Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Het analyseren van de functies van mastcellen in Vivo met behulp van ' MastCell Knock-in' Muizen

Published: May 27, 2015 doi: 10.3791/52753
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

Summary

We beschrijven een methode voor het genereren van in vitro afgeleide mestcellen, hun engraftment in mastceldeficiënte muizen, en de analyse van het fenotype, aantallen en distributie van geïgrafeerde mestcellen op verschillende anatomische locaties. Dit protocol kan worden gebruikt om de functies van mestcellen in vivote beoordelen .

Abstract

Mastcellen (MC's) zijn hematopoëtische cellen die zich in verschillende weefsels bevinden en vooral overvloedig aanwezig zijn op plaatsen die zijn blootgesteld aan de externe omgeving, zoals huid, luchtwegen en maagdarmkanaal. Vooral bekend om hun schadelijke rol in IgE-afhankelijke allergische reacties, zijn MC's ook naar voren gekomen als belangrijke spelers in gastheerverdediging tegen gif en binnendringende bacteriën en parasieten. MC-fenotype en -functie kunnen worden beïnvloed door micromilieufactoren die kunnen verschillen afhankelijk van de anatomische locatie en/of op basis van het type of stadium van ontwikkeling van immuunresponsen. Om deze reden hebben wij en anderen de voorkeur gegeven aan in vivo benaderingen boven in vitro methoden om inzicht te krijgen in MC-functies. Hier beschrijven we methoden voor het genereren van van beenmerg afgeleide gekweekte MC's (BMCMCs), hun adoptieve overdracht in genetisch MC-deficiënte muizen en de analyse van de aantallen en distributie van adoptief overgedragen MC's op verschillende anatomische locaties. Deze methode, genaamd de'mast cell knock-in'-benadering, is de afgelopen 30 jaar veel gebruikt om de functies van MC's en MC-afgeleide producten in vivote beoordelen . We bespreken de voordelen en beperkingen van deze methode, in het licht van alternatieve benaderingen die de afgelopen jaren zijn ontwikkeld.

Introduction

Mastcellen (MC's) zijn hematopoëtische cellen die ontstaan uit pluripotente beenmergfgenitatoren1-3. Na uitzetting van het beenmerg migreren MCs-voorlopers naar verschillende weefsels waar ze zich ontwikkelen tot volwassen MC's onder invloed van lokale groeifactoren1-3. Tissue-resident MC's bevinden zich strategisch op host-omgeving interfaces, zoals de huid, de luchtwegen en het maagdarmkanaal, waar ze zich gedragen als een eerste verdedigingslinie tegen externe beledigingen3-6. MC's worden vaak subgeklasseerd op basis van hun "baseline" fenotypische kenmerken en hun anatomische locaties. Bij muizen zijn twee soorten MC's beschreven: "bindweefsel-type" MC's (CTMCs) en mucosale MC's (MMC's)1-3,7,8. CTMCs bevinden zich vaak rond venules en in de buurt van zenuwvezels en bevinden zich in serosale holtes, terwijl MMC's intra-epitheliale locaties in de darm en het ademhalingsslijmvlies1-3bezetten.

Talrijke methoden zijn toegepast om biologische functies van MC 's9-13te bestuderen . Veel groepen hebben zich gericht op in vitro benaderingen met behulp van cellijnen (zoals de menselijke MC-lijnen HMC114 of LAD215,16),in vitro afgeleide MC's (zoals menselijke perifere bloedafname MC's17, of muis beenmerg-afgeleide gekweekte MC's [BMCMCs]18, foetale huid-afgeleide gekweekte MC's [FSCMC's]19 en peritoneale cel-afgeleide MC's [PCMC's] Al deze modellen worden veel gebruikt om moleculaire details van MC-biologie te bestuderen, zoals signaleringsroutes die betrokken zijn bij MC-activering. Een belangrijk aspect van de MCs-biologie is echter dat hun fenotypische en functionele kenmerken (bijv.cytoplasmatisch granulaat proteasegehalte of reactie op verschillende stimuli) kunnen worden gemoduleerd door anatomische locatie en micromilieu2,7. Aangezien de exacte mix van dergelijke factoren die in vivo worden aangetroffen moeilijk in vitrokan worden gereproduceerd , geven wij de voorkeur aan het gebruik van in vivo benaderingen om inzicht te krijgen in MC-functies9.

Er bestaan verschillende muizenstammen met genetisch MC-deficiëntie, zoals de veel gebruikte WBB6F1-Kit W/W-v of C57BL/6-Kit W-sh/W-sh muizen. Deze muizen missen expressie en/of activiteit van KIT (CD117), de receptor voor de belangrijkste MC groeifactor stamcelfactor (SCF)21,22. Als gevolg hiervan hebben deze muizen een ernstig MC-tekort, maar hebben ze ook extra fenotypische afwijkingen die verband houden met hunc-kitmutaties (in de WBB6F1-Kit W/W-v muizen) of met de effecten van de grote chromosomale inversie die resulteert in verminderde c-kit expressie (in de C57BL/6-Kit W-sh/W-sh muizen)9,10,12,23. Meer recentelijk zijn verschillende muizenstammen metc-kit-onafhankelijke constitutieve MC-deficiëntie gemeld24-26. Al deze muizen en enkele extra nieuwe soorten inductieve MC-deficiënte muizen zijn onlangs in detail beoordeeld9,10,13.

Hier beschrijven we methoden voor het genereren van van beenmerg afgeleide gekweekte MC's (BMCMCs), hun adoptieve overdracht in MC-deficiënte muizen en de analyse van de aantallen en distributie van adoptief overgedragen MC's op verschillende anatomische locaties. Deze zogenaamde "mast cell knock-in"-methode kan worden gebruikt om de functies van MC's en MC-afgeleide producten in vivote beoordelen . We bespreken de voordelen en beperkingen van deze methode, in het licht van alternatieve benaderingen die de afgelopen jaren zijn ontwikkeld.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health en met de specifieke goedkeuring van het Institutional Animal Care and Use Committee van Stanford University.

