningen av MCs i de mesenteriiska fönstren hos insnärmade möss jämfört med vilda möss.
  3. I.v. engraftment analys.
    1. I slutet av försöket avliva möss genom CO 2-inandning följt av livmoderhalsförskjutning och skörda vävnad av intresse(t.ex. lunga, hud eller mjälte) och fixera över natten i 10% (vol/vol) buffrat formalin vid 4 °C.
    2. Bädda in fasta vävnader i paraffin, skär 4 μm sektioner och montera på glasrutschbanor. Färga rutschkanorna med en 0,1% Toluidinblå lösning i 1 min vid rumstemperatur. Tvätta rutschkanorna i kranvatten i 1 minut och lufttorka sedan rutschkanorna i 10 minuter.
    3. Täckglasbilder med monteringsmedium och utvärdera antal och fördelning av instramade MCs per vävnadssektioner med hjälp av ett ljusmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En översikt över metoden "mastcellsknackning" visas i figur 1och omfattar generering av BMCMC, antalet celler som bör ingraferas i.p., dvs. t.ex.ökar innehållet i lagrade medlare i MC cytoplasmagranulat stadigt med tiden38). Figur 2 visar representativa flöde cytometri analyser och toluidin blå färgning av BMCMCs efter 1, 15 och 45 dagar av kultur i DMEM medium som innehåller i 20% WEHI-3 cell-konditionerade medium som en källa till IL-3. Observera att BMCMCs odlade i 45 dagar är 95% rena, innehåller ett stort antal cytoplasmagranulat och kan användas för engraftment experiment, medan celler odlade i 15 dagar inte är lämpliga för engraftment. Figur 3 visar representativ lyckad inskrivning i öronen 4 veckor efter igraftment (Figur 3A), i mesenteriiska fönster (Figur 3B) och peritoneal hålighet (Figur 3C) 6 veckor efter i.p. engraftment, och i lungan (Figur 3D) 12 veckor efter i.v. engraftment.

Figure 1
Figur 1: Musmodellen" Mastcellsknackning" för analyser avMC-funktioner in vivo. Vilda typer eller mutanta benmärgsbaserade odlade MCs (BMCMCs) genereras av odling av benmärgsceller i minst 4-6 veckor i 20% WEHI-3 cellbetingat medium som en källa till IL-3 (eller alternativt i medium som innehåller 10 ng/ml rekombinant mus IL-3). Dessa BMCMCs kan sedan skrivas in i MC-bristfälliga möss för att skapa så kallade" mastcellsknackning" möss. BMCMCs kan injiceras via olika vägar (intravenösa [i.v.], intraperitoneal [dvs. eller intradermal [dvs.]) för lokal (dvs. i.p.) eller systemisk (dvs. rekonstitution av olika MC-populationer). MC-funktioner i olika biologiska svar kan sedan analyseras genom att jämföra svaren hos vilda möss, MC-bristfälliga möss och" mastcellsknackning" möss. Bidraget från specifika MC-produkter kan analyseras genom att jämföra svar från" mastcellsknackning" möss som är instärmade med antingen vilda BMCMCs eller BMCMCs som härrör från möss som saknar eller uttrycker genetiskt modifierade former av sådana produkter. (Detta är en modifierad version av figur 1 från ref.12).

Figure 2
Figur 2: Utvärdering av renheten hos BMCMC preparat genom flödescytometri och mikroskopi. a)Representativa flödescytometrianalyser av FcεRIα- och KIT-uttryck (CD117) på ytan av 1 dag (vänster panel), 15 dagar (mittpanel) och 45 dagar (höger panel) gamla BMCMCs. Propidiumidid iodid (PI)-positiva döda celler uteslöts från analysen (visas inte). Siffrorna anger procentandelen FcεRIα+KIT+ BMCMCs gated i den blå rutan. B)Representativa bilder av BMCMCs färgade med toluidinblått, nedre panel är en förstoring av regionerna på den övre panelen definierad i svarta prickade linjer. Stänger = 10 μm.

Figure 3
Figur 3: Utvärdering av effektiviteten hos MC-engraftment på olika anatomiska platser. A)Representativa bilder av 4 μm öronproppsektioner färgade med toluidinblått. B)Representativa bilder av mesenteriiska fönster färgade med Safranin/Acian Blue (nedan färg på Csaba). C)Representativa bilder av celler som förekommer i peritoneal lavagevätskor och färgas med May-Grünwald Giemsa (MGG). D)Representativa bilder av 4 μm lungsektioner färgade med toluidinblått. Stänger = 50 μm (A, B och D) eller 20 μm (C). Bilderna är från C57BL/6 vilda möss (övre panelen), MC-bristfälliga KitW-sh/W-sh möss (mittenpanel) och MC-bristfälliga möss instänkta med vilda BMCMCs: BMCMCs KitW-sh/W-sh (nedre panelen). MCs indikeras med pilar.

möss Tillgängliga bakgrunder MC-nummer
(steady state)		 Andra fenotyper (granskade i9,10,13) Rapporterade engraftments med BMCMCs
SatsW/W-v (WB/Re x C57BL/6) F1 (F 1)
(Jackson Laboratories –
WBB6F1/J-KitW/KitW-v/J)		 Frånvaro av bindväv och slemhinnor Anemi, minskat basofila och neutrofilnummer, brister i melanocyter och interstitiella celler i Cajal, sterila, etc. i.v.35,37; i.p.31,62, i.d.28,29, i.c.50,51; i.a.49, fp.i. 63 (på 63)
KitW-sh/W-sh C57BL/6 (engelska)
(Jackson Laboratories –
B6. Cg-KitW-sh/HNihrJaeBsmJ) Enkärna polymorfism analys utförs vid Jackson laboratorier visar att dessa möss är endast ~87% C57BL/6-genetisk bakgrund.		 Frånvaro av bindväv och slemhinnor Måttlig ökning av basofila och neutrofila tal, ökat antal myeloisk-härledda suppressorceller64, brister i melanocyter och interstitiella celler i Cajal i.v.23,34-36; i.p.31,62, i.d.28,29, i.a.49
C57BL/6J62
(Jackson Laboratories –
B6. Cg-KitWsh/HNihrJaeBsmGlliJ) Dessa möss har backcrossed >11 gånger på C57BL/6J bakgrund.
BALB/c65
(C.B6-KitW-sh)
Mcpt5-Cre;
R-DTA (R-DTA) 		C57BL/625
(Tg(Cma1-cre) ARoer; B6.129P2-Gt(ROSA)26Sortering1(DTA)Lky/J)		 Markanta minskningar av peritoneal (98%) och hud (89-96,5%) MCs, slemhinnor MCs osannolikt att tömmas Sannolik förekomst av mucosal MCs; reportermöss avslöjar Cre-medierad radering av "floxed" YFP-transgene i ~ 30% mjälte NK-celler66 ingen
Cpa3Cre/+ C57BL/626
(B6.129P2-Cpa3tm3(icre)Hrr)		 Frånvaro av bindväv och slemhinnor Cpa3 uttryckt i andra celltyper; minskat basofila tal i.v.26
BALB/c26
(B6.129P2/OlaHsd.BALB/c-Cpa3tm3(icre)Hrr)
Cpa3-Cre;
Mcl-1fl/fl 		C57BL/624
(Tg(Cpa3-cre)3Glli; B6;129-Mcl1tm3sjkJ)		 Frånvaro av bindväv och slemhinnor Cpa3 uttryckt i andra celltyper; ökad mjälte neutrofiler & mild anemi;
minskat basofila tal		 i.d.24,
i.a.49
i.v. (våra opublicerade data)

Tabell 1: Stammar av möss med konstituerande MC-brister. Flera stammar av möss med c-kit-beroende eller c-kit-oberoende konstituerande MC-brist finns tillgängliga. I princip kan alla dessa stammar användas för att generera" mastcellsknackning" möss (även om detta så gott vi vet ännu inte har rapporterats för Mcpt5-Cre; R-DTA möss). Var och en av dessa stammar har dock andra fenotypiska avvikelser och begränsningar som bör hållas i åtanke vid tolkning av resultat som erhållits med dessa möss. Några exempel på lyckad MC-engraftment finns i referenserna. (Detta är en modifierad och uppdaterad version av tabell 1 från ref.9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nästan 30 år efter den förstabeskrivningen 38fortsätter metoden med" mastcellsknackning" att ge värdefull information om vad MCs kan göra eller inte kan göra in vivo. Funktionerna hos MCs ansågs länge vara begränsade till deras roll i allergi. Data som genereras medhjälp av metoden " mastcellsknackning" har ändrat denna uppfattning genom att tillhandahålla bevis för att MCs bland annat kan spela kritiska roller i värdförsvaret mot vissapatogener 4,39 ellergifter 28,31, eller till och med kan undertrycka vissa immunsvar29,34,40.

I vår protokollbeskrivning bestämde vi oss för att fokusera på generering och ingraftment av benmärgsbaserade odlade MCs (BMCMCs), eftersom ett stort antal av dessa celler kan genereras in vitro från benmärgen av vilda eller mutanta möss. MCs kan dock också odlas direkt från embryonala stamceller (embryonala stamcellsbaserade odlade MCs [ESCMCs])41 och när de är genetiskt kompatibla kan dessa celler också användas för inskrivning i MC-bristfälliga möss. Detta alternativa tillvägagångssätt är särskilt intressant för att studera rollen som ett protein vars brist inducerar embryonal dödlighet hos möss, och därför för vilken BMCMCs brist på detta protein inte kan genereras. Både BMCMCs och ESCMCs kan också transducera in vitro med lentivirus som kodar gener av intresse eller shRNA för att tysta gener av intresse, innan dessa celler trycks in i MC-bristfälliga möss31,33.

Vi använder vanligtvis 20% WEHI-3-konditionerat medium som en källa till IL-3 för kulturen av BMCMCs. Rekombinanta IL-3 (10 ng/ml, enligt beskrivningen i steg 1.2.1) kan dock också användas, och tillsats av rekombinant stamcellsfaktor (SCF) till odlingsmediet kan avsevärt öka antalet BMCMCs somgenereras 42,43. Beroende på studien har 10 till 100 ng/ml rekombinant SCF använts, utöver IL-3, för att generera BMCMCs36,44,45. Man bör komma ihåg att kommersiellt tillgängliga murin rekombinanta SCF preparat från olika leverantörer kan skilja sig åt i sin styrka när det gäller att påverka utvecklingen av BMCMCs. Det är också viktigt att erkänna att detaljer om tillvägagångssätt som används för att generera BMCMCs (t.ex. om man lägger till rekombinant SCF till IL-3-innehållande medium, kulturperiodens varaktighet etc.) kan påverka fenotypen och funktionen hos sådana celler. Det har till exempel rapporterats att BMCMCs kroniskt exponerade för SCF har ökat nivåerna av histamin och vissa proteaser44,46, men visar en markant dämpning av FcεRI-medierad degranulation och cytokinproduktion in vitro45. Slutligen, förutom IL-3, innehåller WEHI-3-konditionerat medium många biologiskt aktiva molekyler som kan påverka MC-funktioner. BMCMCs som erhålls med WEHI-3-konditionerat medium kan därför skilja sig från BMCMCs som erhållits med rekombinanta IL-3 (eller med rekombinant IL-3 plus SCF). Det har gjorts få studier av huruvida eller hur länge sådana skillnader i fenotyper av BMCMCs som genereras i olika typer av odlingsmedium behålls efter cellernas inskrivning i olika anatomiska platser in vivo, och ytterligare studier av denna typ kan vara av intresse. Men oavsett de valda odlingsförhållandena bör samma kulturmediumrecept användas för att generera alla BMCMCs som ska användas för engraftment i experiment från vilka resultaten kommer att slås samman för analys. Dessutom bör MCs odlas i minst 4 till 6 veckor innan de graftment i MC-bristfälliga möss, för att nå en renhet på 95-98%(figur 2). Detta för att minska risken för att förekomsten i "BMCMC populationer", av andra hematopoetiska celler än de som är engagerade i mastcellsraderingen (som förekommer i kulturerna med tidiga intervall efter att benmärgscellerna placerats in vitro)kan leda till att givarbaserade celler uppstärkar utöver MCs i" mastcellsknackning' möss.

Vi presenterar här ett detaljerat protokoll för att belamra MC-bristfälliga möss med vild typ eller mutantA BMCMCs intraperitoneally (dvs. intravenöst (i.v.) eller intradermally (dvs. i.d.) i örat pinna, eftersom dessa injektionsvägar har använts av många utredare. Men BMCMCs har också framgångsrikt ingraferats ibakhuden 47, i fotplattan48, intraartikulärt49 eller intra-cranially50,51. Antalet BMCMC:er som ska skrivas in, liksom intervallet mellan inskrivning och experiment, kan variera beroende på injektionsvägen och det riktade organet för att skriva in (figur 1). Det är mycket viktigt att respektera sådana intervall efter att ha ingrafterade BMCMCs innan experimentet påbörjas för att ge BMCMCs (som inte är fullt mogna MFC) tillräckligt med tid för att bli mer mogna in vivo. Eftersom innehållet i medlare som lagras i MC: s cytoplasmagranulat kan fortsätta att öka under cellens livstid38,52, för vissa experiment kan man vilja öka intervallet mellan MC-engraftment och initieringen av experimentet för att bedöma MC-funktionen.

Beroende på injektionsvägen och/eller antalet BMCMC som injiceras kan antalet och/eller den anatomiska fördelningen av de adoptivförflyttade MCs skilja sig från antalet av motsvarande inhemska MC-populationer hos vilda möss12,23,53,54. MC-bristfälliga möss som är insnärmade, dvs. Intravenös överföring av BMCMCs leder inte till normala MC-nummer och/eller distribution i de flesta vävnader. Till exempel finns inga eller mycket få MCs i huden på sådana i.v.-engrafted 'mast cell knock-in' möss. 4-28 veckor efter injektion av BMCMCs i MC-bristfälliga möss är antalet MCs i luftstrupen betydligt lägre än hos motsvarande vilda möss. Däremot är antalet MCs i lungens periferi vanligtvis större än hos motsvarande vilda möss12,23,53,55. I.v. överföring av BMCMCs resulterar också i höga nivåer av MCs i mjälten, medan mycket få inhemska MCs vanligtvis finns i detta organ i vilda möss23,56. Viktigt, tidigare rapporter visade att i.v. injektion av BMCMCs i MC-bristfälliga möss misslyckas med att resultera i engraftment av MC populationer i specifika anatomiska platser såsom ryggmärg, lymfkörtlar eller hjärta54,57. Flera grupper har också noterat att sådan i.v. engraftment inte resulterar i engraftment av intestinala slemhinnan MC (MMC) befolkningen23,58-60. Sådana skillnader i MC-nummer och/eller fördelning av adoptivöverförings-MCs jämfört med inhemska MCs måste beaktas vid tolkning av data som erhållits med hjälp av MC:s mastcellsknackning" modell9.

Det finns flera stammar av MC-bristfälliga möss, och det är viktigt att välja vilka eller vilka som ska användas i ett visst projekt. c-kit mutant MC-bristfälliga möss, såsom KitW/W-v eller KitW-sh/W-sh möss, har traditionellt använts av många utredare. Sådana möss lider dock av många c-kit-relateradefenotypiska avvikelser bredvid deras djupgående MC-brist(tabell 1). Under de senaste åren har flera stammar av möss med c-kit-oberoende konstituerande MC-brist rapporterats24-26. Några av dessa möss uppvisar också andra fenotypiska avvikelser bredvid deras MC-brist (tabell 1), och ytterligare avvikelser kan också upptäckas eftersom fenotypen av dessa nyligen beskrivna stammar fortfarande är under utredning. Alla dessa möss och några ytterligare nya typer av MC-bristfälliga möss har nyligen granskats i detalj9,10,13.

Med tanke på begränsningarna för var och en av de MC-bristfälliga stammar som för närvarande finns tillgängliga rekommenderar vi att du försöker testa hypoteser om MC-funktion med mer än en modell av MC-brist9. I vårt laboratorium utför vi i allmänhet pilotexperiment i KitW-sh/W-sh och Cpa3-Cre; McL-1fl/fl möss. Om vi får samstämmiga resultat i båda typerna av MC-bristfälliga möss fortsätter vi sedan att göra engraftment-experiment för att fastställa MCs roll och bedöma de potentiella rollerna för vissa MC-härledda produkter. Slutligen bör det noteras att flera stammar som möjliggör inducerbar utarmning av MCs eller Cre rekombinas-medierad radering av "floxed" gener i MCs har också nyligen beskrivits25,49,61. Dessa stammar har granskats i detalj på annat håll9,10,13 och representerar lovande alternativa - eller kompletterande - metoder för att studera MC-funktioner in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

N.G. är mottagare av stipendier från franska "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" och Philipp Foundation; R.S. stöds av Lucile Packard Foundation for Children's Health och Stanford NIH/NCRR CTSA award number UL1 RR025744; P.S. stöds av max Kade-stipendiet från Max Kade-stiftelsen och den österrikiska vetenskapsakademin och ett Schroedinger-stipendium från Österrikiska vetenskapsfonden (FWF): J3399-B21; S.J.G. erkänner stöd från National Institutes of Health-bidrag U19 AI104209, NS 080062 och från Tobacco-Related Disease Research Program vid University of California; L.L.R. erkänner stöd från Arthritis National Research Foundation (ANRF) och National Institutes of Health grant K99AI110645.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25 G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30 G x 1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1% Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as 'tunable' effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models - Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. 'Sash' mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

Tags

Immunologi och infektion Utgåva 99,c-kit,stamcellsfaktor FcεRI immunglobulin E musmodell adoptivöverföring immunologi allergi
Analysera funktionerna hos mastceller in <em>vivo med hjälp</em> av<em>' mastcell knock-in</em>' möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, … More

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter