Introduction
Данио является хорошо создана позвоночных модельный организм для изучения многих аспектов развития, физиологии, болезни, и регенерации. С ростом принятия данио в качестве модели для пост-эмбриональных биологических процессов, экспериментальных инструментов для индуцибельного, тканеспецифической манипуляции экспрессии генов или сигнальных путей становятся все более важными. В частности, исследования в органе и придатков регенерации в взрослых данио пострадали от отсутствия инструментов для вскрытия пространственно-временная требованиям сигнальных путей во время этих регенеративных процессов.
В настоящее время три различные системы были использованы для достижения условное, тканеспецифичную экспрессию генов в регенерации органов взрослых данио: система Cre-LOX, мозаичную экспрессию теплового шока индуцируемых трансгенов использованием транспозонов-опосредованной соматической трансгенеза, и систему TETON 1 -3. Титон относится к варианту тетрациклина-продолжениепроката транскрипции система активации, где выражение активируется в присутствии тетрациклина антибиотик или производным, например доксициклин. Система Cre-LOX, как это до сих пор используется в взрослых рыб, опирается на Тамоксифен контролируемой Cre рекомбиназой (CreERT2), экспрессия которого пространственно ограничено регуляторных элементов ткане-специфических. Cre приводом удаление СТОП кассеты облегчает экспрессию интересующего гена с приводом от промотора, который должен быть активным во всех типах клеток 1. Транспозонов-опосредованной создание мозаично выраженных соматических трансгенов обеспечивает систему для индуцируемой экспрессии трансгена в отдельных клеточных клонов. Введение эмбрионов данио рерио с транспозона, несущего Tol2 представляющий интерес ген под транскрипционным контролем промотора теплового шока приводит к химерных особей, как правило, несущих трансген только в дискретных клеточных клонов в регенерирующей органа 2. В то время как обе системы позволяют условного ткани-SPEэкспрессия генов специфичны, система Cre-LOX не является обратимым, и стратегия с использованием транспозонов основе клонального маркировки страдает от его стохастического характера. Таким образом, мы и другие недавно адаптированы трансгенных систем Титон для использования в данио, которые облегчают времени и пространстве, контролируемая экспрессия генов, что в дополнение перестраиваемой и обратимой 3-5.
Система Титон используется здесь включает в себя трансгенной линии драйвера (TetActivator), в котором доксициклин (DOX) -inducible активатор транскрипции (улучшенный обратный тетрациклина трансактиватор, irtTA, короткие Тета) находится под контролем регуляторных последовательностей генома тканеспецифических. Во-вторых, это требует трансгенной линии ответчика (TetResponder), что таит в себе интерес ген под транскрипционным контролем оператора тетрациклина (TET элемент ответа; TetRE) (1А). Таким образом, использование специфических комбинаций TetActivator и TetResponder линий позволяет условного ткани-SPECIфик манипуляции экспрессии генов.
Мы недавно использовали Титон систему, чтобы зонд для тканеспецифических функций Wnt / бета-катенина сигнализации у взрослых данио регенерации хвостовой плавник 3. В протоколе, изложенной здесь мы описываем рабочий поток для настройки и использования системы Титон у рыбок данио, в частности, для исследований плавника регенерации. Это включает в себя подробные инструкции о том, как генерировать стабильные трансгенных TetActivator и TetResponder линии и протокол для трансгенной индукции у эмбрионов и взрослых данио. Кроме того, мы опишем методы для проверки экспрессии генов тканеспецифической в ребра регенерата, в том числе протокола для подготовки криосрезов взрослых данио плавников. Кроме того, мы обсудим соображения для конструкции TetActivator трансгена, выбор метода трансгенеза и обнаружения экспрессии TetResponder. Следовательно, общая цель этого протокола, чтобы служить в качестве планаДля наладки функциональную систему TETON в данио достичь экспрессии гена условное тканеспецифичную, который может быть применен к любой интересующей ткани.
Мы создали TetActivator вектор, позволяющий для I-SCEI или Tol2-опосредованной поколения устойчивых TetActivator линий с использованием коротких геномных последовательностей, регулирующих (энхансерные фрагменты; Вайдингер лаборатории базы данных плазмиды нет 1247;. 1В). Эта конструкция содержит кассету, состоящую из TetActivator М2 мутантного варианта обратной Tet-репрессора области слита с вирусом простого герпеса VP16 трансактивации домена производная 3F [irtTAM2 (3F)]. Экспрессия TetActivator (Тета) можно легко контролировать, поскольку она является совместной экспрессии с флуорофором AmCyan из той же открытой рамке считывания; p2a пептид опосредует рибосом пропуск, который должен привести к производству Тета и AmCyan как отдельных белков в соотношении 1: 1 отношение 5,6. Конструкция также содержит poylinker 5'-TetActivator кассеты для облегчения введения геномных регуляторных последовательностей, представляющих интерес с использованием обычных методов клонирования.