1. Generatie en karakterisering van van beenmerg afgeleide gekweekte mestcellen (BMCMCs).

Opmerking: Donor BMCMCs moeten worden gegenereerd uit beenmergcellen met dezelfde genetische achtergrond als de ontvangende MC-deficiënte muizen. Mannelijke donor BMCMCs zijn niet geschikt voor engraftment van vrouwelijke muizen. Vrouwelijke donor BMCMCs zullen met succes in zowel mannelijke als vrouwelijke ontvangers worden gesengrafeerd.

  1. Beenmergextractie.
    1. Giet steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in 6 putkweekplaat (1 put per muis) en leg op ijs.
    2. Week de dissectie-instrumenten in 70% ethanol voor sterilisatie.
    3. Euthanaseer donormuizen door inademing van kooldioxide (CO2),gevolgd door cervicale dislocatie, en besproei de muizen vervolgens met 70% ethanol op de plaatsen van manipulatie.
    4. Gebruik steriele dissectie-instrumenten om de botten van het dijbeen, het scheenbeen en het kuitbeen te extraheren zonder botepifysen te snijden.
    5. Terwijl u de botten met een tang vastzetten, schraapt u al het weefsel van de botten af (en gooit u kuitbeen weg) met een steriele schaar (of scalpelbladen). Leg de botten in PBS op ijs totdat alle botten zijn verzameld.
    6. Voer alle resterende stappen uit in de steriele weefselkweekkap. Met behulp van steriele instrumenten, beveilig botten met een tang en snijd beide epifysen af om de medullaire holte bloot te leggen.
    7. Gebruik 3 ml spuiten en 30 G naalden en koud spoelmiddel (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] aangevuld met 10% foetale kalfsserum [FCS, warmte-geactiveerd], 2 mM L-glutamine, 1% antibiotica-antimycotische oplossing, 50 μM Β-mercaptoethanol), spoel het rode beenmerg in een Petrischaal.
    8. Gebruik dezelfde spuit om doorgespoelde beenmergcelclusters te ontkoppelen door herhaalde zachte aspiratie en ejectie.
    9. Pool femur en tibiaal beenmerg van elke muis in één centrifugebuis van 15 ml. Vul de buis met koud spoelmiddel om beenmergcellen te wassen en centrifugeer op 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
  2. BMCMCs Cultuur.
    1. Verwijder supernatant en herstel geplet beenmergcellen in 10 ml kweekmedium (DMEM aangevuld met 10% foetale kalfsserum [FCS, warmte-inactivated], 2 mM L-glutamine, 1% antibioticum-antimycotische oplossing, 50 μM Β-mercaptoethanol en 20% WEHI-3 celgeconditioneerd medium [als bron van IL-3; of gebruik recombinant IL-3].
    2. Plaats cellen in weefselkweekkolf van de juiste grootte(bijv.T25 voor 1 muis, T75 voor 2 muizen, enz.).
    3. Breng 1-2 dagen na het plateren van cellen medium- en suspensiecellen (waardoor vuil en aanhangende cellen aan de bodem van de kolf blijven plakken) over naar een nieuwe kolf en voeg vers kweekmedium (10 ml/muis) toe.
    4. Voer in de volgende weken elke 3-4 dagen cellen (voeg 10 ml kweekmedium per muis toe). Houd de celdichtheid tussen 2,5 x 105-1 x 106 cellen/ml. Breng niet-aanhechtende cellen eenmaal per week over in een nieuwe kolf totdat er geen aanhangcellen in de kweekkolf aanwezig zijn. Test de rijpheid van cellen (zie hieronder) voor gebruik voor in vitro tests of engraftment bij MC-deficiënte muizen.
      OPMERKING: Volledige differentiatie van BMCMCs duurt 4-6 weken.
  3. Beoordeling van de volwassenheid van bmcmc.
    1. Met behulp van flow cytometrie.
      1. Was cellen (5 x 104-5 x 105 cellen/conditie) met ijskoude FACS buffer (PBS, 0,5% FCS) in 5 ml polystyreen ronde bodembuis. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Aspireer supernatant.
      2. Verdun antimuis CD16/32 (kloon 93 of 2,4G2) monoklonale antilichamen 1:200 (2,5 μg/ml) in FACS-buffer. Voeg 10 μl toe aan elke pellet en resuspend door korte vortexing. Incubeer 5 minuten op ijs om fc binding te blokkeren.
        OPMERKING: Bescherm monsters tegen direct licht voor alle resterende stappen.
      3. Verdun fycoerythrine (PE) geconjugeerde antimuis Fc εRI α (kloon MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) en fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerde antimuisKIT (CD117; kloon 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("kleuringsoplossing"), of de respectievelijke gelabelde isotypecontrole.
      4. Splits de helft van de geblokkeerde cellen van stap 1.3.1.2) in een extra polystyreen ronde bodembuis en voeg 20 μl "kleuroplossing" toe in één buis en 20 μl "isotypecontroleoplossing" in de andere buis. Incubeer 30 minuten op ijs.
      5. Voeg 3 ml ijskoude FACS-buffer toe en centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Gooi supernatant weg en resuspend de pellet in 300 μl FACS-buffer met 1 μg/ml propidiumjodide (PI, voor identificatie van dode cellen). Ga verder met de analyse van de stromingscytometrie (zie figuur 2A).
    2. Met behulp van toluidine blauwe kleuring.
      1. Was eenmaal 1 x10 5 cellen met PBS door centrifugeren op 400 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en aspireer en resuspend cellen in 200 μl PBS.
      2. Breng de celsuspensie over in een voorbereid cytofunnel bevestigd aan een microscoopschuif en ga verder met cytocentrifugatie met behulp van een cytocentrifuge (40 x g gedurende 5 min).
      3. Droog aan de lucht gedurende 10 minuten en teken een wascirkel rond cellen met behulp van een PAP-pen. Voeg 0,1% Toluidine blauwe oplossing toe om de cellen te bedekken. Incubeer gedurende 1 min. Was dia's in stromend leidingwater gedurende 1 min en droog vervolgens 10 min.
      4. Coverslip cellen met behulp van montagemedium. Ga verder met lichtmicroscoopanalyse (zie figuur 2B)

