Introduction
O peixe-zebra é um bem estabelecido modelo de organismo vertebrado para estudar muitos aspectos do desenvolvimento, a fisiologia, a doença, e regeneração. Com a crescente adopção de peixe-zebra como um modelo para os processos biológicos de pós-embrionárias, ferramentas experimentais para, manipulação específica de tecido da expressão génica indutível ou vias de sinalização tornaram-se cada vez mais importante. Particularmente, os estudos sobre a regeneração de órgãos e apêndice no peixe-zebra adulto têm sofrido com a falta de ferramentas para dissecar os requisitos espaço-temporais de vias de sinalização durante estes processos regenerativos.
Actualmente, três sistemas diferentes têm sido usados para alcançar, expressão condicional específica de tecido do gene na regeneração de órgãos de peixe-zebra adulto: o sistema Cre-lox, expressão de mosaico de choque térmico utilizando transgenes indutíveis transposão transgénese mediada por somática, e o sistema de 1 téton -3. Téton refere-se a uma variante de uma tetraciclina-contsistema de activação transcricional laminadas, onde a expressão é activada na presença do antibiótico tetraciclina ou um seu derivado, por exemplo, doxiciclina. O sistema Cre-lox, uma vez que até agora tem sido usado em peixes adultos, depende de uma recombinase Cre controlado-Tamoxifeno (CreERT2), cuja expressão é limitada espacialmente por elementos reguladores específicos de tecido. Remoção Cre-impulsionado de uma cassete de PARAGEM facilita a expressão do gene de interesse accionado por um promotor que deve ser activo em todos os tipos de células 1. Mediada por transposão criação de transgenes somáticas mosaically expressas fornece um sistema para a expressão induzível do transgene em linhagens celulares individuais. A injecção de embriões de peixes-zebra com um transposão Tol2 portador de um gene de interesse sob o controlo transcricional de um promotor de choque térmico resultados em indivíduos quiméricos tipicamente transportam o transgene apenas em linhagens celulares distintas de um órgão de regeneração 2. Embora ambos os sistemas permitem condicional tecido-spea expressão do gene espe-, o sistema Cre-lox não é reversível, e usando a estratégia de rotulagem clonal à base de transposão sofre com a sua natureza estocástica. Assim, nós e outros recentemente adaptado sistemas Teton transgênicos para uso em peixes-zebra, que facilitam temporal e expressão de genes controlados por espacialmente que é sintonizável em adição e reversível 3-5.
O sistema utilizado aqui téton compreende um controlador de linha transgénica (TetActivator) em que um de doxiciclina (DOX) -inducible activador transcricional (melhoria transactivador tetraciclina reversa, irtTA, curto TETA) está sob o controle de sequências reguladoras genómicos específicos de tecidos. Em segundo lugar, requer uma linha transgénica respondedor (TetResponder) que abriga um gene de interesse sob o controlo transcricional do operador de tetraciclina (Tet elemento de resposta; tetre) (Figura 1A). Assim, a utilização de combinações específicas de TetActivator e TetResponder linhas permite condicional tecido-específic manipulação da expressão do gene.
Temos recentemente utilizou o sistema de Teton para sondar para funções específicas de tecidos de sinalização Wnt / beta-catenina no adulto regeneração da cauda do peixe-zebra fin 3. No protocolo descrito aqui nós descrevemos um fluxo de trabalho para set-up e uso do sistema de Teton no peixe-zebra, em particular para estudos de regeneração fin. Isso inclui instruções detalhadas sobre como gerar TetActivator e TetResponder linhagens transgênicas estáveis e um protocolo de indução transgene em embriões de peixe-zebra e adulto. Além disso, descreve-se técnicas para a verificação da expressão do gene específica para um tecido regenerado em barbatana, incluindo um protocolo para a preparação de criocortes de aletas de peixe-zebra adultos. Além disso, nós discutimos considerações para a concepção do transgene TetActivator, a escolha de um método de transgénese, e detecção da expressão TetResponder. Assim, o objetivo geral deste protocolo é para servir como um modelopara o estabelecimento de um sistema de téton funcional em peixes-zebra para conseguir a expressão do gene específica para um tecido condicional, o qual pode ser aplicado a qualquer tecido de interesse.
Nós criamos um vetor TetActivator permitindo I-SCEI ou geração Tol2 mediada de linhas TetActivator estáveis utilizando sequências de regulação genômicas curtas (fragmentos potenciador; banco de dados plasmídeo laboratório Weidinger nenhum 1247;. Figura 1B). Esta construção contém uma cassete que consiste TetActivator da variante mutante M2 do domínio inversa repressor Tet fundido com o vírus Herpes simplex VP16-domínio de transactivação derivado 3F [irtTAM2 (3F)]. Expressão do TetActivator (TETA) pode ser facilmente monitorizada uma vez que é co-expressa com a AmCyan fluoróforo a partir do mesmo enquadramento de leitura aberto; um péptido P2A medeia salto ribossomal, o qual deve resultar na produção de TETA e AmCyan como proteínas separadas a uma razão 1: 1 5,6. O construto também contém um poylinker 5 'do tetActivator cassete para facilitar a inserção de sequências genómicas reguladoras de interesse utilizando métodos de clonagem convencionais.