Кроме того, мы создали конструкцию, состоящую из описанной выше кассеты TetActivator плюс выбор кассеты канамицину (Weidinger лабораторной плазмиды базе данных нет 1180;. Рис 1С), который может быть объединяется в бактериальной искусственной хромосомы (ВАС), содержащего большое области геномной ( Обычно в старт-кодоном гена, экспрессия образец должен быть имитируется трансгена). Обе конструкции доступны из лаборатории Weidinger по запросу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Создание трансгенных линий TetActivator рыбы
- Генерация TetActivator конструкции
- Клонов регуляторные последовательности процентной верховьях кассеты TetActivator в векторном # 1247 с использованием стандартных методов. Кроме того, использование методов рекомбинации для генерирования BAC, в котором TetActivator кассеты (вектор # 1180) вставляется в первом экзоне гена-мишени, и где Tol2 инвертированных повторов, вводятся в ВАС позвоночника (подробное протокола recombineering см 7,8).
- Подготовка токсина-бесплатно плазмиды ДНК или препараты ВАС ДНК, используя имеющиеся в продаже наборы.
- Создание трансгенных линий TetActivator рыбы
- Выполнение микроинъекции в TetActivator конструкции в соответствии со стандартными процедурами 9.
- Вводят 25-50 мкг плазмидной ДНК или до 250 пг ВАС-ДНК в эмбрионы одной клеточной стадии вместе с колпачком смысловой РНК, кодирующей tol2 TRAnsposase для транспозонов-опосредованной трансгенеза, или я-SCEI белка для I-SCEI-опосредованной трансгенеза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соображения по выбору метода трансгенеза можно найти в разделе обсуждение.
Примечание: Вводят предпочтительно в цитоплазму, а не желтка, поскольку эффективность трансгенеза может уменьшаться, когда ДНК не доставлен в цитоплазму.
- Вводят 25-50 мкг плазмидной ДНК или до 250 пг ВАС-ДНК в эмбрионы одной клеточной стадии вместе с колпачком смысловой РНК, кодирующей tol2 TRAnsposase для транспозонов-опосредованной трансгенеза, или я-SCEI белка для I-SCEI-опосредованной трансгенеза.
- Поднять инъекционные эмбрионов G0 к взрослой жизни. По желанию, экран G0 эмбрионы для флуоресценции AmCyan и преимущественно растут эмбрионов, показывающие желаемый рисунок экспрессии. Это может увеличить скорость передачи зародышевой линии, в частности, для Tol2-опосредованной трансгенеза.
- Оценка успешной интеграции зародышевой линии путем скрещивания индивидуальный G0 рыбу дикого типа рыбы и появления AmCyan флуоресценции в ожидаемой паттерна экспрессии в эмбрионах F1 или личинок с помощью флуоресцентного стереомикроскопа (пример показан на рис 1D).
- Поднять флуоресценции положительноF1 эмбрионов взрослого и мат их дикого типа рыбы, чтобы получить стабильный F2 трансгенных рыб.
- Поднять и характеризуют, по крайней мере 3 различных сублиний полученные из разных основателя G0 рыбы, так как отдельные линии могут отличаться в уровнях экспрессии, паттерна экспрессии, способность индуцировать TetResponder линии, неплотности, и их восприимчивости к глушителей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Многие трансгены, которые энергично, выраженные в эмбрионов частично или полностью подавлен в поздней стадии личинок или взрослых рыб. Таким образом, если линии предназначены для использования во взрослой рыбы, характеризуют несколько независимых линий для их выражения TetActivator и функции во взрослом возрасте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы сформировали группу TetActivator линий для тканеспецифической выражения TetActivator в обоих эмбрионов и взрослых рыб, которые перечислены в таблице 1 Эти строки доступны из лаборатории Weidinger по запросу..
- Выполнение микроинъекции в TetActivator конструкции в соответствии со стандартными процедурами 9.
2. Генерация трансгенных ТetResponder Рыба Линии
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы сформировали TetResponder конструкцию, позволяющую для I-SCEI или Tol2-опосредованной поколения устойчивых линий TetResponder, которая доступна из лаборатории Weidinger по запросу (Weidinger лаборатории плазмиды базы данных нет; 1444 рис 1E.). Эта конструкция содержит Тетрациклин оператора, после чего полилинкерной области облегчающий введение кодирующих последовательностей (CDS) на интересующего гена и кодирующей последовательности YFP-производное YPet. Таким образом, конструкция предназначена для Тета-опосредованной экспрессии С-концевого слияния интересующего белка с YPet. Если выражение меченого слитого белка следует избегать, P2A или T2a пептид может быть введен с интересующего гена CDS, что облегчает совместное экспрессии интересующего белка и YPet в виде отдельных полипептидов 6,10.