2. Engraftment van Mast Cell-deficiënte Muizen met BMCMCs.

  1. Oor engraftment door intradermale (i.d.) injectie.
    OPMERKING: Voor de adoptieoverdracht van BMCMC's in de oorpinnae van MC-deficiënte muizen, raden we aan om twee injecties van elk 1 x10 6 cellen (voor een totaal van 2 x 106 cellen) per oorpinna uit te voeren. Intradermale engraftment van BMCMCs in de oorpinnae van MC-deficiënte muizen is door veel onderzoekers gebruikt in verschillende modellen, waaronder modellen van passieve cutane anafylaxie (PCA)24,27, gastheerverdediging tegen gif28, en chronische overgevoeligheid (CHS) reacties29,30.
    1. Tel en resuspend cellen bij 4 x 107 BMCMCs/ml (1 x 106 BMCMCs/25 μl) in koude DMEM. Breng bmcmc's-oplossing over in een spuit van 1 ml die is uitgerust met een naald van 30 G. Blijf op ijs tot injectie.
    2. Verdoof 4-6 weken oude MC-deficiënte muizen met isofluraan (2,5% v/v). Controleer de diepte van de anesthesie door teenknijpen, pas isofluraan aan indien geïndiceerd en blijf de ademhaling en de knijprespons van de teen gedurende de hele procedure controleren. Breng oogzalf aan met een Q-tip om uitdroging van de ogen te voorkomen.
    3. Creëer met de wijsvinger verticale druk op het dorsale gezicht van de oorpinna om het ventrale gezicht bloot te leggen en uit te rekken.
    4. Voer twee 25 μl i.d. injecties van BMCMC-oplossing uit op twee verschillende plaatsen van het ventrale vlak van de oorpinna, de eerste injectie in het midden van het oor en de tweede injectie in de richting van de punt van de oorpinna. Wacht 4-6 weken na i.d. engraftment voordat u in vivo experimenten uitvoert.
      Opmerking: Onze ervaring is dat tegen die tijd het aantal MC's/mm2 dermis in het centrale deel van de oorpinna over het algemeen vergelijkbaar is met dat op de overeenkomstige locatie bij muizen van het wilde type, terwijl het aantal MC's/mm2 in de periferie van de oorpinnae doorgaans aanzienlijk lager is dan dat in de overeenkomstige wilde muizen27,28. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het ontwerpen van experimenten met dergelijke MC-engrafted muizen(bijv.middelen met mogelijke effecten op de MC-functie moeten in het centrale deel van de oorpinnae worden geïnjecteerd, en de analyse van de effecten van dergelijke behandelingen moet zich ook op dat gebied richten).
  2. Peritoneale holte engraftment door intraperitoneale (i.p.) injectie.
    OPMERKING: Adoptieve overdracht van BMCMCs in de peritoneale holte van MC-deficiënte muizen vereist één injectie van 2 x 106 cellen per muis. Dergelijke i.p. injecties van BMCMCs in MC-deficiënte muizen zijn door veel groepen gebruikt om de rollen van peritoneale MC's in verschillende modellen te bestuderen, waaronder modellen van gastheerverdediging tegen gif31 of bacteriële sepsis32,33.
    1. Tel het juiste aantal cellen en resuspend bij 1 x 107 BMCMCs/ml (2 x 106 BMCMCs/200 μl) in koude DMEM. Breng bmcmc's-oplossing over in een spuit van 1 ml die is uitgerust met een naald van 25 G. Blijf op ijs tot injectie.
    2. Voer 1 injectie van 200 μl BMCMCs-oplossing uit in de peritoneale holte van 4-6 weken oude MC-deficiënte muizen. Wacht 4-6 weken na i.p. engraftment voordat u in vivo experimenten uitvoert.
  3. Engraftment door intraveneuze (i.v.) injectie.
    OPMERKING: Adoptieve overdracht van BMCMCs door i.v. injectie in MC-deficiënte muizen vereist één injectie van 5 x 106 cellen per muis. Intraveneuze (i.v.) injecties van BMCMCs in MC-deficiënte muizen zijn door veel groepen gebruikt om de rol van MC's in verschillende ziektemodellen te bestuderen, waaronder modellen van blaasontsteking34, astma35, longfibrose36en antilichaamgemedieerde artritis37.
    1. Tel het juiste aantal cellen en resuspend bij 2,5 x 107 BMCMCs/ml (5 x 106 BMCMCs/200 μl) in koude DMEM. Breng bmcmc's-oplossing over in een spuit van 1 ml die is uitgerust met een naald van 30 G. Blijf op ijs tot injectie.
    2. Verdoof 4-6 weken oude MC-deficiënte muizen met isofluraan (2,5% v/v). Controleer de diepte van de anesthesie door teenknijpen, pas isofluraan aan indien geïndiceerd en blijf de ademhaling en de knijprespons van de teen gedurende de hele procedure controleren. Breng oogzalf aan met een Q-tip om uitdroging van de ogen te voorkomen.
    3. Voer één injectie van 200 μl BMCMC-oplossing uit in de staartader (of, als alternatief, de retro-orbitale ader) van een MC-deficiënte muis. Wacht 12 weken na i.v. engraftment voordat u in vivo experimenten uitvoert.

