Introduction
De zebravis is een gevestigde gewervelde modelorganisme diverse aspecten van de ontwikkeling, fysiologie, ziekte en regeneratie te bestuderen. Met de groeiende goedkeuring van de zebravis als model voor post-embryonale biologische processen, experimentele instrumenten voor induceerbare, weefselspecifieke manipulatie van genexpressie of signaalwegen zijn steeds belangrijker geworden. Vooral studies naar orgel en aanhangsel regeneratie bij volwassen zebravis hebben geleden onder een gebrek aan tools voor dissectie van de ruimte-tijd eisen van signaalroutes tijdens deze regeneratieve processen.
Momenteel zijn drie verschillende systemen gebruikt om conditionele, weefselspecifieke genexpressie in regenereren organen van volwassen zebravissen bereiken: het Cre-lox-systeem, mozaïek expressie van heat-shock induceerbare transgenen middels transposon gemedieerde somatische transgenese en de Teton systeem 1 -3. TETON verwijst naar een variant van een tetracycline-contgerolde transcriptionele activeringssysteem, waarbij expressie wordt geactiveerd in aanwezigheid van het antibioticum tetracycline of een derivaat, bijvoorbeeld doxycycline. De Cre-lox-systeem, zoals dat tot nu toe gebruikt bij volwassen vis, gebaseerd op een Tamoxifen-gecontroleerde Cre recombinase (CreERT2), waarvan de expressie ruimtelijk beperkt weefselspecifieke regulerende elementen. Cre aangedreven verwijdering van een STOP cassette vergemakkelijkt expressie van het gen van belang aangestuurd door een promoter die actief is in alle celtypes 1 moet zijn. Transposon gemedieerde creëren van mosaically expressie somatische transgenen verschaft een systeem voor induceerbare transgenexpressie in afzonderlijke cellijnen. Injectie van zebravisembryo's met een Tol2 transposon die een gen van belang onder de transcriptionele controle van een heat shock promoter resulteert in chimere individuen kenmerkend die het transgen slechts in discrete cellijnen van een regenererende orgaan 2. Hoewel beide systemen zorgen voor voorwaardelijke tissue-spefieke genexpressie, het Cre-lox systeem is niet omkeerbaar en de strategie met transposon gebaseerde klonen etikettering lijdt zijn stochastische natuur. Zo hebben wij en anderen recent aangepast transgeen Teton voor toepassing in de zebravis, waarbij tijd en ruimte-gestuurde genexpressie die bovendien instelbaar en omkeerbaar 3-5 vergemakkelijken.
De Teton systeem hier gebruikt omvat een transgene driver lijn (TetActivator) waarin een Doxycycline (DOX) -induceerbare transcriptie activator (verbeterde omgekeerde tetracycline transactivator, irtTA, korte TETA) is onder controle van de weefsel-specifieke genomische regulatoire sequenties. Ten tweede vereist een transgene lijn responder (TetResponder) dat een gen van belang onder transcriptionele controle van de tetracycline operator herbergt (Tet responselement, Tetre) (figuur 1A). Zo is het gebruik van specifieke combinaties van TetActivator en TetResponder lijnen maakt voorwaardelijke weefsel-specific manipulatie van genexpressie.
We hebben onlangs gebruik gemaakt van de Teton systeem om sonde voor weefsel-specifieke functies van Wnt / beta-catenine signalering in de volwassen regenereren zebravis staartvin 3. In het protocol hier geschetste beschrijven we een workflow voor de set-up en het gebruik van de Teton systeem in de zebravis, met name voor studies fin regeneratie. Deze bevat gedetailleerde instructies over hoe stabiele transgene TetActivator en TetResponder lijnen te genereren en een protocol voor transgene inductie bij embryo's en volwassen zebravissen. Verder beschrijven we technieken voor de controle van weefselspecifieke genexpressie in de vin regenereren, omvattende een protocol voor de bereiding van cryosecties van volwassen zebravis vinnen. Daarnaast bespreken we overwegingen voor het ontwerp van de TetActivator transgen, de keuze van een transgenese methode en detectie van TetResponder expressie. Vandaar dat het algemene doel van dit protocol is om te dienen als een blauwdrukvoor het opzetten van een functioneel Teton systeem zebravis voorwaardelijke weefselspecifieke genexpressie, die kunnen worden toegepast om een weefsel van belang te bereiken.
We hebben een TetActivator vector waardoor I-SceI of Tol2-bemiddelde generatie van stabiele TetActivator lijnen met behulp van korte genomische regulerende sequenties gemaakt (enhancer fragmenten; Weidinger lab plasmide databank geen 1247;. Figuur 1B). Dit construct bevat een TetActivator cassette bestaande uit het M2 mutant variant van de reverse Tet-repressor gefuseerd met het herpes simplex virus VP16 transactivatiedomein-derivaat 3F [irtTAM2 (3F)]. Expressie van het TetActivator (TETA) eenvoudig worden gecontroleerd omdat het gecoëxpresseerde de fluorofoor AmCyan van het open leesraam daarvan; Een P2A peptide medieert ribosomale skipping, wat moet leiden tot de productie van TETA en AmCyan als afzonderlijke eiwitten in een 1: 1 verhouding van 5,6. Het construct bevat ook een poylinker 5 'van het TetActivator cassette genomische insertie van regulerende sequenties van belang onder toepassing van gebruikelijke werkwijzen klonering vergemakkelijken.
