Introduction
Den zebrafisk är en väletablerad ryggradsdjur modellorganism för att studera många aspekter av utveckling, fysiologi, sjukdomar och förnyelse. Med den växande antagandet av zebrafisk som en modell för post-embryonala biologiska processer, experimentella verktyg för inducerbar, vävnadsspecifik manipulering av genuttryck eller signalvägar har blivit allt viktigare. I synnerhet har studier i orgel och bihang förnyelse i vuxen zebrafisk lidit av en brist på verktyg för dissekering av de spatio-temporala krav på signalvägar under dessa regenerativa processer.
För närvarande har tre olika system använts för att åstadkomma villkorlig, vävnadsspecifik genexpression i regenererande organ av vuxna zebrafisk: Cre-lox-systemet, mosaik uttryck av värmechocks inducerbara transgener med användning av transposon-medierad somatisk transgenes, och Teton systemet 1 -3. Teton avser en variant av en tetracyklin-kontrullade aktiveringssystem transkriptionell, där uttryckning aktiveras i närvaro av antibiotikumet tetracyklin eller ett derivat, t ex doxycyklin. Cre-lox-systemet, eftersom det hittills använts i vuxen fisk, bygger på en Tamoxifen styrd Cre rekombinas (CreERT2), vars uttryck är rumsligt begränsad av vävnadsspecifika regulatoriska element. Cre-driven avlägsnande av en STOP-kassett underlättar expression av genen av intresse driven av en promotor som ska vara aktiv i alla celltyper 1. Transposon-medierad skapa mosaically uttryckta somatiska transgener tillhandahåller ett system för inducerbar transgenexpression i enskilda cellinjer. Injektion av zebrafiskembryon med Tol2 transposon bär en gen av intresse under transkriptionskontroll av en värmechockspromotorresulterar i chimära individer typiskt bär transgenen endast i diskreta cell linjer av en regenererande organet 2. Även om båda systemen tillåter villkorlig vävnads specifik genuttryck är Cre-lox systemet inte reversibel, och strategin med hjälp av transposon-baserade klonal märkning lider av sin stokastiska natur. Alltså, vi och andra har nyligen anpassat transgena Teton system för användning i zebrafisk, som underlättar temporärt och spatialt kontrollerad genuttryck som är ett tillägg avstämbar och reversibel 3-5.
Teton system som används här innefattar en transgen föraruppställning (TetActivator) i vilken en Doxycyklin (DOX) -inducerbara transkriptionsaktivator (förbättrad omvänd tetracyklin trans, irtTA, kort Teta) står under kontroll av vävnadsspecifika iska regulatoriska sekvenser. För det andra krävs det en transgen responder linje (TetResponder) som hyser en gen av intresse under transkriptionskontroll av Tetracyklin operatören (Tet svarselementet; Tetre) (Figur 1A). Således, användning av specifika kombinationer av TetActivator och TetResponder linjer möjliggör villkorvävnadsspecifikafic manipulering av genuttryck.
Vi har nyligen utnyttjat Teton systemet att söka för vävnadsspecifika funktioner Wnt / beta-catenin signalering i vuxen regenererande zebrafisk stjärtfenan 3. I det protokoll som beskrivs här beskriver vi ett arbetsflöde för installation och användning av Teton systemet zebrafisk, särskilt när det gäller studier av fin förnyelse. Detta inkluderar detaljerade instruktioner om hur man skapar stabila transgena TetActivator och TetResponder linjer och ett protokoll för transgen induktion hos embryon och vuxna zebrafisk. Dessutom beskriver vi metoder för verifiering av vävnadsspecifika genuttryck i fin pånyttfödda, inklusive ett protokoll för framställning av kryosnitt av vuxna zebrafisk fenor. Dessutom diskuterar vi överväganden för utformningen av TetActivator transgenen, valet av en transgenes metod, och detektion av TetResponder uttryckning. Därför är det övergripande målet med detta protokoll att fungera som en blåkopiaför att inrätta en funktionell teton system zebrafisk att uppnå villkorlig vävnadsspecifik genexpression, som kan tillämpas på alla vävnader av intresse.
Vi har skapat en TetActivator vektor medger I-SCEI eller Tol2-medierad generation stabila TetActivator linjer med korta genomiska regulatoriska sekvenser (förstärkare fragment, Weidinger lab plasmid databas nr 1247;. Figur 1B). Denna konstruktion innehåller en TetActivator kassett bestående av M2 muterade varianten av den omvända Tet repressordomänen smält med Herpes simplex virus VP16 transdomän derivat 3F [irtTAM2 (3F)]. Expression av TetActivator (TETA) kan lätt övervakas eftersom det samuttrycks med fluoroforen AmCyan från samma öppna läsram; en P2A peptid medierar ribosomalt hoppa, vilket bör leda till produktion av Teta och AmCyan som separata proteiner vid en 1: 1-förhållande 5,6. Konstruktet innehåller också en poylinker 5 'av TetActivator kassett för att underlätta insättning av genomiska regulatoriska sekvenser av intresse med användning av konventionella kloningsmetoder.