3. Analyse van engrafted mastceldeficiënte muizen.

  1. Oor engraftment analyse.
    1. Aan het einde van het experiment euthanaseert u muizen door CO2-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie.
    2. Isoleer de oorpinnae en fixeer in 10% (vol/vol) gebufferd formaline 's nachts bij 4 °C. Sluit vaste oorpinnae in paraffine, snijd 4 μm delen oorpinnae en monteer op glazen dia's.
    3. Bevlek de dia's met een 0,1% Toluidine blauwe oplossing gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Was dia's 1 minuut in kraanwater en droog de dia's vervolgens 10 minuten op kamertemperatuur.
    4. Coverslip dia's met behulp van montagemedium, tel vervolgens het aantal gegrafeerde MC's per pinnae-secties met behulp van een lichtmicroscoop. Evalueer de engraftmentefficiëntie door het percentage en de verdeling van MC's in de oorhuid van gegrafeerde muizen te vergelijken met wilde muizen.
  2. Peritoneale holte engraftment analyse.
    1. Evaluatie van het aantal mestcellen in de buikholte.
      1. Aan het einde van het experiment euthanaseert u muizen door CO2-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie. Verwijder voorzichtig de ventrale huid van de muizen zonder de peritoneale holte te breken.
      2. Injecteer 5 ml PBS op koude of kamertemperatuur in de buikholte met een spuit van 5 ml die is uitgerust met een naald van 25 G. Gebruik koude PBS om het risico op het activeren van peritoneale cellen te verminderen (dit is erg belangrijk bij het evalueren van peritoneale MC-degranulatie of niveaus van sommige MC-afgeleide producten in de peritoneale lavagevloeistof). Voer een massage van de buik gedurende 20 seconden uit om peritoneale cellen te oogsten.
      3. Aspireer langzaam de peritoneale lavage met behulp van een spuit van 5 ml die is uitgerust met een naald van 22 G. Registreer het volume van de aangezogen lavage (verwacht tot 80% van het geïnjecteerde volume te herstellen).
      4. Breng peritoneale lavagevloeistof over in een ronde bodembuis van 5 ml polystyreen en centrifugeer gedurende 5 min bij 4 °C op 4°C. Aspireer supernatant. Herstel de pellet in 400 μl koude PBS.
      5. Tel het totale aantal peritoneale cellen met behulp van een hemocytometerkamer. Gebruik de helft van de celsuspensie voor een flowcytometrieanalyse (zoals beschreven in stap 1.3.1), om het percentage en de markerexpressie van gegrafeerde MC's in de peritoneale holte te evalueren. Vermenigvuldig het totale aantal peritoneale cellen met het percentage MC's om het absolute aantal peritoneale MC's te verkrijgen.
      6. Voer een cytocentrifugatie uit met de resterende cellen zoals beschreven in stap 1.3.2.2. Droog aan de lucht gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en teken een wascirkel rond cellen met behulp van een PAP-pen.
      7. Bedek cellen met onverdunde May-Grünwald Kleuroplossing gedurende 5 minuten, gevolgd door 5 minuten wassen in PBS, beide op kamertemperatuur. Bedek cellen met Giemsa-vlek verdund 1:20 met gedeï gedeïdentealiseerd water en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur. Was dia's 2 keer in kraanwater gedurende 1 minuut en droog vervolgens de glijbanen aan de lucht.
      8. Bedekt cellen met behulp van montagemedium en bereken het percentage gegrafeerde MC's met behulp van een lichtmicroscoop (door ten minste 400 totale cellen te tellen). Evalueer de engraftment-efficiëntie door het percentage MC's in de peritoneale lavage van gegrafeerde muizen te vergelijken met wilde muizen.
    2. Evaluatie van mestcellen in de mesenterische ramen.
      1. Na de peritoneale lavage beschreven in stap 3.2.1, snijdt u het peritoneale membraan open om het darmkanaal van de muizen bloot te leggen. Plaats 4 tot 5 mesenterische vensters per muis op een dia.
      2. Bevestig de dia's gedurende 1 uur in Carnoy-oplossing (3:2:1 vol/vol/vol ethanol, chloroform en ijsazijnzuur) bij kamertemperatuur. Luchtdroge dia's en verwijder de darm (de vaste mesenterische ramen blijven aan de dia's bevestigd).
      3. Beits de preparaten gedurende 20 minuten op kamertemperatuur met Csaba (Alcian blue/Safranin O) kleuroplossing.
        1. Om 500 ml Csaba-vlek te maken, bereidt u 500 ml acetaatbuffer door 100 ml 1 M natriumacetaatoplossing te mengen met 120 ml 1 M HCl. Maak tot 500 ml met gedeioneerd water en stel de pH in op 1,42. Los vervolgens 90 mg Safranin [identificeert 'volwassen MC's' in rood], 1,8 g Alcisch blauw [identificeert 'onrijpe MC's' in blauw] en 2,4 g ijzer ammoniumsulfaat NH4Fe(SO4)2 in 500 ml acetaatbuffer.
      4. Coverslip dia's met behulp van montagemedium, tel vervolgens het aantal geïmgrafeerde MC's per mesenterisch venster met behulp van een lichtmicroscoop. Evalueer de engraftmentefficiëntie door het percentage en de verdeling van MC's in de mesenterische vensters van geïmgrafeerde muizen te vergelijken met wilde muizen.
  3. I.v. engraftment analyse.
    1. Aan het einde van het experiment euthanaseer muizen door CO2-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie, en oogst weefsel van belang(bijv. long, huid of milt) en fixeer 's nachts in 10% (vol / vol) gebufferd formaline bij 4 °C.
    2. Sluit vaste weefsels in paraffine in, snijd 4 μm secties en monteer op glazen dia's. Bevlek de dia's met een 0,1% Toluidine blauwe oplossing gedurende 1 min bij kamertemperatuur. Was dia's 1 minuut in kraanwater en droog vervolgens 10 minuten aan de lucht.
    3. Coverslip dia's met behulp van montagemedium en evalueren het aantal en de verdeling van gegrafeerde MC's per weefselsectie met behulp van een lichtmicroscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een overzicht van de 'mastcel knock-in' benadering is weergegeven in figuur 1, en omvat de generatie van BMCMCs, het aantal cellen dat i.p., i.d. of i.v. moet worden gegrafeerd in MC-deficiënte muizen (het aantal kan worden gevarieerd indien aangegeven op basis van het experimentele ontwerp) en het interval tussen engraftment en experiment afhankelijk van de injectieplaats (dit interval kan ook variëren, indien aangegeven; b.v., neemt het gehalte aan opgeslagen mediatoren in MC cytoplasmatische korrels gestaag toe met de tijd38). Figuur 2 toont representatieve flow cytometrie analyses en toluidine blauwe kleuring van BMCMCs na 1, 15 en 45 dagen kweek in DMEM medium met in 20% WEHI-3 celgeconditioneerd medium als bron van IL-3. Merk op dat BMCMCs gekweekt gedurende 45 dagen 95% zuiver zijn, grote aantallen cytoplasmatische korrels bevatten en kunnen worden gebruikt voor engraftment-experimenten, terwijl cellen die gedurende 15 dagen zijn gekweekt niet geschikt zijn voor engraftment. Figuur 3 toont representatieve succesvolle engraftment in de oorpinnae 4 weken na i.d. engraftment (Figuur 3A), in mesenterische vensters (Figuur 3B) en peritoneale holte (Figuur 3C) 6 weken na i.p. engraftment, en in de long (Figuur 3D) 12 weken na i.v. engraftment.