Além disso, criámos um constructo consistindo do acima descrito cassete TetActivator além de uma cassete de selecção com canamicina (base de dados não plasmídeo laboratório Weidinger 1180;. A Figura 1C), o qual pode ser recombinado num cromossoma bacteriano artificial (BAC) contendo uma grande região genómica ( geralmente no codão de iniciação de um gene cuja expressão padrão é para ser mimetizado pelo transgene). Ambas as construções são disponíveis a partir do laboratório Weidinger mediante pedido.
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Protocol
1. Geração de transgênicos TetActivator Peixe Lines
- Geração de TetActivator construto
- Clone sequências reguladoras de interesse a montante da cassete de TetActivator no vetor # 1247 utilizando técnicas padrão. Alternativamente, a utilização de técnicas de recombinação para gerar um BAC, em que a cassete TetActivator (vector # 1180) é inserido no primeiro exão do gene alvo, e em que o Tol2 invertido repetições são introduzidos na espinha dorsal de BAC (para um protocolo detalhado recombineering ver 7,8).
- Prepare plasmídeo de DNA livre de toxinas ou preparações de DNA BAC utilizando kits disponíveis comercialmente.
- Geração de linhas de peixes transgénicos TetActivator
- Realizar microinjecção da construção TetActivator de acordo com procedimentos padrão 9.
- Injectar 25-50 pg do DNA de plasmídeo ou de até 250 pg de ADN de BAC em embriões de fase de uma célula em conjunto com tampado codificante de ARN sentido para tra tol2nsposase para transgenia mediada por transposon, ou com a proteína I-SCEI para transgenia I-SCEI mediada.
NOTA: Considerações sobre a escolha do método de transgênese podem ser encontradas na seção de discussão.
NOTA: Injectar um modo preferido para dentro do citoplasma, a gema não, uma vez que a eficiência da transgénese pode diminuir quando o DNA não é entregue para o citoplasma.
- Injectar 25-50 pg do DNA de plasmídeo ou de até 250 pg de ADN de BAC em embriões de fase de uma célula em conjunto com tampado codificante de ARN sentido para tra tol2nsposase para transgenia mediada por transposon, ou com a proteína I-SCEI para transgenia I-SCEI mediada.
- Levante embriões injetados G0 até a idade adulta. Opcionalmente, os embriões G0 tela para AmCyan fluorescência e preferencialmente crescer embriões que mostram o padrão de expressão desejado. Isto pode aumentar a taxa de transmissão da linha germinal, em particular para a transgénese mediada por Tol2.
- Avaliar a integração da linha germinal de cruzamento bem sucedido por peixe G0 indivíduo com o tipo selvagem de peixe e aparecimento de fluorescência AmCyan no padrão de expressão nos embriões esperado F1 ou larvas usando um estereomicroscópio fluorescente (exemplo é mostrado na Figura 1D).
- Levante-fluorescência positivoEmbriões de F1 para a vida adulta e mate-os com o tipo selvagem de peixe para obter estável peixe F2 transgénico.
- Levante e caracterizar pelo menos 3 sublinhas diferentes derivadas de diferentes peixes fundador G0, uma vez que as linhas individuais podem diferir em níveis de expressão, padrão de expressão, capacidade de induzir linhas TetResponder, leakiness, e sua suscetibilidade a silenciar.
NOTA: Muitos transgenes que são robustamente expressos em embriões são parcialmente ou completamente silenciada em larvas em estágio final ou peixes adultos. Assim, se as linhas são destinadas a ser usadas em peixes adultos, caracterizar várias linhas independentes para a sua expressão e função TetActivator durante a idade adulta.
NOTA: geraram um painel de linhas TetActivator para expressão específica de tecido do TetActivator em ambos os embriões e os peixes adultos, que estão listados na Tabela 1 Estas linhas estão disponíveis a partir do laboratório Weidinger mediante pedido..
- Realizar microinjecção da construção TetActivator de acordo com procedimentos padrão 9.
2. Geração de Transgênicos TetResponder Peixe Lines
NOTA: Geramos uma construção TetResponder permitindo a I-Scel ou geração Tol2-mediada de linhas TetResponder estáveis, que é disponível a partir do laboratório Weidinger mediante pedido (Weidinger base de dados de laboratório não plasmídeo 1,444; Figura 1E.). Esta construção contém um operador de tetraciclina, seguido por uma região poliligante facilitar a inserção de sequências codificadoras (CDS) de um gene de interesse e a sequência de codificação YPet YFP-derivado. Assim, a construção é concebida para expressão TETA-mediada de uma fusão C-terminal da proteína de interesse com YPet. Se a expressão de uma proteína de fusão com a etiqueta tem de ser evitada, uma P2A ou T2A péptido pode ser introduzido com o gene da CDS de interesse, o que facilita a co-expressão da proteína de interesse e YPet como polipéptidos separados 6,10.