- Генерация TetResponder конструкции
- Клонов компакт-дисков интересующего гена 3 'оператора тетрациклинаи 5 'СРС YPet соответствии со стандартными процедурами. Убедитесь, что стоп-кодон был удален из представляющего интерес гена CDS.
- Подготовка токсин бесплатно препараты плазмидной ДНК, используя имеющиеся в продаже наборы.
- Создание трансгенных линий TetResponder рыбы
- Выполнение микроинъекции TetResponder построить в соответствии со стандартными процедурами 9.
- Вводят 25-50 мкг плазмидной ДНК в цитоплазму эмбрионов один-клеточной стадии вместе с колпачком-смысловой РНК, кодирующей tol2 транспозазы для транспозонов-опосредованной трансгенеза или с I-SCEI фермента для meganuclease автоматизированного трансгенеза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Соображения по выбору метода трансгенеза можно найти в разделе обсуждение.
Примечание: Вводят предпочтительно в цитоплазму, а не желтка, поскольку эффективность трансгенеза может уменьшаться, когда ДНК не доставлен в цитоплазму.
- Вводят 25-50 мкг плазмидной ДНК в цитоплазму эмбрионов один-клеточной стадии вместе с колпачком-смысловой РНК, кодирующей tol2 транспозазы для транспозонов-опосредованной трансгенеза или с I-SCEI фермента для meganuclease автоматизированного трансгенеза.
- Поднять инъекционные эмбрионов G0 вdulthood.
- Оценка успешной интеграции зародышевой линии и индуцибельность трансгена в результате скрещивания индивидуальный G0 рыбу с ранее установленной TetActivator линии с последующим доксициклина лечения эмбрионов F1 или личинок F1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы используем убиквитин промоутер управляемой TetActivator линию (убиквитин: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2, короткие убикитина: Тета AmCyan 3) для выявления функциональных носителей TetResponder, а эта линия приводит довольно вездесущий выражение в эмбрионах и взрослых рыбы и, таким образом, хорошо подходит для оценки TetResponder индуцибельность во всех тканях, представляющих интерес. Эта линия доступна в лаборатории Weidinger по запросу. - Сбор эмбрионов каждого сцепления в отдельном 10 см чашки Петри, содержащей E3 эмбриона среды (см таблицу материалы) и инкубировать блюда на 28,5 ° C.
- Место G0 рыба, которая дала эмбрионов в отдельных пронумерованных резервуаров (ящики для рассады, см таблицу материалы) до тех пор, эмбрионы не было экранаредактор Это позволяет для восстановления G0 рыбы, которые показывают зародышей линии передачи трансгенов.
- Если только половина эмбрионов, как ожидается, носить TetActivator трансген (в случае гетерозиготного носительства TetActivator был подошел к TetResponder основателя рыбы), выбрать для эмбрионов, содержащих TetActivator трансген по внешнему виду флуоресценции AmCyan на соответствующей стадии развития.
- Вызвать транскрипционной активности TetActivator обработкой эмбрионов с доксициклина (DOX), как описано в разделе 2.3.
- Экран F1 эмбрионы для возникновения флуоресценции YPet. Предпочитаю линии (G0 рыба), которые производят однородную выражение YPet, что эмбрионы в кладке должны отображать немного мозаичность в пределах ожидаемого домена экспрессии и небольшим изменением между отдельными эмбрионами. См стрелок на рисунке 1F и 1G рис для представительных примеров.
- Мате G0 рыба передачи индуцибельную TetResponder трансген определены вшаг 2.2.8 дикого типа рыбы и поднять все эмбрионы F1 к взрослой жизни.
- Определить взрослых F1 трансгенных рыб либо с помощью ПЦР-генотипирования на основе (см раздел или пересечения отдельных рыб F1 в TetActivator линии с последующим DOX лечения эмбрионов F2 и появлением YPet флуоресценции (см раздел 2.5).
- Создание и характеризуют, по крайней мере 3 различных сублиний TetResponder полученные из разных основателя G0 рыбы, так как индуцируемость могут отличаться в отдельных линиях. В частности достижимых уровней экспрессии и является ли ответчик может быть активирована во всех типах клеток может изменяться. Кроме того, чувствительность к молчанию будет отличаться между линиями. Наконец, в некоторых случаях это может быть предпочтительным для выбора линий, которые опосредуют лишь умеренные уровни экспрессии интересующего белка, в частности, если вытекающей выражение производится в сочетании с TetActivator линии в отсутствие доксициклина, как ожидается, вызвать дефекты развития или токсичности.