Die kan worden gerecombineerd in een bacterieel kunstmatig chromosoom (BAC) die een grote genomische regio (; Daarnaast hebben we een construct bestaande uit de bovenbeschreven TetActivator cassette plus een kanamycine selectiecassette (. Figuur 1C Weidinger lab plasmide gegevensbestand geen 1180) gecreëerd gewoonlijk in de startcodon van een gen waarvan de expressie patroon moet worden nagebootst door het transgen). Beide constructies zijn verkrijgbaar bij de Weidinger lab op verzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie van transgene TetActivator Fish Lines
- Generatie van TetActivator construct
- Kloon regulerende sequenties van belang stroomopwaarts van de TetActivator cassette vector # 1247 onder toepassing van standaardtechnieken. Of gebruik recombinatietechnieken een BAC, waarbij de TetActivator cassette (vector # 1180) in het eerste exon van het doelwitgen formule plaatst, en waarbij de Tol2 geïnverteerde repeats worden in de BAC ruggengraat (voor een gedetailleerde recombineering protocol zien 7,8).
- Bereid toxine-vrij plasmide DNA of BAC DNA-preparaten met behulp van commercieel verkrijgbare kits.
- Generatie van transgene TetActivator vis lijnen
- Voer micro-injectie van het construct TetActivator volgens standaardprocedures 9.
- Injecteer 25-50 pg van het plasmide DNA of tot 250 pg BAC DNA in een cel-embryo's met afgetopte sense RNA codeert voor tol2 transposase voor transposon-gemedieerde transgenese, of met I-Sce I eiwit voor I-SceI gemedieerde transgenese.
OPMERKING: Overwegingen bij de keuze van de transgenese methode kan worden gevonden in de sectie discussie.
OPMERKING: Injecteer voorkeur in het cytoplasma, niet de dooier, aangezien efficiency van transgenese kan afnemen wanneer het DNA niet in het cytoplasma wordt afgegeven.
- Injecteer 25-50 pg van het plasmide DNA of tot 250 pg BAC DNA in een cel-embryo's met afgetopte sense RNA codeert voor tol2 transposase voor transposon-gemedieerde transgenese, of met I-Sce I eiwit voor I-SceI gemedieerde transgenese.
- Raise geïnjecteerd G0 embryo naar volwassenheid. Optioneel scherm G0 embryo's voor AmCyan fluorescentie en bij voorkeur groeien embryo's die het gewenste expressiepatroon. Dit kan de snelheid van kiemlijn transmissie, in het bijzonder voor Tol2 gemedieerde transgenese verhogen.
- Evalueer succesvolle kiemlijn integratie door uitkruising individuele G0 fish wildtype vis en uiterlijk AmCyan fluorescentie het verwachte patroon expressie in F1 embryo of larven met een fluorescerende stereomicroscoop (voorbeeld is getoond in figuur 1D).
- Raise fluorescentie-positiefF1 embryo naar volwassenheid en paren ze met wild-type vis stabiele F2 transgene vis te verkrijgen.
- Heffen en te karakteriseren ten minste 3 verschillende sublijnen afkomstig van verschillende G0 oprichter vis, aangezien individuele lijnen kunnen verschillen in expressie niveaus, expressie patroon, het vermogen om TetResponder lijnen, leakiness opwekken, en hun gevoeligheid voor zwijgen.
OPMERKING: Veel transgenen die robuust zijn uitgedrukt in embryo's geheel of gedeeltelijk zwijgen in een laat stadium larven of volwassen vissen. Wanneer dus lijnen zijn bedoeld voor gebruik bij volwassen vis, kenmerkend verschillende onafhankelijke lijnen hun TetActivator expressie en functie tijdens de volwassenheid.
LET OP: We hebben een panel van TetActivator lijnen voor de weefsel-specifieke expressie van de TetActivator in zowel embryo's en volwassen vis, die in tabel 1 worden vermeld gegenereerd Deze regels zijn verkrijgbaar bij de Weidinger lab op aanvraag..
- Voer micro-injectie van het construct TetActivator volgens standaardprocedures 9.
2. Generatie van transgene TetResponder Fish Lines
LET OP: We hebben een TetResponder constructie waardoor I-SceI of Tol2-bemiddelde generatie van stabiele TetResponder lijnen, die beschikbaar zijn vanaf de Weidinger lab op verzoek is (. Figuur 1E Weidinger lab plasmide databank geen 1444) gegenereerd. Dit construct bevat een Tetracycline operator, gevolgd door een polylinkergebied de insertie van coderende sequenties (CDS) van een gen van interesse en de YFP-derivaat YPet coderende sequentie te vergemakkelijken. Aldus wordt het construct ontworpen Teta-gemedieerde expressie van een C-terminale fusie van het eiwit van belang met YPet. Indien expressie van een gelabeld fusie-eiwit te vermijden, kan een P2A of T2A peptide worden ingebracht met het gen van belang CDS, die co-expressie van het eiwit van interesse en YPet vergemakkelijkt als afzonderlijke polypeptiden 6,10.