- Geração de TetResponder construto
- CDS clone do gene de interesse 3 'do operador da tetraciclinae 5 'dos CDS YPet de acordo com procedimentos padrão. Assegure-se que o codão de terminação foi removido a partir do gene de interesse CDS.
- Prepare preparações de DNA de plasmídeo livres de toxinas usando kits disponíveis comercialmente.
- Geração de linhas de peixes transgénicos TetResponder
- Realizar microinjecção de TetResponder construir de acordo com procedimentos padrão 9.
- Injectar 25-50 pg do DNA de plasmídeo no citoplasma de embriões de uma célula em fase juntamente com tampado codificante de ARN sentido para transposase tol2 para transgénese mediada por transposão ou com a enzima I-Scel para transgénese-aided meganuclease.
NOTA: Considerações sobre a escolha do método de transgênese podem ser encontradas na seção de discussão.
NOTA: Injectar um modo preferido para dentro do citoplasma, a gema não, uma vez que a eficiência da transgénese pode diminuir quando o DNA não é entregue para o citoplasma.
- Injectar 25-50 pg do DNA de plasmídeo no citoplasma de embriões de uma célula em fase juntamente com tampado codificante de ARN sentido para transposase tol2 para transgénese mediada por transposão ou com a enzima I-Scel para transgénese-aided meganuclease.
- Levante injetados embriões G0 a umdulthood.
- Avaliar integração bem sucedida da linha germinal e indutibilidade do transgene por meio de cruzamentos de peixe G0 indivíduo com uma linha TetActivator previamente estabelecido seguido por tratamento Doxiciclina de embriões F1 ou F1 larvas.
NOTA: Normalmente, usamos uma linha TetActivator-driven promotor da ubiquitina (ubiquitina: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2, short ubiquitina: Teta AmCyan 3) para triagem de portadores TetResponder funcionais, como esta linha conduz a expressão bastante onipresente em embriões e adultos peixe e, portanto, bem adequado para avaliar a indutibilidade TetResponder em todos os tecidos de interesse. Esta linha está disponível a partir do laboratório Weidinger mediante pedido. - Coletar embriões de cada embreagem em uma placa de 10 cm separado Petri contendo meio embrião E3 (ver tabela de materiais) e incubar pratos a 28,5 ° C.
- Lugar G0 peixes que deu embriões em tanques individuais numeradas (caixas de criação; veja a tabela de materiais) até embriões foram telaed. Isto permite a recuperação de G0 peixes que mostram transmissão linha germinal do transgene.
- Se apenas metade dos embriões são esperados para transportar o transgene TetActivator (no caso de uma transportadora TetActivator heterozigótica foi cruzado com um TetResponder fundador peixe), para seleccionar os embriões que contêm o transgene TetActivator pelo aparecimento de AmCyan de fluorescência na fase de desenvolvimento apropriado.
- Induzir a atividade transcricional TetActivator por tratamento de embriões com doxiciclina (DOX), como descrito na seção 2.3.
- Embriões F1 tela para surgimento de YPet fluorescência. Prefere linhas (G0 peixe) que produzem expressão YPet homogênea, ou seja embriões na embreagem deve exibir pouco mosaicism dentro do domínio expressão esperada e pouca variação entre os embriões individuais. Veja pontas de seta em Figura 1F e Figura 1G para exemplos representativos.
- Mate G0 peixe transmitir um transgene TetResponder indutível identificados emo passo 2.2.8 com o tipo selvagem de peixe e levantar todos os embriões de F1 para a vida adulta.
- Identificar peixe F1 transgênico adulto ou por genotipagem baseados em PCR (ver secção ou pelo cruzamento de peixe F1 indivíduo a uma linha TetActivator seguido de tratamento DOX de embriões F2 e surgimento de YPet fluorescência (ver secção 2.5).
- Estabelecer e caracterizar pelo menos 3 sublinhas TetResponder diferentes derivadas de diferentes peixes fundador G0, desde inducibility podem diferir em linhas individuais. Em particular, os níveis de expressão alcançáveis e se a resposta pode ser activado em todos os tipos de células pode variar. Além disso, a susceptibilidade ao silenciamento será diferente entre as linhas. Finalmente, em alguns casos, pode ser preferível seleccionar linhas que medeiam apenas moderados níveis de expressão da proteína de interesse, em particular quando se pressupõe que a expressão gotejante produzido em combinação com uma linha TetActivator na ausência de doxiciclina para causar defeitos de desenvolvimento ou toxicidade.
NOTA: TetLinhas de resposta que estão robustamente induzível em embriões podem ser parcialmente ou completamente silenciada em larvas em estágio final ou peixes adultos. Assim, se as linhas são destinadas a ser usadas em peixes adultos, várias linhas independentes deve ser caracterizado por indutibilidade em adultos. Se a indução do gene de interesse é compatível com maior desenvolvimento, verificou-se mostrado útil para criar embriões transgénicos duplos (TetActivator x TetResponder), para induzir a expressão em embriões GI e para seleccionar e criar apenas os indivíduos que mostram o mosaico mais robusta e menos indução. - Para manter e propagar linhas TetResponder estabelecidos, genótipo adulto peixes como descrito na seção 2.5).
- Realizar microinjecção de TetResponder construir de acordo com procedimentos padrão 9.
- A doxiciclina tratamento de embriões
- Prepare 2,000x doxiciclina (DOX) ações. Resolver DOX em EtOH a 50% para atingir uma concentração de 50 mg / ml (97 mM). Armazenar os produtos DOX protegida da luz à temperatura de -20 ° C.
- Decantar a maioria de meio E3 a partir de embriões e substituí-lo comMeio embrião E3 contendo DOX, a uma concentração final de 25 ug / ml de DOX (2,5 ul de estoque 2,000x DOX por 50 ml de E3). Dechorionation não é necessária.
- Retorno embriões para 28,5 ° C durante um mínimo de 6 horas antes de se avaliar a expressão do gene de interesse marcado pelo aparecimento de YPet fluorescência.
- Avaliar leakiness do TetActivator / TetResponder combinação embriões por tratamento com EtOH único solvente.
NOTA: A hibridação in situ (ISH) ou RT-PCR para detectar o ARNm TetResponder podem ser utilizadas como medidas mais sensíveis de leakiness de fluorescência do gene de interesse marcado. A extensão da leakiness dependerá da combinação linha TetActivator / TetResponder particular e também podem variar entre tecidos e estádios de desenvolvimento.
- Anestesia de peixe-zebra adulto
- Preparar 10 cm de diâmetro numa caixa de Petri ou pequeno copo cheio com água do sistema de peixe contendo 1 mg / ml tricaina (Acetato de 3-aminobenzoato methanesulfonate, EM-222).
- Transfira o peixe para recipiente contendo anestésico e esperar até que ele atinja o nível 4 da anestesia, como indicado pela completa perda de equilíbrio (peixe encontra-se em seu lado), sem movimentos e sem resposta para tocar 11.
- Transferir cuidadosamente peixe usando uma pinça ou uma colher sobre uma lâmina de vidro, tampa de uma placa de Petri de plástico, ou revestidas de agarose placa de petri e executar amputação fin ou de imagem (ver secção 3.2).
- Retorno peixe para um recipiente contendo um grande volume de água do sistema de peixe fresco e controlá-lo. Se os movimentos de emalhar não retomar dentro de 3 min, auxiliar, soprando água sobre as brânquias, utilizando uma pipeta de transferência de plástico.
- Genotipagem baseada em PCR de peixe TetResponder
- Executar amputação parcial da cauda fin 12. Coloque o peixe em tanques, numeradas individuais (caixas de criação; veja a tabela de materiais). Isto permite a recuperação de peixes transgénicos seguinte genotipagem bem sucedida.
- Transfer tecidos FIN para poços individuais de uma placa de 96 poços por PCR pré-cheias com 20 ul de DNase-livre de água para o isolamento de ADN genómico de 13.
- Adicionar 120 ul de NaOH 1 M a cada poço e incubar as amostras durante 20 min a 95 ° C utilizando um termociclador.
- Amostras frio a 4 ° C, adicionar 14 ul de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0) a cada poço, e as amostras brevemente vortex. Centrifugar as amostras durante 5 minutos a 16,000 xg para sedimentar os detritos celulares. Armazenar ADN genómico a 4 ° C até ser necessário.
- Iniciadores de design para amplificar especificamente um fragmento do transgene TetResponder. Utilizar 2 ul de ADN isolado de uma reacção de PCR convencional e analisar o produto de PCR num gel de agarose.
A indução específica de tecido 3. de Transgene Expression in the Tail Adulto Regeneração Zebrafish Fin
- Estabelecimento de TetActivator; TetResponder peixes transgénicos duplo
- Companheiro transportadoras TetActivator com TetResponder Carriers.
- Selecionar embriões portadores do transgene TetActivator em um estágio de desenvolvimento em que os elementos reguladores que conduzem a cassete TetActivator estão ativos. Embriões transgénicos pode ser facilmente identificado pelo aparecimento de AmCyan da fluorescência utilizando um microscópio de fluorescência estéreo.
NOTA: TetActivator peixes transgene-positivos podem, alternativamente, ser identificados durante a idade adulta por imagem de peixes anestesiado, por exemplo. após a amputação da nadadeira caudal e surgimento de fluorescência AmCyan no regenerado. - Levante embriões selecionados para a vida adulta.
- Identificar dupla peixe transgénico adulto (peixe que carregam o TetResponder além da TetActivator) por genotipagem baseada em PCR ou (de preferência) pela sua capacidade para induzir a expressão do TetResponder no tecido de interesse. Um protocolo de indução TetResponder e detecção na barbatana caudal em regeneração é descrito na secção 2.3 e secção 4.
NOTA: Se a expressão transitória TetResponder é compatívelcom mais desenvolvimento embrionário ou larval, é útil para identificar embriões transgênicos duplas que levam TetActivator e TetResponder transgenes após o tratamento DOX durante o desenvolvimento embrionário, como descrito acima (seção 2.3, figura 1H). Embriões duplos positivos mostrará AmCyan e YPet fluorescência. Levante embriões positivos para a vida adulta.
- Amputação de aletas de cauda de peixe-zebra e indução da expressão do transgene no fin regenerando
- Executar amputação parcial da barbatana caudal em peixes anestesiados (ver secção 2.4) 12. Trate peixe ou imediatamente com DOX ou devolvê-los ao sistema de alojamento de peixes.
- Prepare a caixa de reprodução (Figura 2A; ver tabela Materiais) encheu-se com 1 L de água do sistema de peixe contendo 25 ug / ml de DOX (adicionar 500 ul de 2,000x a 50 mg / ml a 1 L de sistema de água de peixe).
NOTA: Indução da expressão do transgene imediatamente após a amputação como permiteliação dos efeitos nos eventos precoces durante a regeneração, enquanto que a indução aos 3 dias pós-amputação (3 DPA) deve ser usada para avaliar a expressão ou função do transgene durante o crescimento regenerativo. - Transfira até 10 previamente amputada, peixes transgénicos dupla para a caixa de reprodução e fechar a caixa com uma tampa de modo a que os peixes não podem escapar (Figura 2A).
- Coloque caixas de melhoramento para o escuro para reduzir o stress. Costumamos colocar as caixas em um 28,5 ° C incubadora de ar para garantir a escuridão e temperatura constante.
- Trate controle peixes transgénicos dupla negativa com EtOH única (250 ul por sistema de água 1L peixe).
NOTA: transgênica de solteiro ou de tipo selvagem peixes tratados com DOX pode ser usado como controle negativo adicional, embora nunca tenham observado efeitos adversos das doses DOX utilizados aqui na regeneração fin. - Anestesiar peixes como descrito na seção 2.4 e transferência de peixes usando uma pinça ou uma colher em uma petri revestidas de agarose molhada prato. Espalhar com cuidado a nadadeira caudal, usando uma pinça.
- Peixe tela para o aparecimento de YPet dentro do regenerado usando um microscópio estéreo fluorescente (Figura 2B).
NOTA: Normalmente, fluorescência-driven TetResponder podem ser robustamente observado após 6 horas de tratamento DOX. No entanto, recomendamos para caracterizar a dinâmica de expressão TetResponder para cada linha gerada. - Retorno peixe para o sistema de habitação peixes para terminar indução transgene TetResponder ou continuar os tratamentos.
NOTA: Para tratamentos> 24 hr (tratamentos de longo prazo) é essencial para a troca de água e completamente limpar as caixas de reprodução diária. - Durante os tratamentos de longo prazo, peixes alimentação a cada 2-3 dias, transferindo peixes em um recipiente limpo com o sistema de água de peixe fresco, antes de devolvê-los às caixas de criadouros após a alimentação.
4. Caracterização dos TetResponder Expressão em Fin Regenera
t "> NOTA:. Nós normalmente verificar a expressão do gene específica para um tecido na barbatana da cauda de regeneração utilizando imagiologia fluorescente de criocortes em 3 DPA Neste ponto de tempo dos diferentes compartimentos do tecido regenerado de um ter formado e pode ser claramente identificadas no tecido-secções, cryosectioning e é mais simples do que em fases posteriores da regeneração. A Figura 2C mostra os domínios de tecidos que podem ser distinguidos no regenerado e lista alguns marcadores moleculares para estes domínios. O protocolo seguinte descreve a preparação de criocortes longitudinais ou transversais para imagiologia directa ou imunocoloração .- Cryosectioning de aletas de cauda adultos
- Trate peixes cuja cauda barbatanas foram amputadas de 2 dpa até 3 dpa com DOX como descrito na secção 3.2
- Anestesiar peixes como descrito na secção 2.4
- Usar uma colher ou uma pinça para transferir suavemente peixe para uma tampa de uma placa de Petri de plástico.
- Re-amputar o regenerado fin a cerca de 4-5 segmento ósseos proximal ao plano amputação inicial utilizando um bisturi e devolver o peixe à água sistema de peixe fresco.
- Transferir cuidadosamente regenera para uma pequena placa de petri (por exemplo, de 35 mm) contendo 4% (w / v) de paraformaldeído (PFA) em solução salina tamponada 1x com fosfato (PBS; ver tabela Materiais) utilizando uma pinça fina. Não toque no regenerado, mas apenas a parte tronco de tecido.
- Coloque o tecido plano para o fundo placa de petri e corrigir O / N a 4 ° C.
- Lavar regenera duas vezes em 1x PBS contendo 0,1% de Tween (PBT), para remover o PFA e incubar regenera o / n a 4 ° C em 0,5 M de EDTA-PBS (pH 7,5) para descalcificar matriz óssea.
- Incubar regenera a RT em 10% de sacarose-PBS, 20% de sacarose-PBS, 30% de sacarose-PBS e 30% de sacarose-PBS: tecido meio de congelação numa proporção 1: 1 (TFM; ver tabela Materiais) durante 30 min cada. Subsequentemente, incubam aletas a 4 ° C durante> 2 horas em meio de congelamento de tecidos.
- Coloque cryomolds sobre uma lâmina de microscópio e preencher om com meio de congelamento de tecidos. Evitar a introdução de bolhas de ar.
- Transferência adequadamente regenera em cryomolds e tecido oriente para obtenção de cortes longitudinais ou transversais de regenera fin (Figura 2D). Assegurar que regenerar é reto, o que facilita o corte.
- Transferência cryomolds em conjunto com lâmina de microscópio sobre uma grelha de metal posicionada sobre uma camada de gelo seco, para iniciar o processo de congelação (Figura 2D).
- Uma vez que o meio de congelamento de tecidos tornou-se sólido, lugar cryomold para banco e deixar repousar à temperatura ambiente durante alguns minutos de modo a que o meio de congelamento de tecidos derrete na interface plástico médio.
- Use uma caneta ou similar para empurrar o bloco congelado fora do cryomold. Armazenar cryoblocks em uma caixa a -80 ° C, até o seccionamento do tecido.
- Prepare 10-14 mm de espessura criosecções usando um Cryo-micrótomo e recolher seções sobre lâminas de microscópio de adesão (ver tabela de materiais). Armazenar as lâminas a -20 ° C até ser neEDED.
- Caracterização de expressão em secções de aleta TetResponder baseado em fluorescência YPet
- Tratar secções aleta durante 30 min com 100% de MeOH arrefecida a -20 ° C para melhorar a adesão à lâmina de microscópio, seguido por duas lavagens a RT em PBT e 1 lavagem em PBS, 5 minutos cada.
- Visualizar núcleos por secções a incubar durante 10 minutos em 4 ', 6- diamidino-2-phenylinodole (DAPI) em PBS (1: 5000), seguido por duas lavagens de 10 minutos cada em PBS.
- Seções de montagem em 75% de glicerol-PBS ou montagens Antifade disponíveis comercialmente, e cubra com uma tampa corrediça.
- Imagem YPet e fluorescência confocal AmCyan sob uma ou de campo amplo microscópio de fluorescência (Figura 1E).
NOTA: Para facilitar a identificação inequívoca dos tipos celulares que expressam YPet, imunofluorescência ou imuno-histoquímica com anticorpos contra antigénios de tipo específico de células juntamente com anticorpos anti-GFP (que reagem com YPet, mas não AmCyan) pode ser realizada. Em alternativa, para facilitar a detecção de uma expressão fraca YPet, RNA de hibridação in situ contra YPet ARN pode ser realizada quer em conjunto de montagem aletas ou secções de parafina de aletas.
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Representative Results
Para estabelecer um sistema téton funcional para a expressão do gene induzível específico de tecido, TetActivator transgénicos e linhas TetResponder precisa de ser gerado (Figura 1A). Isto é conseguido por microinjecção TetActivator (Figura 1B - C) ou TetResponder (Figura 1E) constrói em embriões de peixe-zebra primeiros e integração da linha germinal subsequente. TetActivator construções funcionais podem ser gerados por clonagem de sequências reguladoras de curta duração (elementos intensificadores) a montante da cassete de TetActivator (Figura 1B), ou por recombinação a cassete TetActivator num BAC contendo elementos reguladores do gene de interesse (Figura 1C). Integração da linha germinal da construção TetActivator pode ser avaliada por cruzamento individual injectado peixe G0 e aparecimento de fluorescência em embriões AmCyan F1 no padrão de expressão esperado (Figura 1D). Germline integração e funcionalidade do transgene TetResponder pode ser avaliada através do cruzamento G0 peixes individuais injectados para peixes TetActivator estabelecida (aqui ubiquitina: TETA AmCyan), seguido por tratamento com DOX e aparecimento de YFP / YPet fluorescência (Figura 1F). Peixe mostrando a expressão YFP / YPet forte e homogênea deve ser preferido para estabelecer uma linha TetResponder estável (Figura 1G). Tendo estabelecido TetActivator estável e linhas de peixes TetResponder, combinações TetActivator / TetResponder específicos podem ser gerados pelo cruzamento. Portadores de TetActiator e TetResponder transgenes podem ser identificados durante a embriogênese após o tratamento DOX final surgimento de YFP / Ypet no estágio de desenvolvimento do TetActivator está ativa (Figura 1H). Alternativamente, peixes transgénicos duplos podem ser identificadas após o tratamento DOX e TetResponder indução transgene na barbatana caudal regeneração (Figura 2A - B).
< p class = "jove_content"> Nós rotineiramente usam este sistema para alcançar, expressão induzível gene específico do tecido na regeneração de barbatana caudal do peixe-zebra. Verificamos específico do tecido expressão TetResponder transgene por imagens de fluorescência de criosecções de 3 dpa regenera fin, uma vez que os diferentes compartimentos do tecido de um regenerado pode ser claramente identificada no tecido seções neste ponto de tempo (Figura 2C). Asa longitudinal ou transversal regeneram secções são obtidas por cryosectioning após crioprotector tecido e incorporação de aleta regenerar de forma adequada (Figura 2D). Na sequência de corte, a expressão do transgene TetResponder (Ypet / YFP fluorescência) pode ser fotografada usando fluorescência ou microscopia confocal (Figura 2E). Note-se que o promotor TetActivator her4.3-driven induz a expressão TetResponder no blastema medial proximal, enquanto o blastema distal (ponta de seta) e na epiderme (seta) são desprovidos de expressão. ove_content ">
Figura 1: Geração de TetActivator e TetResponder linhas transgénicas. (A) dos desenhos que mostra a estratégia para a expressão do gene induzível específico de tecido usando o sistema téton. (B) Transgenic TetActivator construir (Weidinger banco de dados plasmídeo laboratório no. 1247). Um poliligante 5 'do TetActivator irtTAM2 (3F) facilita cLöning de sequências reguladoras de interesse. A sequência de codificação de AmCyan é separado do TetActivator através de um péptido P2A 'auto-clivagem ". A cassete também contém um sinal de poliadenilação de SV40, é flanqueado por repetições invertidas Tol2 transposões e contém um único local de reconhecimento da meganuclease I-Scel. (C) cassete TetActivator para BAC recombineering (Weidinger banco de dados plasmídeo laboratório no. 1180). A cassete inclui o gene da canamicina para selecção, que é conduzido por um promotor procariótico Gb3. Locais DRF flanqueando o gene de resistência à canamicina permitir a sua remoção mediada Flp recombinase seguinte integração bem sucedida no BAC. (D) Identificação de G0 fundador peixes transmitir o her4.3: Teta AmCyan construir através de sua linha germinal. Os transportadores são identificados através de aparecimento de fluorescência AmCyan em alguns embriões F1 (pontas de seta). (E) Transgenic TetResponder construir (Weidinger banco de dados plasmídeo laboratório no. 1444).Esta constrói consiste de um poliligante e YPet CDS sob controle dos elementos de resposta otimizados Tet (tetre-apertado, Clontech) e terminado pelo sinal de poliadenilação de SV40. Ele é flanqueado por repetições invertidas Tol2 transposões e contém um único local de reconhecimento da meganuclease I-Scel. (F) Identificação de G0 fundador peixes transmitir um funcional TetResponder tetre: AXIN1-YFP construir através de sua linha germinal. Os transportadores são identificados através do cruzamento com uma linha estabelecida TetActivator (aqui ubiquitina: Teta AmCyan) e indução de YFP fluorescência após o tratamento DOX durante 6 horas (setas). (G) Feche acima ofembryos mostrados em (F) após um total de 12 horas de tratamento DOX. Nota indução bastante onipresente da YFP fluorescência. (H) Identificação dos embriões transgênicos duplas que levam TetActivator (her4.3: Teta AmCyan) e TetResponder (tetre: AXIN1-YFP) transgenes (setas). Embriões nósre tratados com DOX durante 6 h. (A - H) Barra de escala: 500 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A utilização do sistema téton para a expressão do gene específica para um tecido na regeneração de barbatana da cauda do peixe-zebra. (A) caixas de reprodução utilizados para o tratamento DOX de peixe-zebra adulto. (B) Indução de tetre: AXIN1-YFP TetResponder transgene pelo her4.3: Teta AmCyan TetActivatorna barbatana caudal regenerar após 12 h de tratamento DOX. Note-se a ausência de fluorescência na YFP controlo de peixe tratado com EtOH. (C) desenhos animados que descreve alguns dos compartimentos de tecido encontrados dentro de um regenerado fin em 3 dpa em uma vista de corte longitudinal. (D) Preparação de amostras para cryosectioning. Regenera Fin são colocados em meio de congelamento de tecidos (TFM) -filled cryomolds, orientados de forma adequada para obtenção de cortes ou longitudinal ou transversal do regenerado, e transferida para um rack de metal sentado em cima de gelo seco até TFM solidificou. Plano de corte é indicado em vermelho. Abreviaturas: dist .: distal, prox .: proximais, ventilação .: ventral, dors .: dorsal. (E) confocal imagem de fluorescência de YFP numa secção longitudinal de um raio regenerado aleta derivado de aletas mostrados em (B). Note que o her4.3: linha Teta AmCyan TetActivator impulsiona indução YFP especificamente no blastema proximal-medial. YFPfluorescência não é detectado numa variedade de compartimentos, incluindo a epiderme da ferida (seta), e a mais distai-domínio do mesênquima (ponta de seta) (BC) Barra de escala: 500 mm; (E) Barra de escala:. 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Linha TetActivator | Referência | Os elementos reguladores usados | Principalmente expresso em |
| 7xTCF-Xla.Siam: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan | Wehner & Weidinger, inédito | 7xTCF-Xla.Siam Wnt repórter 1 | Tecidos de Wnt-responsivos |
| myl7: irtTAM2 (3F) -p2a-mCherry | Haase & Weidinger, inédito | myl7 (cmlc2) 2 | cardiomiócitos maduros |
| her4.3: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm6 | 3 | her4.3 4 | sistema nervoso central |
| keratin4: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm5 | 3 | keratin4 5 | epiderme, na aleta adulto excluindo a camada basal |
| keratin18: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm4 | 3 | keratin18 6 | epiderme, na aleta adulto exclusivamente na camada basal |
| sp7: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm3 | 3 | sp7 / OSX 7 | (Comprometido) osteoblastos |
| ubiquitina: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2 | 3 | ubiquitina 8 | (Bastante) ubíqua |
Tabela 1:. TetActivator linhas transgênicas disponíveis Esta tabela lista TetActiva transgênicolinhas tor para expressão específica de tecido do TetActivator, tanto nos animais embrionário e adulto, que estão disponíveis a partir do laboratório Weidinger mediante pedido.
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Discussion
O peixe-zebra adulto tem uma incrível capacidade de se regenerar com sucesso muitos órgãos internos e apêndices. Um profundo conhecimento dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos requer uma análise específica de tecido de funções dos genes e vias de sinalização. Para isso, o sistema de Teton fornece uma ferramenta eficiente para a expressão do gene espaço-temporalmente controlada em zebrafish embrionárias e adultas. As construções do sistema de Teton ea metodologia descritos neste manuscrito foram usados com sucesso em um estudo recente de nosso laboratório 3. As seguintes questões adicionais devem ser consideradas ao estabelecer o sistema de Teton:
TetActivator considerações de design transgene
Nós mostramos anteriormente que um único induzível TetActivator consistindo da variante mutante M2 do domínio inversa repressor Tet fundido com o vírus Herpes simplex VP16-domínio de transactivação derivado 3F [irtTAM2 (3F), in curto Teta-M2] confere indução eficiente, mas pode mostrar baixo, embora leakiness mensurável, que é fundo actividade indutora na ausência de doxiciclina (DOX) 5. Portanto, temos descrito dually sistemas indut�eis utilizando fusões com um receptor glicocorticóide (Teta-GBD) ou um domínio do receptor Ecdysone (Teta-ECR), que eliminam leakiness 5. Assim, se o sistema vai ser utilizado para expressar proteínas tóxicas ou muito potentes (por exemplo, oncogenes) a utilização de uma variante duplamente induzivel deve ser considerada. Alternativamente, durante o estabelecimento de linhas TetResponder TetActivator e uma gama de linhas de produção diferentes níveis de expressão podem ser seleccionados e os indutores mais fracos escolhidos no caso leakiness é um problema com as linhas fortemente indutores. Construções TetActivator contendo a variante Teta-GBD ou Teta-ECR estão disponíveis a partir do laboratório Weidinger mediante solicitação.
Métodos de transgénese para geração de linhas de peixes-zebra transgénicos
TetResponder análise da expressão do transgene
Para detectar a expressão TetResponder transgene específica de tecido de barbatanas de adultos geralmente usamos imagens fluorescentes de criosecções. Na nossa experiência, a fluorescência de proteínas fluorescentes expressas pelo transgene é preservada durante todo o FIXATIOn e cryosectioning processo e, portanto, pode ser directamente visualizada. Métodos adicionais para a detecção da expressão TetResponder, que foram descritas noutro lugar, são: i) a imunocoloração em secções, de preferência contra o marcador de proteína fluorescente, aqui YPet, utilizando um anticorpo anti-GFP, ii) fluorescente ou cromogénico ISH em secções, ou iii ) todo-mount ISH seguido por seccionamento.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores agradecem Christa Haase, Doris Weber e Brigitte Korte para assistência técnica. Trabalho no laboratório Weidinger é suportado por concessões do Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 e pela Deutsche Gesellschaft für Kardiologie através de uma Oskar-Lapp-Stipendium e Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g., Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5,000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g., Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
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