ПРИМЕЧАНИЕ: ТетОтветчик линии, которые решительно индуцируемый в эмбрионах могут быть частично или полностью подавлен в поздней стадии личинок или взрослых рыб. Таким образом, если линии предназначены для использования у взрослых рыб, несколько независимых линий должны быть охарактеризованы на индуцибельности у взрослых. Если индукция интересующего гена совместим с дальнейшим развитием, было доказано, полезно создать двойные трансгенные эмбрионы (TetActivator х TetResponder), чтобы вызвать экспрессию ГОИ в эмбрионах и для выбора и повысить только лицам, показывающие самые надежные и наименее мозаику индукция. - Для поддержания и распространять установленные TetResponder линии, генотип взрослых рыб, как описано в разделе 2.5).
- Выполнение микроинъекции TetResponder построить в соответствии со стандартными процедурами 9.
- Доксициклин лечение эмбрионов
- Подготовка 2,000x доксициклин (DOX) запасов. Решить DOX в 50% EtOH, чтобы достичь концентрации 50 мг / мл (97 мМ). Магазин DOX запасы защищенном от света месте при температуре -20 ° С.
- Слейте большинство E3 среды из эмбрионов и заменить егоЕ3 эмбриона среде, содержащей DOX в конечной концентрации 25 мкг / мл DOX (2,5 мкл 2,000x DOX складе в 50 мл Е3). Dechorionation не требуется.
- Возврат эмбрионов до 28,5 ° С в течение как минимум 6 часов, прежде чем оценки экспрессии меченых интересующего гена по внешнему виду флуоресценции YPet.
- Оценка неплотности в TetActivator / TetResponder сочетании обработкой эмбрионов только этанол растворителя.
Примечание: в гибридизация (ISH) или ОТ-ПЦР для обнаружения TetResponder мРНК может быть использован в качестве наиболее чувствительных показателей неплотности чем флуоресценции меченых интересующего гена. Степень негерметичности будет зависеть от конкретного TetActivator / TetResponder сочетании линии, а также может варьироваться от тканей и стадий развития.
- Анестезия взрослых рыбок данио
- Подготовьте диаметром 10 см чашки Петри или небольшой стакан, наполненный системы рыб воды, содержащей 1 мг / мл Tricaine (этил-3-аминобензойной кислоты methanesulfonate, МС-222).
- Перевести рыбу контейнер, содержащий анестетика и подождите, пока он не достигнет уровня 4 анестезии, как указано полной потерей равновесия (рыба лежит на боку), не движений и без ответа на прикосновения 11.
- Тщательно передачи рыбу с помощью пинцета или ложку на предметное стекло, крышку от пластиковой чашке Петри или в агарозном покрытием Петри и выполнять плавник ампутации или изображений (см раздел 3.2).
- Возвращение рыбы в контейнер, содержащий большой объем свежей рыбы системы воды и контролировать его. Если движения жаберных не возобновить в течение 3 мин, помощь путем продувки водой жабры с использованием пластиковых передачи пипетки.
- ПЦР-генотипирование на основе TetResponder рыбы
- Выполните частичной ампутации хвостового плавника 12. Поместите рыбу в отдельных пронумерованных, танков (разведение коробки, см таблицу материалы). Это позволяет для восстановления трансгенных рыб после успешного генотипирования.
- Траnsfer плавник ткани на отдельные лунки 96-луночного ПЦР пластины предварительно заполнены 20 мкл ДНКазы без воды для выделения геномной ДНК 13.
- Добавить 120 мкл 1 М NaOH в каждую лунку и инкубируют образцы в течение 20 мин при 95 ° С с использованием Термоциклер.
- Образцы Холод до 4 ° С, добавить 14 мкл 1 М Трис-HCl (рН 8,0) в каждую лунку, и кратко вихревые образцы. Центрифуга образцы в течение 5 мин при 16000 х г для осаждения клеточного дебриса. Хранить геномной ДНК при 4 ° С до использования.
- Дизайн праймеров для амплификации специально фрагмент TetResponder трансгена. Используйте 2 мкл выделенной ДНК в стандартной реакции ПЦР и анализа ПЦР-продукта на агарозном геле.
3. Тканеспецифическая Индукционная трансгенных выражение в взрослых данио рерио Восстанавливающий хвостовой плавник
- Создание TetActivator; TetResponder двойной трансгенных рыб
- Mate TetActivator носители с TetResponder CARRIERS.
- Выберите эмбрионы, несущие трансген TetActivator на стадии развития, когда регуляторные элементы вождения TetActivator кассету активны. Трансгенные эмбрионы могут быть легко идентифицированы по внешнему виду флуоресценции AmCyan помощью стерео флуоресцентного микроскопа.
Может быть альтернативно определены TetActivator трансгенные-положительных рыба во взрослом возрасте визуализации наркозом рыбы, например: Примечание. следующая ампутации хвостового плавника и появление AmCyan флуоресценции в регенерата. - Поднять выбранные эмбрионы к взрослой жизни.