Figure 1
Figuur 1: 'Mast cell knock-in'muismodel voor analyses van MC-functies in vivo. Wilde type of mutante beenmerg-afgeleide gekweekte MC's (BMCMCs) worden gegenereerd door het cultiveren van beenmergcellen gedurende ten minste 4-6 weken in 20% WEHI-3 celgeconditioneerd medium als bron van IL-3 (of als alternatief in medium dat 10 ng/ml recombinante muis IL-3 bevat). Deze BMCMCs kunnen vervolgens worden geïmpgrafeerd in MC-deficiënte muizen om zogenaamde 'mastcel knock-in' muizen te creëren. BMCMCs kunnen worden geïnjecteerd via verschillende routes (intraveneuze [i.v.], intraperitoneale [i.p.] of intradermale [i.d.]) voor lokale (i.d., i.p.) of systemische (i.v.) reconstitutie van verschillende MC-populaties. MC-functie(s) in verschillende biologische reacties kunnen vervolgens worden geanalyseerd door de reacties bij wilde muizen, MC-deficiënte muizen en 'mastcel knock-in' muizen te vergelijken. De bijdrage(s) van specifieke MC-producten kunnen worden geanalyseerd door reacties van 'mastcel knock-in' muizen die zijn geïmpgrafeerd met bmcmcs van het wilde type of BMCMC's die zijn afgeleid van muizen die dergelijke producten missen of genetisch gewijzigde vormen uitdrukken, te vergelijken. (Dit is een gewijzigde versie van figuur 1 uit ref.12).

Figure 2
Figuur 2: Evaluatie van de zuiverheid van BMCMC-preparaten door flowcytometrie en microscopie. (A) Representatieve flow cytometrie analyses van FcεRIα en KIT (CD117) expressie op het oppervlak van 1 dag (linker paneel), 15 dagen (middenpaneel) en 45 dagen (rechter paneel) oude BMCMCs. Propidium jodide (PI)-positieve dode cellen werden uitgesloten van de analyse (niet getoond). Getallen geven het percentage FcεRIα+KIT+ BMCMCs aan dat in het blauwe vierkant is gated. (B) Representatieve foto's van BMCMC's gekleurd met toluidineblauw, onderste paneel is een vergroting van de gebieden van het bovenste paneel gedefinieerd in zwarte stippellijnen. Staven = 10 μm.

Figure 3
Figuur 3: Evaluatie van de efficiëntie van MC-engraftment op verschillende anatomische locaties. (A) Representatieve foto's van 4 μm oorpinnae secties gekleurd met toluidine blauw. (B) Representatieve foto's van mesenterische ramen bevlekt met Safranin/Acian Blue ('Csaba' vlek). (C) Representatieve foto's van cellen aanwezig in peritoneale lavage vloeistoffen en bevlekt met May-Grünwald Giemsa (MGG). (D) Representatieve foto's van 4 μm longsecties gekleurd met toluidine blauw. Staven = 50 μm (A, B en D) of 20 μm (C). Foto's zijn van C57BL/6 wilde type muizen (bovenste paneel), MC-deficiënte KitW-sh/W-sh muizen (middenpaneel) en MC-deficiënte muizen gegrafeerd met wild type BMCMCs: BMCMCs KitW-sh/W-sh (onderste paneel). MC's worden aangegeven met pijlen.

Muizen Beschikbare achtergronden MC-nummers
(steady state)		 Andere fenotypes (beoordeeld in9,10,13) Gerapporteerde engraftments met BMCMCs
KitW/W-v (WB/Re x C57BL/6) F1
(Jackson Laboratoria –
WBB6F1/J-KitW/KitW-v/J)		 Afwezigheid van bindweefsel en mucosale MC's Bloedarmoede, verminderde basofiele en neutrofiele aantallen, tekortkomingen in melanocyten en interstitiële cellen van Cajal, steriel, enz. i.v.m.35,37; i.p.31,62; d.d.28,29; i.c.50,51; i.a.49; fp.i. 63
UitrustingW-sh/W-sh C57BL/6
(Jackson Laboratoria –
B6. Cg-KitW-sh/HNihrJaeBsmJ) Single nucleotide polymorfisme analyse uitgevoerd in Jackson laboratoria toont aan dat deze muizen slechts ~87% C57BL/6-genetische achtergrond hebben.		 Afwezigheid van bindweefsel en mucosale MC's Matige toename van basofiele en neutrofiele aantallen, toename van het aantal myeloïde-afgeleide suppressorcellen64, tekortkomingen in melanocyten en interstitiële cellen van Cajal i.v.23,34-36; i.p.31,62; d.d.28,29; o.a.49
C57BL/6J
(Jackson Laboratoria –
B6. Cg-KitWsh/HNihrJaeBsmGlliJ) Deze muizen zijn >11 keer teruggekruist op de C57BL/6J achtergrond.
BALB/c65
(C.B6-UitrustingW-sh)
Mcpt5-Cre;
R-DTA 		C57BL/625
(Tg(Cma1-cre) ARoer; B6.129P2-Gt(ROSA)26Sortm1(DTA)Lky/J)		 Duidelijke vermindering van peritoneale (98%) en huid (89-96,5%) MC's, mucosale MC's die waarschijnlijk niet uitgeput zijn Waarschijnlijke aanwezigheid van mucosale MC's; reporter muizen onthult Cre-gemedieerde verwijdering van 'gefloxte' YFP transgene in ~30% milt NK cellen66 geen
Cpa3Cre/+ C57BL/626
(B6.129P2-Cpa3tm3(icre)Hrr)		 Afwezigheid van bindweefsel en mucosale MC's Cpa3 uitgedrukt in andere celtypen; verminderde basofiele aantallen i.v.m.26
BALB/c26
(B6.129P2/OlaHsd.BALB/c-Cpa3tm3(icre)Hrr)
Cpa3-Cre;
Mcl-1fl/fl 		C57BL/624
(Tg(Cpa3-cre)3Glli; B6;129-Mcl1tm3sjkJ)		 Afwezigheid van bindweefsel en mucosale MC's Cpa3 uitgedrukt in andere celtypen; verhoogde milt neutrofielen & milde bloedarmoede;
verminderde basofiele aantallen		 i.d.24;
o.a.49
i.v. (onze niet-gepubliceerde gegevens)

Tabel 1: Muizenstammen met constitutieve MC-tekortkomingen. Er zijn verschillende muizenstammen metc-kit-afhankelijke of c-kit-onafhankelijke constitutieve MC-deficiëntie beschikbaar. In principe kunnen al deze stammen worden gebruikt om 'mastcel knock-in' muizen te genereren (hoewel dit voor zover wij weten nog niet is gemeld voor Mcpt5-Cre; R-DTA muizen). Elk van deze stammen heeft echter andere fenotypische afwijkingen en beperkingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het interpreteren van resultaten die met deze muizen zijn verkregen. Enkele voorbeelden van succesvolle MC-engraftment zijn te vinden in de referenties. (Dit is een gewijzigde en bijgewerkte versie van tabel 1 uit ref.9).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bijna 30 jaar na de oorspronkelijke beschrijving38blijft de'mast cell knock-in '-benaderingwaardevolle informatie verschaffen over wat MC 's wel of niet in vivokunnen doen . Lang werd gedacht dat de functies van MC's beperkt waren tot hun rol bij allergie. Gegevens die zijn gegenereerd met behulp van de'mast cell knock-in'-benaderinghebben deze visie veranderd, door bewijs te leveren dat MC's onder andere een cruciale rol kunnen spelen in de verdediging van de gastheer tegen bepaalde pathogenen4,39 of gif28,31, of zelfs bepaalde immuunresponsen kunnen onderdrukken29,34,40.

In onze protocolbeschrijving hebben we besloten om ons te concentreren op het genereren en engraftment van van beenmerg afgeleide gekweekte MC's (BMCMCs), omdat grote aantallen van deze cellen in vitro kunnen worden gegenereerd uit het beenmerg van wilde type of mutante muizen. MC's kunnen echter ook rechtstreeks worden gekweekt uit embryonale stamcellen (embryonale stamcel-afgeleide gekweekte MC's [ESCMC's])41 en, indien genetisch compatibel, kunnen deze cellen ook worden gebruikt voor engraftment in MC-deficiënte muizen. Deze alternatieve benadering is vooral interessant voor het bestuderen van de rol van een eiwit waarvan het tekort embryonale dodelijkheid bij muizen veroorzaakt, en daarom kunnen BMCMCs-tekort voor dit eiwit niet worden gegenereerd. Zowel BMCMCs als ESCMC's kunnen ook in vitro worden getransduceerd met lentivirussen die coderen voor genen van belang of shRNA om genen van belang het zwijgen op te leggen, voordat deze cellen worden omgezet in MC-deficiënte muizen31,33.