Dessutom har vi skapat en konstruktion bestående av ovan beskrivna TetActivator kassett plus en kanamycinselektion kassett (Weidinger lab plasmid databas nr 1180, Fig. 1C), som kan rekombineras i en bakteriell artificiell kromosom (BAC) som innehåller en stor genomregion ( vanligen i startkodonet i en gen vars uttrycksmönster skall imiteras av transgenen). Båda konstruktioner är tillgängliga från Weidinger labbet på begäran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av transgena TetActivator Fish Lines
- Generation av TetActivator konstruktion
- Clone regulatoriska sekvenser av intresse uppströms om TetActivator kassetten i vektor # 1247 med användning av standardtekniker. Alternativt kan du använda rekombinationstekniker för att generera en BAC, i vilken TetActivator kassetten (vektor # 1180) införs i det första exonet av målgenen, och där Tol2 inverterade upprepningar införs i BAC huvudkedjan (för en detaljerad recombineering protokoll se 7,8).
- Förbered giftfri plasmid DNA eller BAC DNA-preparat med användning av kommersiellt tillgängliga kit.
- Framställning av transgen TetActivator fisk linjer
- Utför mikroinjektion av TetActivator konstruktionen enligt standardförfaranden 9.
- Injicera 25-50 ug av plasmid-DNA eller upp till 250 pg BAC-DNA till embryon en-cellstadiet tillsammans med capped sens-RNA som kodar för tol2 transposase för transposon-medierad genmodifiering, eller med I-SCEI protein för I-SCEI-medierad genmodifiering.
OBS: Överväganden om valet av genmodifiering metod kan hittas i diskussionsavsnittet.
OBS: Injicera företrädesvis in i cytoplasman, inte äggulan, eftersom effektiviteten för transgenes kan minska när DNA inte levereras in i cytoplasman.
- Injicera 25-50 ug av plasmid-DNA eller upp till 250 pg BAC-DNA till embryon en-cellstadiet tillsammans med capped sens-RNA som kodar för tol2 transposase för transposon-medierad genmodifiering, eller med I-SCEI protein för I-SCEI-medierad genmodifiering.
- Höj injicerade G0 embryon till vuxen ålder. Eventuellt skärm G0 embryon för AmCyan fluorescens och företrädesvis växa embryon som visar det önskade uttrycksmönster. Detta kan öka graden av bakterie line överföring, i synnerhet för Tol2-medierad genmodifiering.
- Bedöm framgångsrik integration grodden-linje genom att korsningspotential individuell G0 fisk till vildtyp fisk och utseende AmCyan fluorescens i den förväntade uttrycksmönster i embryon F1 eller larver med användning av en fluorescerande stereomikroskop (exempel visas i figur 1D).
- Höj fluorescens-positivaF1 embryon till vuxen ålder och para dem med vild-typ fisk för att få en stabil F2 transgen fisk.
- Höj och karaktärisera åtminstone tre olika sublinjer härledda från olika G0 grundare fisk, eftersom individuella linjer variera i expressionsnivåer, uttrycksmönster, förmåga att inducera TetResponder linjer, läckage, och deras känslighet för ljuddämpning.
OBS: Många transgener som kraftfullt uttrycks i embryon är antingen helt eller delvis tystas i sent skede larver eller vuxna fiskar. Således, om linjer är avsedda att användas i vuxen fisk, karaktärisera flera oberoende linjer för deras TetActivator uttryck och funktion i vuxen ålder.
OBS: Vi har genererat en panel av TetActivator linjer för vävnadsspecifika uttryck för TetActivator både embryon och vuxna fiskar, som anges i tabell 1 Dessa rader är tillgängliga från Weidinger labbet på begäran..
- Utför mikroinjektion av TetActivator konstruktionen enligt standardförfaranden 9.
2. Framställning av transgena TetResponder Fish Linjer
OBS: Vi har genererat en TetResponder konstrukt möjliggör I-SCEI eller Tol2-förmedlad generering av stabila TetResponder linjer, som är tillgänglig från Weidinger labbet på begäran (Weidinger labb plasmiden databas nr 1444, Figur 1E.). Denna konstruktion innehåller en tetracyklin operatör, följt av en polylinkerregion som underlättar införingen av kodande sekvenser (CDS) av en gen av intresse och YFP-derivatet YPet kodande sekvensen. Sålunda är konstruktionen utformad för Teta-förmedlad expression av en C-terminal fusion av proteinet av intresse med YPet. Om expression av ett taggat fusionsprotein måste undvikas, kan en P2A eller T2A peptiden införas med genen av intresse CDS, vilket underlättar samuttryck av proteinet av intresse och YPet som separata polypeptider 6,10.