- Generatie van TetResponder construct
- Kloon CDS van het betreffende gen 3 'van de Tetracycline operatoren 5 'van het YPet CDS volgens standaardprocedures. Zorg ervoor dat het stopcodon is verwijderd van het gen van belang CDS.
- Bereid toxine-vrij plasmide DNA-preparaten met behulp van commercieel verkrijgbare kits.
- Generatie van transgene TetResponder vis lijnen
- Voer microinjectie van TetResponder construct volgens standaardprocedures 9.
- Injecteer 25-50 pg van het plasmide DNA in het cytoplasma van een cel-embryo's met afgetopte sense RNA codeert voor tol2 transposase voor transposon gemedieerde transgenese of I-Sce I enzym-meganuclease gesteunde transgenese.
OPMERKING: Overwegingen bij de keuze van de transgenese methode kan worden gevonden in de sectie discussie.
OPMERKING: Injecteer voorkeur in het cytoplasma, niet de dooier, aangezien efficiency van transgenese kan afnemen wanneer het DNA niet in het cytoplasma wordt afgegeven.
- Injecteer 25-50 pg van het plasmide DNA in het cytoplasma van een cel-embryo's met afgetopte sense RNA codeert voor tol2 transposase voor transposon gemedieerde transgenese of I-Sce I enzym-meganuclease gesteunde transgenese.
- Raise geïnjecteerd G0 embryo's naar eendulthood.
- Beoordelen succesvolle kiemlijn integratie en induceerbaarheid van het transgen door paring individuele G0 vis met een eerder vastgestelde TetActivator lijn gevolgd door Doxycycline behandeling van F1 embryo's of F1 larven.
OPMERKING: Meestal gebruiken we een ubiquitine-promoter gedreven TetActivator lijn (ubiquitine: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2, korte ubiquitine: teta AmCyan 3) voor het screenen op functionele TetResponder dragers, zoals deze lijn rijdt vrij alomtegenwoordige expressie in embryo's en volwassen vis en is dus zeer geschikt voor TetResponder induceerbaarheid beoordelen in alle weefsels van belang. Deze lijn is beschikbaar vanaf de Weidinger lab op verzoek. - Verzamel embryo's van elke schakeling in een aparte 10 cm petrischaal met E3 embryo medium (zie Materialen tabel) en incubeer schotels bij 28,5 ° C.
- Plaats G0 vis die embryo's in de individuele genummerde tanks gaf (kweekbakken; zie Materials tabel) tot embryo scherm geweested. Dit zorgt voor herstel van de G0 vis die kiemlijn transmissie van het transgen te tonen.
- Als slechts de helft van de embryo's wordt verwacht dat de TetActivator transgen (bij een heterozygote TetActivator drager werd gekruist met een TetResponder grondlegger vis) dragen, selecteren op embryo bevattende TetActivator transgen door verschijnen van AmCyan fluorescentie op geschikte ontwikkelingsstadium.
- Opwekken TetActivator transcriptie-activiteit door het behandelen van embryo's met Doxycycline (DOX), zoals beschreven in paragraaf 2.3.
- Screen F1 embryo's voor opkomst van YPet fluorescentie. Liever lijnen (G0 vis), die homogeen YPet uitdrukking te produceren, dat is embryo's in de koppeling moet kleine mosaicism weer binnen de verwachte uitdrukking domein en weinig variatie tussen individuele embryo's. Zie pijlpunten in figuur 1F en figuur 1G voor representatieve voorbeelden.
- Mate G0 vis verzenden van een induceerbare TetResponder transgeen geïdentificeerdstap 2.2.8 met wild-type vis en alle F1 embryo's te verhogen naar volwassenheid.
- Identificeer volwassen F1 transgene vis, hetzij door middel van PCR-gebaseerde genotypering (zie sectie of door het kruisen van individuele F1 vis naar een TetActivator lijn gevolgd door DOX behandeling van F2 embryo's en opkomst van YPet fluorescentie (zie paragraaf 2.5).
- Opzetten en karakteriseren ten minste 3 verschillende TetResponder sublijnen afgeleid van verschillende G0 oprichter vis, omdat induceerbaarheid kunnen verschillen in individuele lijnen. In het bijzonder haalbaar expressie niveaus en of kan de responder worden geactiveerd in alle celtypen kunnen variëren. Daarnaast zal de gevoeligheid voor silencing verschillen lijnen. In nog andere gevallen kan het de voorkeur verdienen lijnen die slechts matige expressieniveaus van het eiwit van interesse mediëren, met name indien lekkende expressie bracht in combinatie met een TetActivator lijn in afwezigheid van Doxycycline wordt verwacht ontwikkelingsstoornissen of toxiciteit te selecteren.