We gebruiken meestal 20% WEHI-3-geconditioneerd medium als een bron van IL-3 voor de cultuur van BMCMCs. Recombinant IL-3 (10 ng/ml, zoals beschreven in stap 1.2.1) kan echter ook worden gebruikt, en toevoeging van recombinante stamcelfactor (SCF) aan het kweekmedium kan het aantal gegenereerde BMCMCs aanzienlijk verbeteren42,43. Afhankelijk van het onderzoek is naast IL-3 10 tot 100 ng/ml recombinant SCF gebruikt om BMCMCs36,44,45te genereren. Men moet in gedachten houden dat in de handel verkrijgde murine recombinante SCF-preparaten van verschillende leveranciers kunnen verschillen in hun potentie bij het beïnvloeden van de ontwikkeling van BMCMC's. Het is ook belangrijk om te erkennen dat details van de aanpak die worden gebruikt om BMCMCs te genereren (zoals of men recombinant SCF toevoegt aan IL-3-bevattend medium, de duur van de kweekperiode, enz.)het fenotype en de functie van dergelijke cellen kunnen beïnvloeden. Er is bijvoorbeeld gemeld dat BMCMCs die chronisch zijn blootgesteld aan SCF verhoogde histaminespiegels en bepaalde proteasen44,46hebben , maar een duidelijke demping vertonen van fcεRI-gemedieerde degranulatie en cytokineproductie in vitro45. Ten slotte bevat WEHI-3-geconditioneerd medium, naast IL-3, veel biologisch actieve moleculen die MC-functies kunnen beïnvloeden. BMCMCs verkregen met WEHI-3-geconditioneerd medium zullen daarom waarschijnlijk verschillen van BMCMCs verkregen met recombinant IL-3 (of met recombinant IL-3 plus SCF). Er zijn weinig studies geweest naar de vraag of of hoe lang dergelijke verschillen in de fenotypes van BMCMC's die in verschillende soorten kweekmedium worden gegenereerd, worden behouden na de engraftment van de cellen in verschillende anatomische sites in vivo, en aanvullende studies van dit type kunnen van belang zijn. Ongeacht de gekozen kweekomstandigheden moet echter hetzelfde kweekmediumrecept worden gebruikt om alle BMCMCs te genereren die moeten worden gebruikt voor engraftment in experimenten waaruit de resultaten voor analyse zullen worden samengevoegd. Bovendien moeten MC's ten minste 4 tot 6 weken worden gekweekt voordat ze in MC-deficiënte muizen worden gegraft, om een zuiverheid van 95-98% te bereiken (figuur 2). Dit om de kans te verkleinen dat de aanwezigheid, in de "BMCMC-populaties", van andere hematopoëtische cellen dan die welke zijn toegewijd aan de mastcellijn (die in de culturen aanwezig zijn met vroege tussenpozen na het plaatsen van de beenmergcellen in vitro) kan leiden tot het verschijnen van donor-afgeleide cellen naast MC's in de 'mastcel knock-in' muizen.

We presenteren hier een gedetailleerd protocol voor het engraferen van MC-deficiënte muizen met wild type of mutant BMCMCs intraperitoneaal (i.p.), intraveneus (i.v.) of intradermaal (i.d.) in de oorpinna, omdat deze injectieroutes door veel onderzoekers zijn gebruikt. BMCMCs zijn echter ook met succes in de achterhuidgegrafeerd 47, in het voetpad48, intra-articulaire49 of intra-cranially50,51. Het aantal bmcmc's dat moet worden gegraft, evenals het interval tussen engraftment en experiment, kunnen variëren afhankelijk van de injectieroute en het beoogde orgaan om te engraferen (figuur 1). Het is van groot belang om dergelijke intervallen na het onderzoeken van de BMCMC's te respecteren voordat met het experiment wordt begonnen , zodat BMCMCs (die geen volledig volwassen MC's zijn) in vivovolwassener kunnen worden . Omdat het gehalte aan mediatoren die zijn opgeslagen in de cytoplasmatische korrels van het MC in de loop van de levensduur van de cel kan blijven toenemen38,52, voor bepaalde experimenten kan men het interval tussen MC-engraftment en de start van het experiment willen verhogen om de MC-functie te beoordelen.

Afhankelijk van de injectieroute en/of het aantal geïnjecteerde BMCMC's kunnen de aantallen en/of anatomische verdeling van de adoptief overgedragen MC's verschillen van die van de overeenkomstige inheemse MC-populaties bij wilde muizen12,23,53,54. MC-deficiënte muizen die i.p. of i.d. met BMCMCs zijn geïmgrafeerd, kunnen ongeveer dezelfde aantallen en distributie van MC's hebben als de inheemse MC-populatie bij wilde muizen, in de peritoneale holte en mesenterie en in de dermis, respectievelijk wanneer beoordeeld 4 tot 8 weken na MC-overdracht12,23. Intraveneuze overdracht van BMCMC's leidt niet tot normale MC-aantallen en/of distributie in de meeste weefsels. Er worden bijvoorbeeld geen of zeer weinig MC's gevonden in de huid van dergelijke i.v.-engrafted 'mast cell knock-in' muizen. Na 4-28 weken na i.v. injectie van BMCMCs in MC-deficiënte muizen, zijn de aantallen MC's in de luchtpijp aanzienlijk lager dan die bij de overeenkomstige wilde typemuizen. Daarentegen zijn de aantallen MC's in de periferie van de long meestal groter dan die in de overeenkomstige wilde muizen12,23,53,55. I.v. overdracht van BMCMC's resulteert ook in hoge niveaus van MC's in de milt, terwijl zeer weinig inheemse MC's meestal in dit orgaan worden aangetroffen bij wilde muizen23,56. Belangrijk is dat eerdere rapporten hebben aangetoond dat i.v. injectie van BMCMCs in MC-deficiënte muizen niet leidt tot engraftment van de MC-populaties op specifieke anatomische plaatsen zoals het ruggenmerg, lymfeklieren of hart54,57. Verschillende groepen hebben ook opgemerkt dat een dergelijke i.v. engraftment niet resulteert in engraftment van de intestinale mucosale MC (MMC) populatie23,58-60. Dergelijke verschillen in MC-nummers en/of distributie van adoptief overgedragen MC 's ten opzichte van native MC 's moeten in aanmerking worden genomen bij de interpretatie van gegevens die zijn verkregen met behulp van het MC ' mastcell knock-in' model9.