- Generation av TetResponder konstruktion
- Clone CDS av genen av intresse 3 'av Tetracyklin operatöroch 5 'av YPet CDS enligt standardprocedurer. Säkerställ att stoppkodonet har avlägsnats från den intressanta genen CDS.
- Förbered giftfria plasmid DNA-preparat med användning av kommersiellt tillgängliga kit.
- Framställning av transgen TetResponder fisk linjer
- Utför mikroinjektion av TetResponder konstruera enligt standardprocedurer 9.
- Injicera 25-50 ug av plasmid-DNA in i cytoplasman av embryon en-cellstadiet tillsammans med capped sens-RNA som kodar för tol2 transposas för transposon-medierad transgenes eller med I-SCEI enzym för meganuclease stödd transgenes.
OBS: Överväganden om valet av genmodifiering metod kan hittas i diskussionsavsnittet.
OBS: Injicera företrädesvis in i cytoplasman, inte äggulan, eftersom effektiviteten för transgenes kan minska när DNA inte levereras in i cytoplasman.
- Injicera 25-50 ug av plasmid-DNA in i cytoplasman av embryon en-cellstadiet tillsammans med capped sens-RNA som kodar för tol2 transposas för transposon-medierad transgenes eller med I-SCEI enzym för meganuclease stödd transgenes.
- Höj injicerade G0 embryon till endulthood.
- Bedöma framgångsrika bakterie-line integration och inducerbarhet av transgenen genom parning enskilda G0 fisk med en tidigare etablerad TetActivator linje följt av doxycyklin behandling av embryon F1 eller F1 larver.
OBS: Vanligtvis använder vi en ubikitinpromotorn driven TetActivator linje (ubiquitin: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2, kort ubiquitin: Teta AmCyan 3) för att screena för funktionella TetResponder bärare, eftersom denna linje driver ganska allestädes närvarande uttryck i embryon och vuxna fisk och därmed är väl lämpad att bedöma TetResponder inducerbarhet i alla vävnader av intresse. Denna linje är tillgänglig från Weidinger labbet på begäran. - Samla embryon från varje koppling i en separat 10 cm petriskål med E3 embryo medium (se Material tabell) och inkubera rätter vid 28,5 ° C.
- Placera G0 fisk som gav embryon i enskilda numrerade tankar (avels lådor, se Material tabell) tills embryon har varit skärmred. Detta gör det möjligt för återvinning av G0 fisk som visar könsceller överföring av transgenen.
- Om bara hälften av embryon förväntas bära TetActivator transgen (om en heterozygot TetActivator bärare korsades till en TetResponder grundare fisk), selektera för embryon som innehåller TetActivator transgen genom utseende AmCyan fluorescens vid lämplig utvecklingsstadiet.
- Framkalla TetActivator transkriptionsaktivitet genom att behandla embryon med doxycyklin (DOX) som beskrivs i avsnitt 2.3.
- Skärm F1 embryon för framväxten av YPet fluorescens. Föredrar linjer (G0 fisk) som producerar homogena YPet uttryck, det vill säga embryon i kopplingen ska visa lite mosaicism inom det förväntade uttryck domän och lite variation mellan enskilda embryon. Se pilspetsar i figur 1F och figur 1G för representativa exempel.
- Mate G0 fisk sänder en inducerbar TetResponder transgen identifierats isteg 2.2.8 med vild typ fiskar och ta upp alla F1 embryon till vuxen ålder.
- Identifiera vuxen F1 transgen fisk antingen genom PCR-baserad genotypning (se avsnitt eller genom att korsa individuell F1 fisk till en TetActivator linje följt av DOX behandling av F2 embryon och framväxten av YPet fluorescens (se avsnitt 2.5).
- Etablera och karakterisera åtminstone 3 olika TetResponder sublinjer härrör från olika G0 grundare fisk, eftersom inducerbarhet kan skilja sig i enskilda linjer. I synnerhet uppnåeliga uttrycksnivåer och om svars kan aktiveras i alla celltyper kan variera. Dessutom kommer känslighet för tysta skiljer sig mellan raderna. Slutligen, i vissa fall kan det vara bättre att välja linjer som förmedlar endast måttliga expressionsnivåer av proteinet av intresse, i synnerhet om läckande uttryck som produceras i kombination med en TetActivator linje i frånvaro av doxycyklin förväntas orsaka utvecklingsdefekter eller toxicitet.
OBS: TetSvars linjer som är kraftigt inducerbara i embryon kan antingen helt eller delvis tystas i sent skede larver eller vuxna fiskar. Således, om linjer är avsedda att användas i vuxen fisk, flera oberoende linjer bör kännetecknas för inducerbarhet hos vuxna. Om induktion av genen av intresse är förenligt med vidareutveckling, har det visat sig lämpligt att skapa dubbla transgena embryon (TetActivator x TetResponder), för att inducera indiska myndigheterna uttryck i embryon och för att välja och höja endast de personer som visar den mest stabila och minst mosaik induktion. - För att bibehålla och sprida etablerade TetResponder linjer, genotyp vuxen fisk som beskrivs i avsnitt 2.5).
- Utför mikroinjektion av TetResponder konstruera enligt standardprocedurer 9.
- Doxycyklin behandling av embryon
- Förbered 2,000x Doxycyklin (DOX) aktier. Lös DOX i 50% EtOH för att uppnå en koncentration av 50 mg / ml (97 mM). Store DOX lager skyddas från ljus vid -20 ° C.
- Häll majoriteten av E3 medium från embryon och ersätta det medE3 embryo medium innehållande DOX vid en slutlig koncentration av 25 | ig / ml DOX (2,5 pl av 2,000x DOX lager per 50 ml E3). Dechorionation krävs inte.
- Återgå embryon till 28,5 ° C under ett minimum av 6 h före bedömningen expression av den märkta genen av intresse genom uppträdandet av YPet fluorescens.
- Bedöma läckage av TetActivator / TetResponder kombination genom att behandla embryon med enbart EtOH lösningsmedel.
OBS: In situ-hybridisering (ISH) eller RT-PCR för att detektera TetResponder mRNA kan användas som mer känsliga mått på läckage än fluorescens hos den märkta genen av intresse. Graden av läckage kommer att bero på den speciella TetActivator / TetResponder linje kombinationen och det kan också variera mellan vävnader och utvecklingsstadier.
- Anestesi av vuxna zebrafisk
- Bered 10 cm diameter Petri-skål eller liten bägare fylld med fisksystemet vatten innehållande 1 mg / ml Tricaine (Etyl 3-aminobensoat methanesulfonate, MS-222).
- Överför fisk till behållare innehållande bedövningsmedel och vänta tills den når nivå 4 av anestesi som indikeras av total förlust av jämvikt (fisk ligger på sidan), inga rörelser och inget svar på röra 11.
- Försiktigt överföra fisk med hjälp av en pincett eller en sked på en glasskiva, locket på en petriskål av plast, eller agaros-belagda petriskål och utföra fin amputation eller avbildning (se avsnitt 3.2).
- Återgå fisk till en behållare som innehåller en stor volym av färsk fisk systemet vatten och övervaka det. Om gälar rörelser inte återupptas inom 3 minuter, hjälpa genom att blåsa vatten över gälarna med hjälp av en plast överföringspipett.
- PCR-baserad genotypning av TetResponder fisk
- Utför partiell amputation av stjärtfenan 12. Placera fisken i individuella, numrerade tankar (avels lådor, se Material tabell). Detta gör det möjligt för återvinning av transgen fisk efter framgångsrik genotypning.
- Transfer fena vävnader till individuella brunnar i en 96-brunnars PCR-platta förfylld med 20 | il DNas-fritt vatten för isolering av genomiskt DNA 13.
- Tillsätt 120 pl 1 M NaOH till varje brunn och inkubera prover för 20 min vid 95 ° C med hjälp av en termo.
- Chill prover till 4 ° C, tillsätt 14 | il av 1 M Tris-HCl (pH 8,0) till varje brunn, och kort virvel prover. Centrifugera prover under 5 min vid 16.000 xg för att pelletera cellrester. Förvara genomiskt DNA vid 4 ° C tills de behövdes.
- Design primrar för att specifikt amplifiera ett fragment av TetResponder transgenen. Använd 2 ul av isolerad DNA i en standard PCR-reaktion och analysera PCR-produkten på en agarosgel.
3. Vävnadsspecifik induktion av transgen expression i vuxen Regenerating Zebrafish Tail Fin
- Inrättande av TetActivator; TetResponder dubbel transgen fisk
- Mate TetActivator bärare med TetResponder Carriers.
- Välj embryon som bär TetActivator transgen på ett utvecklingsstadium när de regulatoriska elementen driver TetActivator kassetten är aktiva. Transgena embryon kan lätt identifieras genom utseende AmCyan fluorescens med hjälp av en stereo fluorescerande mikroskop.
OBS: TetActivator transgen-positiva fisk kan alternativt identifieras under vuxenlivet genom avbildning av sövda fisk, till exempel. efter amputation av stjärtfenan och framväxten av AmCyan fluorescens i pånyttfödda. - Höj utvalda embryon till vuxen ålder.
- Identifiera dubbel transgen vuxen fisk (fisk som bär TetResponder förutom TetActivator) genom PCR-baserad genotypning eller (företrädesvis) genom deras förmåga att inducera expression av TetResponder i vävnaden av intresse. Ett protokoll för TetResponder induktion och detektion i regenere stjärtfenan beskrivs i avsnitt 2.3 och avsnitt 4.
OBS: Om övergående TetResponder uttryck är kompatibelmed ytterligare embryonal eller larvutveckling, är det lämpligt att identifiera dubbla transgena embryon som bär TetActivator och TetResponder transgener efter DOX behandling under fosterutvecklingen, såsom beskrivits ovan (punkt 2.3, figur 1H). Dubbla positiva embryon visar AmCyan och YPet fluorescens. Höj positiva embryon till vuxen ålder.
- Amputation av zebrafisk svans fenor och induktion av transgen expression i regenere fin
- Utför partiell amputation av stjärtfenan på sövda fisk (se avsnitt 2.4) 12. Behandla fisken antingen omedelbart med DOX eller returnera dem till fisk inhysningssystem.
- Förbered avel låda (figur 2A; se Material tabell) fylld med ett L av fisk systemet vatten innehållande 25 ^ g / ml DOX (lägg 500 ul av 2,000x 50 mg / ml lager till ett L av fisk systemvatten).
OBS: Induktion av transgen expression omedelbart efter amputation möjliggör för sådömning av effekter på tidiga händelser under regenerering, medan induktion vid 3 dagar efter amputation (3 DPA) bör användas för att bedöma transgen expression eller funktion under regenerativ tillväxt. - Överför upp till 10 tidigare amputerade, dubbel transgen fisk till avelsboxen och nära låda med lock så att fisken inte kan fly (Figur 2A).
- Placera avels lådor i mörkret för att minska stress. Vi lägger oftast lådor i en 28,5 ° C luft inkubator för att säkerställa konstant mörker och temperatur.
- Behandla negativ kontroll dubbel transgen fisk med EtOH bara (250 pl per 1L fisk Vatten).
OBS: Singel transgena eller vildtyp fisk behandlad med DOX kan användas som ytterligare negativ kontroll, även om vi aldrig har sett negativa effekterna av DOX doser som används här på fin förnyelse. - Söva fisken som beskrivs i avsnitt 2.4 och överföra fisk med en pincett eller en sked på ett fuktat agaros belagd petri skålen. Spred försiktigt stjärtfenan med pincett.
- Skärm fisk för utseende YPet inom regeneratet med användning av en fluorescerande stereomikroskop (figur 2B).
OBS: Vanligtvis kan TetResponder driven fluorescens kraftigt observeras efter 6 h av DOX behandling. Vi rekommenderar dock att karakterisera dynamiken i TetResponder uttryck för varje linje genereras. - Återgå fisk till fisk inhysningssystem att avsluta TetResponder transgen induktion eller fortsätta behandlingar.
OBS: För behandlingar> 24 timmar (långtidsbehandling) är det viktigt att byta vatten och rengör avelslådor dagligen. - Under långtidsbehandling, foder fisk var 2-3 dagar genom att överföra fisk i en ren behållare med färsk fisk Vatten innan han återvände dem till avels lådor efter utfodring.
4. Karakterisering av TetResponder Expression i Fin Återskapar
t "> OBS!. Vi brukar kontrollera vävnadsspecifika genuttryck i regenere stjärtfenan med fluorescerande avbildning av kryosnitt på 3 dpa Vid denna tidpunkt de olika vävnads avdelningar som är pånyttfödda har bildats och tydligt kan identifieras på vävnadssektioner, och cryosectioning är enklare än i ett senare skede av förnyelse. Figur 2C visar vävnads domäner som kan urskiljas i de pånyttfödda och listar några molekylära markörer för dessa domäner. Följande protokoll beskriver framställningen av längsgående eller tvärgående kryosnitt direkt avbildning eller immunfärgning .- Cryosectioning av vuxna svans fenor
- Behandla fisk vars svans fenor amputerades från 2 dpa till 3 dpa med DOX som beskrivs i avsnitt 3.2
- Söva fisken som beskrivs i avsnitt 2.4
- Använd en sked eller pincett för att försiktigt överföra fisk på ett lock av plast petriskål.
- Åter amputera fin regenerera vid ca 4-5 benig segments proximal till den ursprungliga amputation planet med hjälp av en skalpell och tillbaka fisken till färsk fisk systemet vatten.
- Noggrant överföring regenererar till en liten petriskål (t.ex., 35 mm) innehållande 4% (vikt / volym) paraformaldehyd (PFA) i 1x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS; se Material tabell) med användning av fin pincett. Rör inte regeneratet men endast stubben del av vävnaden.
- Placera vävnad platt på petriskålen botten och fixa O / N vid 4 ° C.
- Tvätta regenererar två gånger i 1 x PBS innehållande 0,1% Tween (PBT) för avlägsnande av PFA och inkubera regenererar O / N vid 4 ° C i 0,5 M EDTA-PBS (pH 7,5) för att avkalka benmatris.
- Inkubera regenererar vid RT i 10% sukros-PBS, 20% sukros-PBS, 30% sackaros-PBS och 30% sackaros-PBS: vävnadsfrysmedium vid en 1: 1-förhållande (TFM; se Material tabell) under 30 min vardera. Därefter inkubera fenor vid 4 ° C under> 2 timmar i vävnad frysmedium.
- Placera cryomolds på ett objektglas och fyllam med vävnadsfrysmedium. Undvik att införa luftbubblor.
- Transfer regenererar i cryomolds och orientera vävnad lämpligt att erhålla längd eller tvärsektioner av fin regenererar (Figur 2D). Se till att regenerera är rak, vilket underlättar snittning.
- Överföring cryomolds tillsammans med objektglas på en metall galler på en bädd av torris för att starta frysprocessen (figur 2D).
- När vävnaden frysmedium har blivit fast, placera cryomold på bänken och låt sitta vid RT i några minuter så att vävnaden frysmedium tinar vid plastmellan gränssnitt.
- Använd en penna eller liknande för att trycka den frusna blocket ur cryomold. Förvara cryoblocks i en låda vid -80 ° C tills vävnaden sektionering.
- Förbered 10-14 um tjocka kryosnitt använder en Cryo-mikrotomen och samla avsnitten om vidhäftningsobjektglas (se Material tabell). Förvara glider vid -20 ° C tills neEDED.
- Karakterisering av TetResponder uttryck på fin avsnitt baserat på YPet fluorescens
- Behandla fenan sektioner under 30 min med 100% MeOH kyld till -20 ° C för att förbättra vidhäftning till objektglas följt av två tvättningar vid rumstemperatur i PBT och en tvätt i PBS, 5 min vardera.
- Visualisera kärnor genom att inkubera sektioner under 10 min i 4 ', 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) i PBS (1: 5000) följt av två tvättningar 10 min vardera i PBS.
- Mount sektioner i 75% glycerol-PBS eller kommersiellt tillgängliga antifade fästen, och täck med en locket.
- Bild YPet och AmCyan fluorescens under konfokala eller brett fält fluorescerande mikroskop (Figur 1E).
NOTERA: För att underlätta en otvetydig identifiering av celltyper som uttrycker YPet, immunofluorescens eller immunohistokemi med antikroppar mot cell typspecifika antigener tillsammans med anti-GFP-antikroppar (som reagerar med YPet, men inte AmCyan) kan utföras. Alternativt, för att underlätta detektering av svag YPet uttryck, kan utföras RNA in situ hybridisering mot YPet RNA antingen på hel-mount fenor eller paraffin delar av fenor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att etablera en fungerande Teton system för vävnadsspecifika inducerbar genuttryck, transgena TetActivator och TetResponder linjer måste genereras (Figur 1A). Detta åstadkommes genom microinjecting TetActivator (Figur 1B - C) eller TetResponder (figur 1E) konstruktioner i tidiga zebrafisk embryon och därpå följande integrering grodden-linje. Funktionella TetActivator konstruktioner kan antingen alstras genom kloning av korta regulatoriska sekvenser (enhancer element) uppströms om TetActivator kassetten (Figur 1B), eller genom att rekombinera den TetActivator kassetten i en BAC innehållande regulatoriska element i den intressanta genen (Figur 1C). Germline integrering av TetActivator konstruktionen kan bedömas genom korsningspotential injiceras individen G0 fisk och utseende AmCyan fluorescens i embryon F1 i den förväntade uttrycksmönster (figur 1D). Germline integkan bedömas ranson och funktionalitet TetResponder transgenen genom att korsa individuell G0 injiceras fisk fast TetActivator fisk (här ubikitin: Teta AmCyan), följt av behandling med DOX och utseende för YFP / YPet fluorescens (figur 1F). Fisk som uppvisar stark och homogen YFP / YPet uttryck att föredra att skapa en stabil TetResponder linje (figur 1G). Efter att ha upprättat en stabil TetActivator och TetResponder fisk linjer, särskilda TetActivator / TetResponder kombinationer kan genereras genom att korsa. Bärare av TetActiator och TetResponder transgener kan identifieras under embryogenes efter DOX behandling slutet uppkomsten av YFP / Ypet på utvecklingsstadiet den TetActivator är aktiva (figur 1H). Alternativt kan dubbla transgena fiskar identifieras efter DOX behandling och TetResponder transgen induktion i regenere stjärtfenan (Figur 2A - B).
< p class = "jove_content"> Vi använder rutinmässigt detta system för att uppnå inducerbar, vävnadsspecifik genexpression i den regenererande zebrafisk stjärtfenan. Vi kontrollerar vävnadsspecifika TetResponder transgenexpression av fluorescens avbildning av kryosnitt av 3 DPA fin regenererar, eftersom de olika vävnads avdelningar som är pånyttfödda tydligt kan identifieras på vävnadssektioner vid denna tidpunkt, (figur 2C). Längsgående eller tvärgående fena återskapar delar erhålls genom cryosectioning efter cryoprotecting vävnad och bädda fin regenerera lämpligt (figur 2D). Efter snittning, kan TetResponder transgenexpression (Ypet / YFP fluorescens) avbildas med fluorescens eller konfokalmikroskopi (Figur 2E). Observera att her4.3 promotor drivna TetActivator inducerar TetResponder uttryck i proximala mediala blastema, medan den distala blastema (pilspets) och epidermis (pilen) saknar uttryck. ove_content ">
Figur 1: Framställning av transgena TetActivator och TetResponder linjer. (A) Cartoon visar strategi för vävnadsspecifika inducerbar genuttryck med hjälp Teton systemet. (B) Transgena TetActivator konstruera (Weidinger lab plasmid databas nr. 1247). En polylinker 5 'om TetActivator irtTAM2 (3F) underlättar cLoning av regulatoriska sekvenser av intresse. Den AmCyan kodande sekvensen separeras från TetActivator via en P2A 'själv klyvning' peptiden. Kassetten innehåller också en SV40-polyadenyleringssignal, flankeras av Tol2 transposonbaserade inverterade upprepningar och innehåller en enda I-SCEI meganuclease igenkänningsställe. (C) TetActivator kassett för BAC recombineering (Weidinger lab plasmid databas nr. 1180). Kassetten innefattar kanamycin-genen för selektion, vilken drivs av en Gb3 prokaryot promotor. FRT-ställen som flankerar kanamycinresistensgenen möjliggör dess Flp-rekombinas medierad bort efter en lyckad integration i BAC. (D) Identifiering av G0 grundare fisk att sända her4.3: Teta AmCyan konstruera genom sin bakterie linje. Bärare identifieras via uppkomsten av AmCyan fluorescens i vissa F1 embryon (pilspetsar). (E) Transgenic TetResponder konstruera (Weidinger lab plasmid databas nr. 1444).Detta konstrukt består av en polylinker och YPet CDS under styrning av optimerade Tet-responselement (Tetre tätt, Clontech) och avslutas av SV40-polyadenyleringssignalen. Den flankeras av Tol2 transposonbaserade inverterade upprepningar och innehåller en enda I-SCEI meganuclease igenkänningsställe. (F) Identifiering av G0 grundare fisk sända en funktionell TetResponder Tetre: Axin1-YFP konstruera genom sin nedärvda. Bärare identifieras genom korsning med en etablerad TetActivator linje (här ubiquitin: Teta AmCyan) och induktion av YFP fluorescens efter DOX behandling under 6 timmar (pilspetsar). (G) Närbild ofembryos visas i (F) efter totalt 12 timmar av DOX behandling. Notera ganska överallt förekommande induktion av YFP-fluorescens. (H) Identifiering av dubbeltransgena embryon som bär TetActivator (her4.3: Teta AmCyan) och TetResponder (Tetre: Axin1-YFP) transgener (pilspetsar). Embryon vire behandlas med DOX under 6 timmar. (A - H) Skala bar: 500 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Användning av Teton systemet för vävnadsspecifika genuttryck i regenererande zebrafisk stjärtfenan. (A) Avels lådor används för DOX behandling av vuxna zebrafisk. (B) Induktion av Tetre: Axin1-YFP TetResponder transgen av her4.3: Teta AmCyan TetActivatori regenere stjärtfenan efter 12 timmar av DOX behandling. Notera avsaknaden av YFP fluorescens i EtOH-behandlade kontrollfisk. (C) tecknad som visar några av de teoretiska vävnader inom fena regenerera vid 3 DPA i ett längdsnitt. (D) Provberedning för cryosectioning. Fin regen placeras i vävnadsfrysmedium (TFM) -filled cryomolds, orienterade på lämpligt sätt för att erhålla antingen längsgående eller tvärgående sektioner av regeneraten, och överförs till en metall rack sitter ovanpå torris tills TFM har stelnat. Snitt plan visas i rött. Förkortningar: dist .: distala, prox .: proximala, vent .: ventrala, dors .: rygg. (E) Confocal bild för YFP-fluorescens i ett längdsnitt av en fena stråle regenerera härledd från fenor som visas i (B). Observera att her4.3: Teta AmCyan TetActivator linje driver YFP induktion specifikt i den proximala-mediala blastema. YFPfluorescens detekteras inte i en mängd olika fack, inklusive de lindade epidermis (pil), och den mest distala domänen av mesenkym (pilspets) (BC) Skalstreck: 500 | im; (E) Skala bar:. 100 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
| TetActivator linje | Referens | Regulatoriska element som används | Huvudsakligen uttryckt i |
| 7xTCF-Xla.Siam: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan | Wehner & Weidinger, opublicerad | 7xTCF-Xla.Siam Wnt reporter 1 | Wnt-responsiva vävnader |
| myl7: irtTAM2 (3F) -p2a-mCherry | Haase & Weidinger, opublicerad | myl7 (cmlc2) 2 | mogna kardiomyocyter |
| her4.3: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm6 | 3 | her4.3 4 | centrala nervsystemet |
| keratin4: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm5 | 3 | keratin4 5 | epidermis, i den vuxna fenan exklusive basalskiktet |
| keratin18: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm4 | 3 | keratin18 6 | epidermis, i den vuxna fenan uteslutande i basalskiktet |
| SP7: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm3 | 3 | SP7 / OSX 7 | (Åtaganden) osteoblaster |
| ubikitin: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2 | 3 | ubikitin 8 | (Ganska) överallt |
Tabell 1:. Tillgängliga transgena TetActivator linjer Denna tabell visar transgena TetActivator linjer för vävnadsspecifika uttryck för TetActivator i både embryonala och vuxna fiskar, som är tillgängliga från Weidinger labbet på begäran.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den vuxna zebrafisk har en fantastisk förmåga att framgångsrikt återskapa många inre organ och bihang. En grundlig förståelse av de molekylära och cellulära mekanismer som är inblandade kräver vävnadsspecifika analys av genfunktioner och signalvägar. Mot detta ger Teton systemet ett effektivt verktyg för spatiotemporally kontrollerad genuttryck i embryonala och vuxna zebrafisk. Teton systemet konstruktioner och metoder som beskrivs i detta manuskript har använts med framgång i en nyligen genomförd studie av vårt laboratorium 3. Följande ytterligare frågor bör beaktas vid upprättandet av Teton systemet:
TetActivator transgen konstruktion överväganden
Vi har tidigare visat att en enkel-inducerbar TetActivator bestående av M2-mutant variant av den omvända Tet-repressor-domän fuserad med Herpes simplexvirus VP16 transaktiveringsdomän-derivatet 3F [irtTAM2 (3F), jagn kort Teta-M2] ger effektiv induktion, men kan visa låg, om än mätbar läckage, är att bakgrunden inducerande aktivitet i frånvaro av doxycyklin (DOX) 5. Därför har vi beskrivit för sig inducerbara system som använder fusioner med en glukokortikoid-receptor (TETA-GBD) eller en domän av ecdysonreceptorkomplex (TETA-EcR) som eliminerar läckage 5. Således, om systemet kommer att användas för att uttrycka toxiska eller mycket potenta proteiner (t.ex. onkogener) användning av ett för sig inducerbar variant bör övervägas. Alternativt, under upprättandet av TetActivator och TetResponder linjer en rad linjer som producerar olika uttrycksnivåer kan väljas och svagare inducerare väljs vid läckage är ett problem med starkt inducerar linjer. TetActivator konstruktioner innehållande Teta-GBD eller Teta-EcR varianten är tillgängliga från Weidinger labbet på begäran.
Genmodifiering metoder för generering av transgena zebrafisk linjer
TetResponder transgenexpression analys
För att detektera vävnadsspecifika TetResponder transgenexpression hos vuxna fenor vi brukar använda fluorescerande avbildning av kryosektioner. Enligt vår erfarenhet är fluorescens av fluorescerande proteiner som uttrycks av transgenen bevaras hela fixation och cryosectioning procedur och kan således direkt avbildas. Ytterligare metoder för att upptäcka TetResponder uttryck, som har beskrivits på annat håll, är: i) immunfärgning på sektioner, företrädesvis mot det fluorescerande proteinet tag, här YPet, med hjälp av en anti-GFP-antikropp, ii) fluorescerande eller kromogen ISH på sektioner, eller iii ) hel-mount ISH följt av sektionering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna tackar Christa Haase, Doris Weber och Brigitte Korte för tekniskt stöd. Arbetet i Weidinger labbet stöds av bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 och Deutsche Gesellschaft für Kardiologie via en Oskar-Lapp-Stipendium och Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g., Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5,000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g., Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317 (2014).
- Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
- Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610 (2007).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
- Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).