OPMERKING: TetResponder lijnen die zijn robuust induceerbaar in embryo's kunnen geheel of gedeeltelijk tot zwijgen worden gebracht in een laat stadium larven of volwassen vissen. Wanneer dus lijnen zijn bedoeld voor gebruik bij volwassen vis, verschillende onafhankelijke lijnen worden gekarakteriseerd voor induceerbaarheid bij volwassenen. Als inductie van het gen van belang is compatibel met de verdere ontwikkeling, is het nuttig gebleken om dubbele transgene embryo's (TetActivator x TetResponder) te creëren, om Indiase overheid expressie induceren in embryo's en om te selecteren en te verhogen alleen de personen die het meest robuuste en minst mozaïek inductie. - Te onderhouden en te propageren opgericht TetResponder lijnen, genotype volwassen vissen zoals beschreven in paragraaf 2.5).
- Voer microinjectie van TetResponder construct volgens standaardprocedures 9.
- Doxycycline behandeling van embryo
- Bereid 2,000x Doxycycline (DOX) voorraden. Los DOX in 50% EtOH met een concentratie van 50 mg / ml (97 mM) bereiken. Store DOX voorraden beschermd tegen licht bij -20 ° C.
- Giet de meerderheid van de E3 medium uit embryo's en te vervangen doorE3 embryo medium dat DOX bij een uiteindelijke concentratie van 25 ug / ml DOX (2,5 pl 2,000x DOX voorraad per 50 ml E3). Dechorionation is niet vereist.
- Terug embryo 28,5 ° C gedurende ten minste 6 uur voor de beoordeling van expressie van het gecodeerde gen van belang door verschijnen van YPet fluorescentie.
- Beoordelen leakiness van de TetActivator / TetResponder combinatie door het behandelen van embryo's met slechts EtOH oplosmiddel.
Opmerking: In situ hybridisatie (ISH) of RT-PCR om de TetResponder mRNA te detecteren kunnen worden gebruikt als gevoeliger maten leakiness dan fluorescentie van de gelabelde van belang zijnde gen. De omvang van leakiness zal afhangen van de specifieke TetActivator / TetResponder combinatieschema en kan ook variëren tussen weefsels en ontwikkelingsstadia.
- Anesthesie van volwassen zebravis
- Bereid 10 cm diameter Petrischaal of klein bekerglas gevuld met vis systeem water dat 1 mg / ml tricaïne (Ethyl 3-aminobenzoaat methanesulfonate, MS-222).
- Transfer vis container met verdoving en wacht tot het niveau 4 van anesthesie bereikt, zoals aangegeven door volledig verlies van evenwicht (vis ligt op zijn kant), geen bewegingen en geen reactie op het aanraken van 11.
- Breng voorzichtig vis met een pincet of een lepel op een glasplaatje, deksel van een plastic petrischaaltje of-agarose gecoate petrischaaltje uitvoeren fin amputatie of imaging (zie paragraaf 3.2).
- Terugkeren vis een houder die een groot volume van verse vis systeemwater en gaten houden. Als kieuw bewegingen niet binnen 3 minuten doen hervatten, te helpen door te blazen water over de kieuwen met behulp van een plastic overdracht pipet.
- PCR-gebaseerde genotypering van TetResponder vis
- Voer een gedeeltelijke amputatie van de staartvin 12. Plaats de vis in individuele, genummerde tanks (kweekbakken; zie Materials tabel). Dit zorgt voor het herstel van transgene vis na succesvolle genotypering.
- Transfer fin weefsels individuele putjes van een 96-well PCR plaat voorgevuld met 20 ul DNase-vrij water voor isolatie van genomisch DNA 13.
- Voeg 120 ul 1 M NaOH aan elk putje en incubeer de monsters gedurende 20 minuten bij 95 ° C met een thermocycler.
- Chill monsters 4 ° C, voeg 14 ul van 1 M Tris-HCl (pH 8,0) aan elk putje en kort vortex samples. Centrifuge monsters gedurende 5 min bij 16.000 xg om celresten te pelleteren. WINKEL genomisch DNA bij 4 ° C totdat het nodig is.
- Ontwerp primers specifiek amplificeren van een fragment van het TetResponder transgen. Gebruik 2 pl geïsoleerde DNA in een standaard PCR reactie en PCR producten geanalyseerd op een agarosegel.
3. Weefsel-specifieke inductie van Transgene Expressie in de Adult Regenerating zebravis Tail Fin
- Oprichting van TetActivator; TetResponder dubbel transgene vis
- Mate TetActivator dragers met TetResponder carriers.
- Selecteer embryo's die het TetActivator transgen in een ontwikkelingsfase, wanneer de regulerende elementen besturen van de TetActivator cassette actief zijn. Transgene embryo's kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door AmCyan verschijnen van fluorescentie met een stereo-fluorescentiemicroscoop.
OPMERKING: TetActivator transgene-positieve vis kunnen als alternatief tijdens de volwassenheid worden geïdentificeerd door beeldvorming van verdoofde vissen, bijv. na amputatie van de staartvin en de opkomst van AmCyan fluorescentie in het regenereren. - Raise geselecteerde embryo's naar volwassenheid.
- Identificeer dubbele transgene volwassen vis (vis de TetResponder dragen naast de TetActivator) door PCR-gebaseerde genotypering of (bij voorkeur) door hun vermogen om expressie van de TetResponder induceren in het weefsel van belang. Een protocol voor TetResponder inductie en detectie in de regenererende staartvin wordt beschreven in paragraaf 2.3 en hoofdstuk 4.
OPMERKING: Als voorbijgaande TetResponder expressie is compatibelmet verdere embryonale en larvale ontwikkeling, is het nuttig om dubbele transgene embryo's met TetActivator en TetResponder transgenen na DOX behandeling; tijdens de embryonale ontwikkeling als hierboven beschreven (punt 2.3, figuur 1 H). Dubbele positieve embryo zal AmCyan en YPet fluorescentie tonen. Raise positieve embryo's naar volwassenheid.
- Amputatie van zebravis staartvinnen en inductie van transgenexpressie in de regenererende fin
- Voer een gedeeltelijke amputatie van de staartvin op verdoofd vis (zie paragraaf 2.4) 12. Behandel vis hetzij onmiddellijk met DOX of ze terug naar de vis huisvestingssysteem.
- Bereid kweekbak (figuur 2A; zie Materialen tabel) gevuld met 1 liter vis systeemwater dat 25 ug / ml DOX (voeg 500 ul van 2,000x 50 mg / ml voorraad aan 1 L vis systeemwater).
OPMERKING: Inductie van transgenexpressie onmiddellijk na amputatie maakt alssessment van effecten op vroege gebeurtenissen tijdens de regeneratie, terwijl inductie bij 3 dagen na amputatie (3 dpa) worden toegepast om transgene expressie of functie getest in de regeneratieve groei. - Transfer tot 10 eerder geamputeerd, dubbele transgene vis in de doos fokken en nauwe doos met een deksel zodanig dat de vis niet kan ontsnappen (Figuur 2A).
- Plaats fokken dozen in het donker om stress te verminderen. We meestal plaats de dozen in een 28,5 ° C lucht incubator constante duisternis en temperatuur te verzekeren.
- Behandel negatieve controle dubbele transgene vis met EtOH alleen (250 ul per 1L vis systeem water).
OPMERKING: Single transgene of wildtype vis behandeld met DOX kan worden gebruikt als extra negatieve controle, hoewel we nooit nadelige effecten van DOX gebruikte doses here on fin regeneratie hebben waargenomen. - Verdoven vis zoals beschreven in paragraaf 2.4 en de overdracht van vis met behulp van een pincet of een lepel op een nat-agarose gecoate petri gerecht. Zorgvuldig verspreid de staartvin met een pincet.
- Screen vis voor verschijning van YPet binnen het regenereren met behulp van een fluorescerende stereo-microscoop (Figuur 2B).
OPMERKING: Meestal kan-TetResponder gedreven fluorescentie robuust worden waargenomen na 6 uur van DOX behandeling. Echter, raden wij u aan de dynamiek van TetResponder uitdrukking kenmerkend voor elke regel gegenereerd. - Terug vis aan de vis huisvestingssysteem aan TetResponder transgene inductie beëindigen of voortzetten behandelingen.
LET OP: Voor behandelingen> 24 uur (op lange termijn behandelingen) is het essentieel om water te wisselen en grondig het fokken dozen dagelijks reinigen. - Tijdens een langdurige behandelingen, diervoeder vis om de 2-3 dagen door de overdracht van vis in een schone container met verse vis systeem water alvorens terug te keren ze naar kweekboxen na het voeden.
4. Karakterisering van TetResponder Expressie in Fin Regenereert
t ">. OPMERKING: We meestal controleren weefsel-specifieke genexpressie in de regenererende staartvin met fluorescerende beeldvorming van cryosecties 3 dpa Op dit tijdstip de verschillende weefsel compartimenten van een wedergeboren hebben gevormd en kan duidelijk worden geïdentificeerd op tissue-secties, en cryosectioning is eenvoudiger dan in latere stadia van regeneratie. Figuur 2C toont de weefsel domeinen die kunnen worden onderscheiden in het regenereren en wordt een aantal moleculaire merkers voor deze domeinen. Het volgende protocol beschrijft de bereiding van langs- of dwarsrichting vriescoupes voor rechtstreekse beeldvormende of immunologische .- Cryosectioning van volwassen staartvinnen
- Behandel vis waarvan staartvinnen werden geamputeerd van 2 tot 3 dpa dpa met DOX, zoals beschreven in paragraaf 3.2
- Verdoven vis zoals beschreven in paragraaf 2.4
- Gebruik een lepel of een pincet om voorzichtig te vissen over te dragen op een deksel van een plastic petrischaal.
- Re-amputeren de vin wedergeboren op ongeveer 4-5 benige segments proximale naar de eerste amputatie vliegtuig met behulp van een scalpel en de terugkeer van de vis om verse vis systeem water.
- Zorgvuldig overgang regenereert een petrischaaltje (bijvoorbeeld 35 mm) bevattende 4% (w / v) paraformaldehyde (PFA) in 1x fosfaat-gebufferde saline (PBS; zie Materialen tabel) met behulp van fijne pincet. Laat de wedergeboren, maar slechts de stomp deel van het weefsel niet aanraken.
- Plaats weefsel plat op de petrischaal bodem en lossen O / N bij 4 ° C.
- Wash regenereert tweemaal in 1x PBS met 0,1% Tween (PBT) PFA te verwijderen en incubeer regenereert o / n bij 4 ° C in 0,5 M EDTA-PBS (pH 7,5) met botmatrix ontkalken.
- Incubeer regenereert bij kamertemperatuur in 10% sucrose-PBS, 20% sucrose-PBS, 30% sucrose-PBS en 30% sucrose-PBS: tissue freezing medium met een 1: 1 verhouding (TFM; zie Materialen tabel) gedurende 30 minuten elk. Vervolgens incuberen vinnen bij 4 ° C gedurende> 2 uur in weefselkweek invriesmedium.
- Plaats cryomolds op een microscoop glijbaan en vul dem met tissue freezing medium. Voorkomen dat er luchtbellen.
- Transfer regenereert in cryomolds en oriënteren weefsel adequaat op de lengte of dwarsdoorsneden van fin regenereert (figuur 2D) te verkrijgen. Zorg ervoor dat wedergeboren is recht, dat vergemakkelijkt het snijden.
- Transfer cryomolds alsmede objectglaasje aan een metalen rooster geplaatst op een bed van droog ijs om het vriesproces (figuur 2D) te starten.
- Zodra het weefsel vriesmedium vast geworden plaatst cryomold op bank laten zitten bij kamertemperatuur gedurende enkele minuten zodat het weefsel vriesmedium ontdooit de plastic-medium interface.
- Gebruik een pen of iets dergelijks om de bevroren blok duwen van de cryomold. Bewaren cryoblocks in een doos bij -80 ° C totdat het weefsel snijden.
- Bereid 10-14 micrometer dik cryosecties met een Cryo-microtoom en het verzamelen van onderdelen op adhesie objectglaasjes (zie Materials tabel). WINKEL slides bij -20 ° C totdat NEeded.
- Karakterisering van TetResponder uitdrukking op fin secties gebaseerd op YPet fluorescentie
- Behandel vin secties gedurende 30 minuten met 100% MeOH gekoeld tot -20 ° C om hechting aan het objectglaasje gevolgd door tweemaal wassen bij kamertemperatuur in PBT en 1 wassen in PBS, 5 minuten elk verbeteren.
- Visualiseren kernen door incubatie secties 10 min in 4 ', 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) in PBS (1: 5000) gevolgd door twee wasbeurten 10 minuten elk in PBS.
- Mount secties in 75% glycerol-PBS of commercieel beschikbaar antifade mounts, en dek af met een deksel slide.
- Afbeelding YPet en AmCyan fluorescentie onder een confocale of wide-field fluorescentiemicroscoop (figuur 1E).
Opmerking eenduidige identificatie van celtypes tot expressie YPet, immunofluorescentie of immunohistochemie met antilichamen tegen celtype specifieke antigenen samen met anti-GFP antilichamen (die reageren met YPet, maar niet AmCyan) vergemakkelijkt kan worden uitgevoerd. Alternatief, om detectie van zwakke YPet expressie te vergemakkelijken, kan RNA in situ hybridisatie tegen RNA YPet worden uitgevoerd hetzij geheel gemonteerde schoepen of paraffinecoupes vinnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een functioneel Teton voor induceerbare weefselspecifieke genexpressie, transgene TetActivator en TetResponder lijnen vast te worden gegenereerd (Figuur 1A). Dit wordt bereikt door microinjecting TetActivator (Figuur 1B - C) of TetResponder (figuur 1E) constructen in vroege zebravisembryo's en daaropvolgende kiemlijn integratie. Functionele TetActivator constructen kunnen ofwel worden gegenereerd door klonering van korte regulerende sequenties (enhancer elementen) stroomopwaarts van de TetActivator cassette (figuur 1B), of door het recombineren TetActivator cassette in een BAC met regelelementen van het gen van belang (figuur 1C). Kiemlijn integratie van de TetActivator construct kan worden beoordeeld door uitkruising individuele geïnjecteerd G0 vis en het uiterlijk van AmCyan fluorescentie in F1 embryo's in de verwachte expressiepatroon (figuur 1D). Kiembaan integrantsoen en functionaliteit van de TetResponder transgen kan worden bepaald door kruising afzonderlijke G0 geïnjecteerd fish vaste TetActivator vis (hier ubiquitine: teta AmCyan), gevolgd door behandeling met DOX en het uiterlijk van YFP / YPet fluorescentie (Figuur 1F). Vis die sterk en homogeen YFP / YPet expressie voorkeur moet worden gegeven om een stabiele TetResponder lijn (figuur 1G) vast te stellen. Na gevestigde stabiele TetActivator en TetResponder vis lijnen, specifieke TetActivator / TetResponder combinaties kunnen worden gegenereerd door het kruisen. Dragers van TetActiator en TetResponder transgenen kunnen worden geïdentificeerd tijdens de embryogenese volgende DOX behandeling einde opkomst van YFP / Ypet in het ontwikkelingsstadium van de TetActivator actief is (Figuur 1H). U kunt dubbele transgene vis worden geïdentificeerd na DOX behandeling en TetResponder transgene inductie in de regenererende staartvin (Figuur 2A - B).
< p class = "jove_content"> We routinematig gebruik van dit systeem om induceerbare, weefselspecifieke genexpressie in de regenererende zebravis staartvin bereiken. We controleren weefsel-specifieke TetResponder transgenexpressie door fluorescentie beeldvorming van cryosecties van 3 dpa fin regenereert, omdat de verschillende weefsel compartimenten van een wedergeboren duidelijk kan worden geïdentificeerd op tissue-secties in deze tijd-punt (figuur 2C). Lengte of de breedte fin regenereren secties worden verkregen door cryosectioning na cryoprotecting weefsel en inbedding fin regenereren adequaat (figuur 2D). Na snijden, kan TetResponder transgenexpressie (Ypet / YFP fluorescentie) worden afgebeeld met behulp van fluorescentie of confocale microscopie (Figuur 2E). Merk op dat de her4.3 promoter-driven TetActivator induceert TetResponder expressie in de proximale mediale blastema, terwijl het distale blastema (pijlpunt) en de epidermis (pijl) zijn verstoken van expressie. ove_content ">
Figuur 1: Generatie van transgene TetActivator en TetResponder lijnen. (A) Cartoon tonen strategie voor weefsel-specifieke induceerbare genexpressie met behulp van de Teton systeem. (B) Transgene TetActivator construeren (Weidinger lab plasmide databank no. 1247). Een polykoppelaar 5 'van de TetActivator irtTAM2 (3F) faciliteert cLoning van regulerende sequenties van belang. De AmCyan coderende sequentie wordt gescheiden van de TetActivator via een P2A 'self-splitsende' peptide. De cassette bevat ook een SV40 polyadenylatiesignaal, wordt geflankeerd door Tol2 transposon omgekeerde herhalingen en bevat één I-Sce I herkenningsplaats meganuclease. (C) TetActivator cassette voor BAC recombineering (Weidinger lab plasmide databank no. 1180). De cassette omvat Kanamycine gen voor selectie, die wordt aangedreven door een Gb3 prokaryote promoter. FRT plaatsen aan weerszijden van de kanamycineresistentiegen maken voor zijn Flp recombinase gemedieerde verwijdering na succesvolle integratie in de BAC. (D) Identificatie van G0 oprichter vis overbrengen van de her4.3: Teta AmCyan bouwen via hun kiem-lijn. Vervoerders worden geïdentificeerd via opkomst van AmCyan fluorescentie in sommige F1 embryo's (pijlpunten). (E) Transgene TetResponder construeren (Weidinger lab plasmide databank no. 1444).Dit bouwt bestaat uit een polylinker en YPet CDS onder controle van geoptimaliseerde Tet responselementen (Tetre-tight, Clontech) en beëindigd door de SV40 polyadenyleringssignaal. Het wordt geflankeerd door Tol2 transposon omgekeerde herhalingen en bevat één I-Sce I herkenningsplaats meganuclease. (F) Identificatie van G0 oprichter vis verzenden van een functionele TetResponder Tetre: Axin1-YFP te bouwen door middel van hun kiembaan. Vervoerders worden geïdentificeerd door kruising met een gevestigde TetActivator lijn (hier ubiquitine: Teta AmCyan) en inductie van YFP fluorescentie volgende DOX behandeling voor 6 uur (pijlpunten). (G) Sluit ofembryos weergegeven in (F) na in totaal 12 h DOX behandeling. Opmerking vrij alomtegenwoordige inductie van YFP fluorescentie. (H) Identificatie van dubbele transgene embryo's uitvoeren TetActivator (her4.3: Teta AmCyan) en TetResponder (Tetre: Axin1-YFP) transgenen (pijlpunten). Embryo weopnieuw behandeld met DOX gedurende 6 uur. (A - H) Schaal bar: 500 pm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Gebruik van het Teton voor weefselspecifieke genexpressie in de regenererende zebravis staartvin. (A) Breeding dozen gebruikt voor DOX behandeling van volwassen zebravissen. (B) Inductie van Tetre: Axin1-YFP TetResponder transgen door de her4.3: Teta AmCyan TetActivatorin de regenererende staartvin na 12 uur van DOX behandeling. Let op de afwezigheid van fluorescentie in de YFP-EtOH behandelde controlevissen. (C) Cartoon beeltenis van sommige van het weefsel compartimenten binnen een fin wedergeboren op 3 dpa in een longitudinale doorsnede. (D) Monstervoorbereiding voor cryosectioning. Fin regenereert worden in weefsel invriesmedium (TFM) -gevulde cryomolds, passend georiënteerd hetzij langs- en dwarsdoorsneden van het regeneraat verkrijgen, en overgebracht naar een metalen rooster bovenop droogijs totdat TFM is gestold. Snijden vliegtuig is aangegeven in het rood. Afkortingen: dist .: distale, prox .: proximale, vent .: ventrale, dors .: dorsale. (E) Confocale beeld van YFP fluorescentie in een lengtedoorsnede van een vin straal regeneraat afgeleid van vinnen getoond in (B). Merk op dat de her4.3: Teta AmCyan TetActivator lijn rijdt YFP inductie specifiek in de proximale-mediale blastema. YFPfluorescentie wordt niet gedetecteerd in verschillende compartimenten, waaronder de wond epidermis (pijl), en de meest distale gebied van het mesenchym (pijlpunt) (BC) schaalmaat: 500 pm; (E) Schaal bar:. 100 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| TetActivator lijn | Verwijzing | Regulerende elementen gebruikt | Hoofdzakelijk uitgedrukt |
| 7xTCF-Xla.Siam: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan | Wehner & Weidinger, ongepubliceerde | 7xTCF-Xla.Siam Wnt reporter 1 | Wnt-reagerende weefsels |
| myl7: irtTAM2 (3F) -p2a-mCherry | Haase & Weidinger, ongepubliceerde | myl7 (cmlc2) 2 | volwassen hartspiercellen |
| her4.3: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm6 | 3 | her4.3 4 | centraal zenuwstelsel |
| keratin4: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm5 | 3 | keratin4 5 | epidermis, in de volwassen fin zonder de basale laag |
| keratin18: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm4 | 3 | keratin18 6 | epidermis, in de volwassen fin uitsluitend in de basale laag |
| SP7: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm3 | 3 | SP7 / osx 7 | (Geëngageerde) osteoblasten |
| ubiquitine: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2 | 3 | ubiquitine 8 | (Vrij) alomtegenwoordig |
Tabel 1:. Beschikbare transgene TetActivator lijnen Deze tabel geeft transgene TetActivator lijnen voor weefsel-specifieke expressie van de TetActivator in zowel embryonale en volwassen vissen, die verkrijgbaar zijn bij de Weidinger lab op verzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De volwassen zebravis heeft een verbazingwekkende capaciteit om vele interne organen en appendages succes regenereren. Een goed begrip van de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn vereist weefselspecifieke analyse van genfuncties en signaalwegen. Towards dit, de Teton systeem biedt een efficiënt hulpmiddel voor spatiotemporeel gecontroleerde genexpressie in embryonale en volwassen zebravissen. De Teton systeem bouwt en methodologie in dit manuscript beschreven zijn met succes gebruikt in een recent onderzoek van ons laboratorium 3. De volgende bijkomende kwesties moeten worden overwogen bij de vaststelling van de Teton systeem:
TetActivator transgene ontwerp overwegingen
We hebben eerder aangetoond dat een induceerbare TetActivator bestaande uit het M2 mutant variant van de reverse Tet-repressor gefuseerd met het herpes simplex virus VP16 transactivatiedomein-derivaat 3F [irtTAM2 (3F), in korte Teta-M2] verleend efficiënter vormen, maar lage tonen, hoewel meetbaar leakiness, dat wil achtergrond inducerende activiteit in afwezigheid van doxycycline (DOX) 5. Daarom hebben we dually beschreven induceerbare systemen met fusies met een glucocorticoïde receptor (teta-GBD) of een domein van de ecdysonreceptor (teta-EcR) die lekkages 5 elimineren. Dus, als het systeem wordt gebruikt om toxische of zeer potent eiwitten (bijvoorbeeld oncogenen) expressie het gebruik van een tweevoudig induceerbare variant worden overwogen. Als alternatief, tijdens instelling van TetActivator en TetResponder lijnen verschillende lijnen produceren verschillende expressieniveaus kunnen worden geselecteerd en zwakkere inductoren bij leakiness gekozen probleem met sterk inducerende lijnen. TetActivator constructen die het Teta-GBD of Teta-EcR variant zijn verkrijgbaar bij de Weidinger lab op verzoek.
Transgenese methoden voor het genereren van transgene zebravis lijnen
TetResponder transgenexpressie analyse
Weefsel-specifieke TetResponder transgenexpressie bij volwassen vinnen detecteren we meestal gebruik van fluorescerende beeldvorming van cryosecties. In onze ervaring, is fluorescentie van fluorescerende eiwitten door de transgene geuit over de hele fixatio bewaarden en cryosectioning procedure en kunnen dus direct worden afgebeeld. Bijkomende methoden voor de detectie van TetResponder meningsuiting, die elders zijn beschreven, zijn: i) immunokleuring op secties, bij voorkeur tegen de fluorescerend eiwit tag, hier YPet, met behulp van een anti-GFP antilichaam, ii) fluorescerende of chromogene ISH op secties, of iii ) whole-mount ISH, gevolgd door het snijden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs danken Christa Haase, Doris Weber en Brigitte Korte voor technische ondersteuning. Werk in de Weidinger lab wordt ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 en door de Deutsche Gesellschaft für Kardiologie via een Oskar-Lapp-Stipendium en Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g., Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5,000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g., Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317 (2014).
- Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
- Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610 (2007).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
- Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).