Er bestaan verschillende stammen van MC-deficiënte muizen, en het is belangrijk om te kiezen welke men in een bepaald project wil gebruiken. c-kit mutant MC-deficiënte muizen, zoals KitW/W-v of KitW-sh/W-sh muizen, worden traditioneel gebruikt door veel onderzoekers. Dergelijke muizen lijden echter aan veelc-kit-gerelateerdefenotypische afwijkingen naast hun diepgaande MC-deficiëntie (Tabel 1). In de afgelopen jaren zijn verschillende muizenstammen metc-kit-onafhankelijke constitutieve MC-deficiëntie gemeld24-26. Sommige van deze muizen vertonen naast hun MC-deficiëntie ook andere fenotypische afwijkingen (tabel 1), en er kunnen ook aanvullende afwijkingen worden ontdekt omdat het fenotype van deze nieuw beschreven stammen nog steeds wordt onderzocht. Al deze muizen en enkele extra nieuwe soorten MC-deficiënte muizen zijn onlangs in detail beoordeeld9,10,13.

Gezien de beperkingen van elk van de MC-deficiënte stammen die momenteel beschikbaar zijn, raden we aan om hypothesen over de MC-functie te testen met behulp van meer dan één model MC-deficiëntie9. In ons laboratorium voeren we over het algemeen proefexperimenten uit in KitW-sh/W-sh en Cpa3-Cre; Mcl-1fl/fl muizen. Als we concordante resultaten verkrijgen bij beide soorten MC-deficiënte muizen, gaan we vervolgens over tot engraftment-experimenten om de rol van MC's vast te stellen en de potentiële rollen van bepaalde MC-afgeleide producten te beoordelen. Ten slotte moet worden opgemerkt dat verschillende stammen die een induceerbare uitputting van MC's of Cre recombinase-gemedieerde deletie van "gevlokte" genen in MC's mogelijk maken, onlangs ook25.49,61zijn beschreven . Deze stammen zijn elders in detail beoordeeld9,10,13 en vertegenwoordigen veelbelovende alternatieve - of complementaire - benaderingen om MC-functies in vivote bestuderen .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

N.G. is de ontvanger van beurzen van de Franse "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" en de Philipp Foundation; R.S. wordt ondersteund door de Lucile Packard Foundation for Children's Health en het Stanford NIH/NCRR CTSA award nummer UL1 RR025744; P.S. wordt ondersteund door een Max Kade Fellowship van de Max Kade Foundation en de Austrian Academy of Sciences en een Schroedinger Fellowship van het Austrian Science Fund (FWF): J3399-B21; S.J.G. erkent steun van National Institutes of Health grants U19 AI104209, NS 080062 en van Tobacco-Related Disease Research Program aan de Universiteit van Californië; L.L.R. erkent steun van de Arthritis National Research Foundation (ANRF) en National Institutes of Health grant K99AI110645.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Antibiotic-Antimycotic Solution Corning cellgro 30-004-Cl
3 ml Syringe Falcon 309656
35 mm x 10 mm Dish Corning cellgro 430588
5 ml Polystyrene Round Bottom Tube Falcon 352058
Acetic Acid Glacial Fisher Scientific A35-500
Alcian Blue 8GX Rowley Biochemical Danver 33864-99-2
Allegra 6R Centrifuge Beckman
Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified eBioscience 14-0161-81
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M7522
BD 1 ml TB Syringe BD Syringe 309659
BD 22 G x 1 (0.7 mm x 25 mm) Needles BD Precision Glide Needle 205155
BD 25 G 5/8 Needles BD Syringe 305122
BD 30 G x 1/2 Needles BD Precision Glide 305106
Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube Falcon 352097
Chloroform Fisher Scientific C298-500
Cytoseal 60 Mounting Medium Richard-Allan Scientific 8310-4
Cytospin3 Shandon NA
DakoCytomation pen Dako S2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x Corning cellgro 15-013-CM
Ethanol Sigma Aldrich E 7023-500ml
Fetal Bovine Serum Heat Inactivated Sigma Aldrich F4135-500ml
FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control eBioscience 14-4031-82
Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) eBioscience 11-1171-82
Formaldehyde Fisher Scientific F79-500
Giemsa Stain Modified Sigma Aldrich GS-1L
Isothesia Henry Schein Animal Health 29405
May-Grunwald Stain Sigma Aldrich MG-1L
Multiwell 6 well plates Falcon 35 3046
Olympus BX60 Microscope Olympus NA
Paraplast Plus Tissue Embedding Medium Fisher Brand 23-021-400
PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control eBioscience 12-4888-81
Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x Corning cellgro 21-040-CV
Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1) eBioscience 12-5898-82
Propidium Iodide Staining Solution eBioscience 00-6990-50
Recombinant Mouse IL-3 Peprotech 213-13
Safranin-o Certified Sigma Aldrich S8884
Tissue culture flasks T25 25 cm2 Beckton Dickinson 353109
Tissue culture flasks T75 75 cm2 Beckton Dickinson 353110
Toluidine Blue 1% Aqueous LabChem-Inc LC26165-2
Recombinant Mouse SCF Peprotech 250-03

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as 'tunable' effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models - Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. 'Sash' mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

Tags

Immunologie en infectie c-kit,stamcelfactor FcεRI immunoglobuline E muismodel adoptieoverdracht immunologie allergie
Het analyseren van de functies van mastcellen <em>in Vivo</em> met behulp van ' Mast<em>Cell Knock-in</em>' Muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, … More

Gaudenzio, N., Sibilano, R., Starkl, P., Tsai, M., Galli, S. J., Reber, L. L. Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice. J. Vis. Exp. (99), e52753, doi:10.3791/52753 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter