We beschrijven een methode voor het genereren van in vitro afgeleide mestcellen, hun engraftment in mastceldeficiënte muizen, en de analyse van het fenotype, aantallen en distributie van geïgrafeerde mestcellen op verschillende anatomische locaties. Dit protocol kan worden gebruikt om de functies van mestcellen in vivote beoordelen .
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het analyseren van de functies van mastcellen in Vivo met behulp van ' MastCell Knock-in' Muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mastcellen (MC's) zijn hematopoëtische cellen die zich in verschillende weefsels bevinden en vooral overvloedig aanwezig zijn op plaatsen die zijn blootgesteld aan de externe omgeving, zoals huid, luchtwegen en maagdarmkanaal. Vooral bekend om hun schadelijke rol in IgE-afhankelijke allergische reacties, zijn MC's ook naar voren gekomen als belangrijke spelers in gastheerverdediging tegen gif en binnendringende bacteriën en parasieten. MC-fenotype en -functie kunnen worden beïnvloed door micromilieufactoren die kunnen verschillen afhankelijk van de anatomische locatie en/of op basis van het type of stadium van ontwikkeling van immuunresponsen. Om deze reden hebben wij en anderen de voorkeur gegeven aan in vivo benaderingen boven in vitro methoden om inzicht te krijgen in MC-functies. Hier beschrijven we methoden voor het genereren van van beenmerg afgeleide gekweekte MC's (BMCMCs), hun adoptieve overdracht in genetisch MC-deficiënte muizen en de analyse van de aantallen en distributie van adoptief overgedragen MC's op verschillende anatomische locaties. Deze methode, genaamd de'mast cell knock-in'-benadering, is de afgelopen 30 jaar veel gebruikt om de functies van MC's en MC-afgeleide producten in vivote beoordelen . We bespreken de voordelen en beperkingen van deze methode, in het licht van alternatieve benaderingen die de afgelopen jaren zijn ontwikkeld.
Inleiding
Mastcellen (MC's) zijn hematopoëtische cellen die ontstaan uit pluripotente beenmergfgenitatoren1-3. Na uitzetting van het beenmerg migreren MCs-voorlopers naar verschillende weefsels waar ze zich ontwikkelen tot volwassen MC's onder invloed van lokale groeifactoren1-3. Tissue-resident MC's bevinden zich strategisch op host-omgeving interfaces, zoals de huid, de luchtwegen en het maagdarmkanaal, waar ze zich gedragen als een eerste verdedigingslinie tegen externe beledigingen3-6. MC's worden vaak subgeklasseerd op basis van hun "baseline" fenotypische kenmerken en hun anatomische locaties. Bij muizen zijn twee soorten MC's beschreven: ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health en met de specifieke goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee van Stanford University.
1. Generatie en karakterisering van van beenmerg afgeleide gekweekte mestcellen (BMCMCs).
Opmerking: Donor BMCMCs moeten worden gegenereerd uit beenmergcellen met dezelfde genetische achtergrond als de ontvangende MC-deficiënte muizen. Mannelijke donor BMCMCs zijn niet geschikt voor engraftment van vrouwelijke muizen. Vrouwelijke donor BMCMCs zullen met succes in zowel mannelijke ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een overzicht van de 'mastcel knock-in' benadering is weergegeven in figuur 1, en omvat de generatie van BMCMCs, het aantal cellen dat i.p., i.d. of i.v. moet worden gegrafeerd in MC-deficiënte muizen (het aantal kan worden gevarieerd indien aangegeven op basis van het experimentele ontwerp) en het interval tussen engraftment en experiment afhankelijk van de injectieplaats (dit interval kan ook variëren, indien aangegeven; b.v., neemt het gehalte aan opgeslagen mediatoren in MC cytoplas.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Bijna 30 jaar na de oorspronkelijke beschrijving38blijft de'mast cell knock-in '-benaderingwaardevolle informatie verschaffen over wat MC 's wel of niet in vivokunnen doen . Lang werd gedacht dat de functies van MC's beperkt waren tot hun rol bij allergie. Gegevens die zijn gegenereerd met behulp van de'mast cell knock-in'-benaderinghebben deze visie veranderd, door bewijs te leveren dat MC's onder andere een cruciale rol kunnen spelen in de verdediging van de gastheer tegen bepaalde.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Dankbetuigingen
N.G. is de ontvanger van beurzen van de Franse "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" en de Philipp Foundation; R.S. wordt ondersteund door de Lucile Packard Foundation for Children's Health en het Stanford NIH/NCRR CTSA award nummer UL1 RR025744; P.S. wordt ondersteund door een Max Kade Fellowship van de Max Kade Foundation en de Austrian Academy of Sciences en een Schroedinger Fellowship van het Austrian Science Fund (FWF): J3399-B21; S.J.G. erkent steun van National Institutes of Health grants U19 AI104209, NS 080062 en van Tobacco-Related Disease Research Program aan de Universiteit van Californië; L.L.R. erkent steun van de Arthritis National Research Foundat....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1% Antibiotic-Antimycotic Solution | Corning cellgro | 30-004-Cl | |
| 3 ml Syringe | Falcon | 309656 | |
| 35 mm x 10 mm Dish | Corning cellgro | 430588 | |
| 5 ml Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | 352058 | |
| Acetic Acid Glacial | Fisher Scientific | A35-500 | |
| Alcian Blue 8GX | Rowley Biochemical Danver | 33864-99-2 | |
| Allegra 6R Centrifuge | Beckman | ||
| Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified | eBioscience | 14-0161-81 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M7522 | |
| BD 1 ml TB Syringe | BD Syringe | 309659 | |
| BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) Needles | BD Precision Glide Needle | 205155 | |
| BD 25 G 5/8 Needles | BD Syringe | 305122 | |
| BD 30 G x 1/2 Needles | BD Precision Glide | 305106 | |
| Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352097 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | |
| Cytoseal 60 Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8310-4 | |
| Cytospin3 | Shandon | NA | |
| DakoCytomation pen | Dako | S2002 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Corning cellgro | 15-013-CM | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E 7023-500ml | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma Aldrich | F4135-500ml | |
| FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control | eBioscience | 14-4031-82 | |
| Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) | eBioscience | 11-1171-82 | |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Giemsa Stain Modified | Sigma Aldrich | GS-1L | |
| Isothesia | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| May-Grunwald Stain | Sigma Aldrich | MG-1L | |
| Multiwell 6 well plates | Falcon | 35 3046 | |
| Olympus BX60 Microscope | Olympus | NA | |
| Paraplast Plus Tissue Embedding Medium | Fisher Brand | 23-021-400 | |
| PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control | eBioscience | 12-4888-81 | |
| Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x | Corning cellgro | 21-040-CV | |
| Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) | eBioscience | 12-5898-82 | |
| Propidium Iodide Staining Solution | eBioscience | 00-6990-50 | |
| Recombinant Mouse IL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| Safranin-o Certified | Sigma Aldrich | S8884 | |
| Tissue culture flasks T25 25 cm2 | Beckton Dickinson | 353109 | |
| Tissue culture flasks T75 75 cm2 | Beckton Dickinson | 353110 | |
| Toluidine Blue 1% Aqueous | LabChem-Inc | LC26165-2 | |
| Recombinant Mouse SCF | Peprotech | 250-03 |
Referenties
- Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
- Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