- Определить двойной трансгенной взрослых рыб (рыбы, которые несут TetResponder в дополнение к TetActivator) с помощью ПЦР на основе генотипирования или (предпочтительно) по их способности индуцировать экспрессию TetResponder в интересующей ткани. Протокол TetResponder индукции и обнаружении в регенерации хвостового плавника описано в разделе 2.3 и разделе 4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если переходный выражение TetResponder совместимс последующим эмбриональной или личиночной стадии, это полезно для выявления двойных трансгенных эмбрионов, несущих TetActivator и TetResponder трансгенов после лечения DOX во время эмбрионального развития, как описано выше (раздел 2.3, рис 1H). Двухместные положительные эмбрионы показать AmCyan и YPet флуоресценции. Поднять положительные эмбрионов к взрослой жизни.
- Ампутация данио хвостовой плавники и индукция экспрессии трансгенов в регенерирующей плавника
- Выполните частичной ампутации хвостового плавника на наркозом рыбы (см раздел 2.4) 12. Лечить рыбу либо сразу с DOX или вернуть их в систему рыба жилья.
- Подготовьте разведение коробка (рис 2А, см таблицу материалы), наполненный 1 л воды в системе, содержащей 25 рыб мкг / мл DOX (добавить 500 мкл 2,000x 50 мг / мл складе 1 л воды в системе рыбного).
Примечание: Индукция экспрессии трансгена сразу после ампутации позволяет такжеsessment воздействия на ранних событий во время регенерации, в то время как индукция в 3 дня после ампутации (3 ДПА) должны быть использованы для оценки экспрессии трансгена или функцию во время восстановительного роста. - Трансфер до 10 ранее ампутированной, двойной трансгенных рыб на поле размножения и тесном ящике с крышкой, так что рыба не может избежать (рис 2А).
- Поместите ящики для рассады в темноте, чтобы снизить уровень стресса. Мы обычно размещают коробки в 28,5 ° C воздуха инкубатора, чтобы обеспечить постоянную темноту и температуры.
- Лечить отрицательного контроля двойной трансгенной рыбы с этанолом только (250 мкл в системе вода 1L рыбы).
Примечание: Одно или трансгенная дикого типа рыбы обрабатывают DOX может быть использован в качестве дополнительного отрицательного контроля, хотя мы никогда не наблюдали побочных эффектов доз DOX используемых здесь, на ребра регенерации. - Обезболить рыбу, как описано в разделе 2.4 и передачи рыбы пинцетом или ложкой на смоченной в агарозном покрытием Петри блюдо. Тщательно распространять хвостовой плавник с помощью пинцета.
- Экран рыбы для появления YPet в возрожденных с помощью флуоресцентного микроскопа стерео-(рис 2B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, TetResponder приводом флуоресценция может быть энергично наблюдается после 6 часов лечения DOX. Тем не менее, мы рекомендуем, чтобы охарактеризовать динамику выражения TetResponder для каждой линии генерируемого. - Вернуться рыбу в системе жилищного рыбы прекратить TetResponder индукции трансгена или продолжить лечение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лечения> 24 ч (долгосрочные процедуры) важно для обмена воды и тщательно очистите ящики для рассады в день. - Во время длительного лечения, питания рыб каждые 2-3 дней по передаче рыбу в чистую емкость с водой системы свежей рыбы перед их возвращением ящики для рассады после кормления.
4. Характеристика TetResponder слова в Fin восстанавливает
т "> Примечание:. Мы обычно проверить экспрессию гена тканеспецифичную в регенерации хвостового плавника с использованием флуоресцентного визуализации криосрезов на 3 DPA В этот момент времени различные ткани отсеков в регенерата сформировали и может быть четко определены ткани сечений, и cryosectioning проще, чем на более поздних этапах регенерации. фиг.2С изображает домены ткани, которую можно отличить в регенерации и перечислены несколько молекулярных маркеров для этих доменов. Следующий протокол описывает получение продольных или поперечных криосрезах для прямой визуализации или иммунное окрашивание ,- Cryosectioning взрослых хвостовой плавники
- Лечить рыбу, чьи хвостовые плавники не были ампутированы от 2 до 3 DPA DPA с DOX, как описано в разделе 3.2
- Обезболить рыбу, как описано в разделе 2.4
- Используйте ложку или пинцета перенести рыбу на крышке пластиковой чашке Петри.
- Re-ампутировать плавник регенерировать около 4-5 костной сегментес проксимальнее начальной ампутации плоскости с помощью скальпеля и вернуть рыбу свежей рыбы системы водой.
- Тщательно передачи восстанавливает в небольшую чашку Петри (например, 35 мм), содержащего 4% (вес / объем) параформальдегида (PFA) в 1x фосфатном буферном растворе (PBS, см таблицу материалов) с использованием тонких пинцетом. Не прикасайтесь к регенерировать, но только пень часть ткани.
- Поместите ткань на плоскую чашку Петри нижней и закрепить O / N при 4 ° С.
- Промыть восстанавливает два раза в 1X PBS, содержащим 0,1% Tween (РВТ), чтобы удалить PFA и инкубировать восстанавливает O / N при 4 ° С в 0,5 М ЭДТА-PBS (рН 7,5), чтобы удалить известковые отложения костный матрикс.
- Инкубируют при комнатной температуре регенерирует в 10% сахарозы PBS, 20% сахарозы-PBS, 30% сахарозы-PBS и 30% сахарозы PBS: замораживание ткани среде при соотношении 1: 1 (МТФ; смотри таблицу материалов) в течение 30 мин каждый. Впоследствии, инкубировать плавники при 4 ° С в течение> 2 часов в морозильную ткани среде.
- Поместите cryomolds на предметное стекло и заполнитьм со средой замораживания тканей. Избегать введения пузырьков воздуха.
- Передача восстанавливает в cryomolds и ориентировать ткани надлежащим образом, чтобы получить продольные или поперечные сечения ребер регенератов (рис 2D). Убедитесь, что регенерировать прямо, что облегчает секционирования.
- Передача cryomolds вместе с стекло микроскопа на металлическую стойку, расположенной на подушке из сухого льда, чтобы начать процесс застывания (рис 2D).
- После замораживания тканей среда становятся твердыми, место cryomold на скамейке, и пусть сидят при комнатной температуре в течение нескольких минут, так что ткань замораживания среду тает на пластиковой среднего интерфейсом.
- Используйте ручку или подобный, чтобы подтолкнуть замороженного блока из cryomold. Храните cryoblocks в коробке на -80 ° С до ткани срезов.
- Подготовьте 10-14 мкм криосрезы помощью крио-микротома и собирать разделы по адгезии микроскопа (см таблицу материалы). Храните слайды при температуре -20 ° С до пеEDED.
- Характеристика выражения TetResponder на плавниках разделах на основе флуоресценции YPet
- Treat плавник секции в течение 30 мин с 100% MeOH охлаждают до -20 ° С, чтобы улучшить сцепление на предметное стекло микроскопа с последующими двумя промывками при комнатной температуре в PBT и 1 стирки в PBS, 5 мин каждый.
- Визуализация ядра путем инкубации секций в течение 10 мин в 4 ', 6-диамидино-2-phenylinodole (Dapi) в PBS (1: 5000) с последующими двумя промывками 10 мин каждый в PBS.
- Mount разделы 75% глицерина PBS или коммерчески доступные antifade крепления, и крышка с крышкой слайд.
- Изображение YPet и AmCyan флуоресценции под конфокальной или широким полем флуоресцентного микроскопа (рис 1E).
Примечание: Для облегчения однозначной идентификации типов клеток, экспрессирующих YPet, иммунофлюоресценции или иммуногистохимии с антителами против специфических антигенов камерного типа вместе с анти-GFP антител (которые реагируют с YPet, но не AmCyan) может быть выполнена, Кроме того, для облегчения обнаружения слабого выражения YPet, РНК гибридизация против YPet РНК может быть выполнена либо на весь монтажа плавники или парафиновых срезов плавников.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы установить функциональную систему Титон для выражения гена индуцируемой тканеспецифической, трансгенных TetActivator и TetResponder строк, должны быть получены (1А). Это достигается путем microinjecting TetActivator (рис 1B - C) или TetResponder (рис 1E) строит в начале эмбрионов данио и последующей интеграции зародышевой линии. Функциональные TetActivator конструкции могут быть либо генерируется путем клонирования коротких регуляторных последовательностей (Элементы-усилители) вверх по течению TetActivator кассеты (Фиг.1В), или путем рекомбинации с TetActivator кассету в BAC, содержащей регуляторные элементы интересующего гена (рис 1С). Интеграция зародышевую линию TetActivator конструкции может быть оценена путем скрещивания индивидуальный вводили G0 рыбу и внешний вид флуоресценции AmCyan в эмбрионах F1 в ожидаемом паттерна экспрессии (рис 1D). Половые INTEGРацион и функциональность TetResponder трансгена может быть оценена путем скрещивания индивидуальный G0 вводят рыбу, установленном TetActivator рыбы (здесь убиквитин: Тета AmCyan), с последующей обработкой DOX и внешний вид YFP / YPet флуоресценции (рис 1F). Рыба, показывая сильную и однородную выражение YFP / YPet следует предпочесть создать стабильную линию TetResponder (рис 1G). Установив стабильный TetActivator и TetResponder рыбы линии, конкретные комбинации TetActivator / TetResponder могут быть получены путем скрещивания. Могут быть определены Носители TetActiator и TetResponder трансгенов во время эмбриогенеза следующее лечение DOX конец появлению YFP / Ypet на стадии развития TetActivator активен (рис 1H). Кроме того, двойные трансгенные рыбы могут быть определены после лечения DOX и TetResponder трансгенной индукции в регенерирующей хвостового плавника (рис 2А - B).
< р = класс "jove_content"> Мы регулярно использовать эту систему для достижения индуцибельную, тканеспецифичную экспрессию генов в регенерирующей данио хвостового плавника. Проверим тканеспецифичную TetResponder трансгенный выражение по флуоресценции визуализации криосрезов от 3 DPA плавника регенерирует, поскольку разные ткани отсеков в регенерата может быть четко определены ткани сечений в этой временной точке (рис 2С). Вдоль или поперек ребра регенерируют разделы получаются cryosectioning после cryoprotecting ткани и вложение плавник регенерации соответствующим (рис 2D). После секционирования, TetResponder трансген выражение (Ypet / YFP флуоресценции) могут быть отображены с помощью флуоресценции или конфокальной микроскопии (рис 2E). Обратите внимание, что her4.3 промотор-приводом TetActivator вызывает TetResponder выражение в проксимальных медиальной бластеме, в то время как дистальная бластема (стрелка) и эпидермис (стрелка) лишены выражения. ove_content ">
Рисунок 1: Создание трансгенных TetActivator и TetResponder линий. () Мультфильм показывает стратегию для экспрессии гена, индуцируемого тканеспецифической с использованием системы Титон. (Б) Трансгенные TetActivator построить (Вайдингер лаборатории базы данных плазмиды нет. 1247). Полилинкерная 5 'от TetActivator irtTAM2 (3F) облегчает Cloning регуляторных последовательностей, представляющих интерес. Последовательность, кодирующую AmCyan отделена от TetActivator через P2A 'саморасщепляющиеся' пептида. Кассета также содержит SV40 сигнал полиаденилирования, в окружении Tol2 транспозонов инвертированных повторов и содержит один сайт узнавания meganuclease я-SCEI. (С) TetActivator кассета для ВАС recombineering (Вайдингер лаборатории базы данных плазмиды нет. 1180). Кассета включает в себя ген канамицину для отбора, который приводится в действие GB3 прокариотической промотора. FRT сайты фланговые гена устойчивости к канамицину позволяют его Flp-рекомбиназы опосредованного удаления следующие успешной интеграции в BAC. (D) Идентификация G0 основателя рыбы, передающей her4.3: Тета AmCyan построить через зародышевой линии. Перевозчики определены с помощью появлением AmCyan флуоресценции в некоторых F1 эмбрионов (наконечники стрел). (Е) Трансгенные TetResponder построить (Вайдингер лаборатории базы данных плазмиды нет. 1444).Это создает состоит из полилинкер и YPet CDS под управлением оптимизированных элементов реагирования Tet (TetRE-плотно, Clontech), и прекращается по сигналу полиаденилирования SV40. Это в окружении Tol2 транспозонов инвертированных повторов и содержит один сайт узнавания meganuclease я-SCEI. (F), Идентификация G0 основателя рыбы передачи функциональной TetResponder TetRE: Axin1-YFP построить через зародышевой линии. Перевозчики определены путем скрещивания с установленным TetActivator линии (здесь убиквитиновой: Тета AmCyan) и индукции флуоресценции YFP после лечения DOX в течение 6 ч (стрелки). (G) Закрыть ofembryos, показанные в (F) после в общей сложности 12 часов лечения DOX. Примечание довольно вездесущий индукции флуоресценции YFP. (Н) Выявление двойных трансгенных эмбрионов, несущих TetActivator (her4.3: Тета AmCyan) и TetResponder (TetRE: Axin1-YFP) трансгены (наконечники стрел). Эмбрионы мыповторно обрабатывали DOX в течение 6 ч. (- Н) Масштаб бар: 500 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Использование системы Титон для экспрессии гена тканеспецифической в регенерации данио хвостового плавника. (A) Разведение коробки, используемые для лечения DOX взрослых данио. (Б) Индукция TetRE: Axin1-YFP TetResponder трансген по her4.3: Тета AmCyan TetActivatorв регенерации хвостового плавника следующие 12 ч лечения DOX. Обратите внимание на отсутствие флуоресценции YFP в EtOH обрабатывают управления рыбы. (С) мультфильмов изображением некоторых тканях, найденных в ребра регенерата на 3 DPA в продольном разрезе. (D), подготовка проб для cryosectioning. Fin регенерирует помещают в ткани-замораживания среды (МТФ) с наполнением cryomolds, ориентированные соответственно, чтобы получить либо продольных или поперечных секций регенерата, и переносили в металлической стойке сидит на верхней части сухим льдом до тех пор, TFM не затвердеет. Секционирование самолет отмечены красным. Сокращения: DIST .: дистальной, Prox .: проксимальных, вентиляционные .: вентральной, DORS .: спинной. (Е) конфокальной изображение флуоресценции YFP в продольном сечении ребра лучей регенерата, полученного из ребер, показанных на (В). Обратите внимание, что her4.3: Тета AmCyan TetActivator линии приводит индукции YFP специально в проксимальных медиальной бластеме. YFPфлуоресценции не обнаружен в различных отсеках, в том числе раневых эпидермиса (стрелки) и дистальной крайнего домена мезенхимы (стрелки) (БК) масштабную линейку: 500 мкм; (Е) Масштаб бар:. 100 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| TetActivator линия | Ссылка | Регуляторные элементы используются | В первую очередь выражается в |
| 7xTCF-Xla.Siam: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan | Венер и Вайдингер, неопубликованные | 7xTCF-Xla.Siam Wnt репортер 1 | Wnt-чувствительных тканей |
| myl7: irtTAM2 (3F) -p2a-mCherry | Гаазе и Вайдингер, неопубликованные | myl7 (cmlc2) 2 | зрелые кардиомиоциты |
| her4.3: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm6 | 3 | her4.3 4 | Центральная нервная система |
| keratin4: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm5 | 3 | keratin4 5 | эпидермис, во взрослом плавника без базального слоя |
| keratin18: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm4 | 3 | keratin18 6 | эпидермис, во взрослом плавника исключительно в базального слоя |
| sp7: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm3 | 3 | sp7 / OSX 7 | (Приверженность) остеобласты |
| убикитина: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2 | 3 | убикитина 8 | (Довольно) повсеместно |
Таблица 1:. Доступные трансгенные линии TetActivator В этой таблице перечислены трансгенной TetActivaTor линии тканеспецифической выражения TetActivator как в эмбриональных и взрослых рыб, которые доступны из лаборатории Weidinger по запросу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Взрослый данио обладает удивительной способностью успешно регенерировать много внутренних органов и придатков. Глубокое понимание молекулярных и клеточных механизмов, участвующих требуется тканеспецифичную анализ функций генов и сигнальных путей. К этому, система Титон обеспечивает эффективный инструмент для spatiotemporally контролируемой экспрессии генов в эмбриональных и взрослых данио. Система Титон конструкции и методология, описанные в этой рукописи были успешно использованы в недавнем исследовании нашей лаборатории 3. Следующие дополнительные вопросы должны быть рассмотрены при установлении системы Титон:
TetActivator соображения дизайна трансген
Ранее мы показали, что один индуцируемый TetActivator состоящий из М2 мутантного варианта обратной Tet-репрессора домена, слитого с вирусом простого герпеса VP16 трансактивации домена производным 3F [irtTAM2 (3F), яп короткого Тета-M2] дает эффективное индукции, но может показать низкий, хотя измеримого неплотности, то есть фон индуцирующей активности в отсутствие доксициклина (DOX) 5. Таким образом, мы описали дуально индуцируемые системы, использующие слитые с глюкокортикоидного рецептора (Тета-ГПБ) или доменом рецептора экдизоном (Тета-ECR), которые устраняют неплотности 5. Таким образом, если система будет использоваться, чтобы выразить токсичные или очень мощные белки (например, онкогенов) использование двойственно индуцибельного варианта должны быть рассмотрены. Кроме того, при установлении TetActivator и TetResponder линий диапазон линий, производящих разные уровни экспрессии могут быть выбраны и слабые индукторы выбранные в случае негерметичности является проблема с сильно вызывающих линий. TetActivator конструкции, содержащие вариант Тета-ГПБ или тета-ECR доступны из лаборатории Weidinger по запросу.
Методы трансгенез для получения трансгенных данио линий
TetResponder анализ экспрессии трансгенов
Для обнаружения тканеспецифичную TetResponder трансгенный выражение у взрослых плавники мы обычно используем флуоресцентный визуализации криосрезов. По нашему опыту, флуоресценции флуоресцентных белков, выраженных трансгена сохраняется в течение fixatioн и cryosectioning процедуру и, таким образом, могут быть непосредственно отображены. Дополнительные методы обнаружения TetResponder выражения, которые были описаны в другом месте, являются: I) иммунным на участках, предпочтительно от флуоресцентного белка тега, здесь YPet, используя анти-GFP антитела, II) флуоресцентный или хромогенный ISH на участках, или III ) Весь монтажа ISH последующим секционирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Криста Гаазе, Дорис Вебер и Брижит Korte для оказания технической помощи. Работа в лаборатории Weidinger поддерживается грантами Немецкого исследовательского WE 4223 / 3-1, мы 4223 / 4-1 и Немецким обществом по Kardiologie через Oskar-Lapp-стипендию и Клаус-Георг-унд-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g., Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5,000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g., Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317 (2014).
- Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
- Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610 (2007).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
- Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).
