Introduction
Zebrafisken er en veletableret hvirveldyr model organisme for at studere mange aspekter af udvikling, fysiologi, sygdom og regenerering. Med den stigende vedtagelsen af zebrafisk som en model for post-embryonale biologiske processer, eksperimentelle værktøjer til inducerbar, vævsspecifik manipulation af genekspression eller signalveje er blevet stadig vigtigere. Især har undersøgelser i orgel og vedhæng regenerering hos voksne zebrafisk lidt under manglende af værktøjer til dissektion af spatio-temporale krav signalveje i disse regenerative processer.
I øjeblikket har tre forskellige systemer blevet anvendt til at opnå betinget, vævsspecifik genekspression i regenererende organer voksne zebrafisk: Cre-lox-systemet, mosaik ekspression af varmechok-inducerbare transgener ved hjælp transposon-medieret somatisk transgenese, og Teton systemet 1 -3. Teton refererer til en variant af et tetracyclin-contrullet transkriptionel aktiveringssystem, hvor ekspression er aktiveret i nærvær af antibiotikummet tetracyclin eller et derivat, f.eks doxycyclin. Cre-lox-systemet, som det hidtil har været anvendt i voksne fisk, bygger på en Tamoxifen-kontrollerede Cre rekombinase (CreERT2), hvis ekspression er rumligt begrænset af vævsspecifikke regulatoriske elementer. Cre-drevet fjernelse af et STOP kassette letter ekspression af genet af interesse drevet af en promotor, der skal være aktiv i alle celletyper 1. Transposon-medieret oprettelse af mosaically udtrykte somatiske transgener tilvejebringer et system til inducerbar transgenekspression i individuelle cellelinier. Injektion af zebrafisk embryoner med et Tol2 transposon bærer et gen af interesse under transkriptionel kontrol af en varmechokpromotor resulterer i kimære individer typisk bærer transgenet kun i diskrete cellelinier af en regenererende organ 2. Mens begge systemer giver mulighed for betinget væv-specifikke genekspression, Cre-lox-systemet er ikke reversibel, og strategien ved anvendelse transposonbaseret klonal mærkning lider sin stokastiske natur. Således har vi og andre for nylig tilpasset transgene Teton systemer til brug i zebrafisk, som letter tidsmæssigt og rumligt kontrolleret genekspression, der er desuden justerbar og reversibel 3-5.
Teton systemet her anvendt omfatter en transgen driver linie (TetActivator), hvori en Doxycyclin (DOX) -inducerbare transkriptionel aktivator (forbedret omvendt tetracyclin transaktivator, irtTA, kort- TETA) er under kontrol af vævsspecifikke genomiske regulatoriske sekvenser. For det andet kræver en transgen responder linje (TetResponder), som huser et gen af interesse under transkriptionel kontrol af tetracyclin operatør (Tet responselement; Tetre) (figur 1A). Anvendelsen af specifikke kombinationer af TetActivator og TetResponder linjer giver mulighed for betinget væv-specific manipulation af genekspression.
Vi har for nylig brugt Teton system til at sondere for vævsspecifikke funktioner Wnt / beta-catenin signalering i den voksne regenererende zebrafisk halefinnen 3. I protokollen beskrevet her beskriver vi en arbejdsgang til opsætning og brug af Teton-system i zebrafisk, især for studier af fin regenerering. Dette omfatter detaljerede instruktioner om, hvordan at generere stabile transgene TetActivator og TetResponder linjer og en protokol for transgen induktion i embryoner og voksne zebrafisk. Desuden beskriver vi teknikker til kontrol af vævsspecifik genekspression i fin regenerere, herunder en protokol til fremstilling af kryosnit af voksne zebrafisk finner. Derudover diskuterer vi overvejelser for udformningen af TetActivator transgen, valget af en transgenese metode, og detektion af TetResponder ekspression. Derfor er det overordnede mål med denne protokol er at tjene som et blueprinttil oprettelse et funktionelt teton system zebrafisk at opnå betinget vævsspecifik genekspression, som kan anvendes på enhver væv af interesse.
Vi har skabt en TetActivator vektor tillader I-Scel eller Tol2-medieret dannelse af stabile TetActivator linjer ved hjælp af korte genomiske regulatoriske sekvenser (forstærker fragmenter; Weidinger lab plasmid database nej 1247;. Figur 1B). Denne konstruktion indeholder en TetActivator kassette bestående af M2 mutant variant af den omvendte Tet-repressor domæne fusioneret med Herpes simplex virus VP16-transaktiveringsdomænet-derivat 3F [irtTAM2 (3F)]. Ekspression af TetActivator (TETA) kan let overvåges, da det er co-udtrykkes med fluoroforen AmCyan fra samme åbne læseramme; en P2A peptid medierer ribosomale springe, hvilket skulle resultere i produktion af TETA og AmCyan som særskilte proteiner ved en 1: 1-forhold 5,6. Konstruktionen indeholder også en poylinker 5 'af TetActivator kassette at lette indføring af genomiske regulatoriske sekvenser af interesse under anvendelse af konventionelle kloningsmetoder.
Derudover har vi skabt en konstruktion, der består af den ovenfor beskrevne TetActivator kassette plus en kanamycinselektion kassette (Weidinger lab plasmid database nr 1180;. Figur 1C), som kan rekombineres ind i en bakterielt kunstigt kromosom (BAC), der indeholder en stor genomisk region ( sædvanligvis i startkodonen af et gen, hvis ekspressionsmønster skal efterlignes af transgenet). Begge konstruktioner er tilgængelige fra Weidinger laboratoriet efter anmodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generation af transgene TetActivator Fish Lines
- Generering af TetActivator konstrukt
- Clone regulatoriske sekvenser af interesse opstrøms for TetActivator kassetten i vektor # 1247 anvendelse af standardteknikker. Alternativt bruge rekombinationsteknikker til at generere en BAC, hvor TetActivator kassetten (vektor # 1180) indsættes i det første exon af målgenet, og hvor Tol2 inverterede gentagelser indføres i BAC rygrad (for en detaljeret recombineering protokol se 7,8).
- Forbered toksin-frit plasmid DNA eller BAC DNA-præparater under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits.
- Generation af transgene TetActivator fisk linjer
- Udfør mikroinjektion af TetActivator konstrukt ifølge standardprocedurer 9.
- Injicer 25-50 pg af plasmid-DNA'et eller op til 250 pg BAC DNA i en celle-embryoer sammen med udjævnede sense-RNA koder for tol2 transposase for transposon-medieret transgenese eller med I-Scel protein for I-Scel-medieret transgenese.
BEMÆRK: Overvejelser vedrørende valg af transgenese metode kan findes i diskussionen sektion.
BEMÆRK: Sprøjt fortrinsvis ind i cytoplasmaet, ikke blommen, eftersom effektivitet af transgenese kan falde, når DNA'et ikke leveres ind i cytoplasmaet.
- Injicer 25-50 pg af plasmid-DNA'et eller op til 250 pg BAC DNA i en celle-embryoer sammen med udjævnede sense-RNA koder for tol2 transposase for transposon-medieret transgenese eller med I-Scel protein for I-Scel-medieret transgenese.
- Hæv injicerede G0 embryoner til voksenalderen. Eventuelt skærm G0 embryoner til AmCyan fluorescens og fortrinsvis vokse embryoner viser det ønskede ekspressionsmønster. Dette kan øge hastigheden af kim-line transmission, især for Tol2-medieret transgenese.
- Vurdere vellykket kimlinje-integration ved udkrydsning individuel G0 fisk til vildtype fisk og udseende AmCyan fluorescens i det forventede ekspressionsmønster i F1 embryoner eller larver under anvendelse af en fluorescerende stereomikroskop (eksempel er vist i figur 1 D).
- Hæv fluorescens-positiveF1 embryoner til voksenalderen og parre dem med vildtype-fisk for at opnå stabil F2 transgene fisk.
- Hæv og karakterisere mindst 3 forskellige underlinjer afledt af forskellige G0 grundlægger fisk, da de enkelte linjer kan være forskellige i ekspressionsniveauer, ekspressionsmønster, evne til at inducere TetResponder linjer, utæthed, og deres følsomhed over for silencing.
BEMÆRK: Mange transgener, der håndfast udtrykkes i embryoer er enten helt eller delvist bragt til tavshed i sen-fase larver eller voksne fisk. Hvis således linjer er beregnet til at blive anvendt i voksne fisk, karakterisere adskillige uafhængige linjer for deres TetActivator ekspression og funktion i voksenalderen.
BEMÆRK: Vi har genereret et panel af TetActivator linjer for vævsspecifik udtryk for TetActivator i begge embryoner og voksne fisk, der er anført i tabel 1 Disse linjer er tilgængelige fra Weidinger laboratoriet efter anmodning..
- Udfør mikroinjektion af TetActivator konstrukt ifølge standardprocedurer 9.
2. Generation af transgene TetResponder Fish Lines
BEMÆRK: Vi har genereret en TetResponder konstruktion giver mulighed for I-Scel eller Tol2-medieret dannelse af stabile TetResponder linjer, som er tilgængelig fra Weidinger lab efter anmodning (Weidinger lab plasmid database nej 1444, figur 1E.). Denne konstruktion indeholder en Tetracycline operatør, efterfulgt af en polylinker region letter insertion af kodende sekvenser (CDS) af et gen af interesse og den kodende sekvens YFP-derivat YPet. Således er konstruktionen udformet til TETA-medieret ekspression af et C-terminal fusion af proteinet af interesse med YPet. Hvis ekspression af et mærket fusionsprotein til har undgås, kan en P2A eller T2A peptid indføres med genet af interesse CDS, hvilket letter co-ekspression af proteinet af interesse og YPet som separate polypeptider 6,10.
- Generering af TetResponder konstrukt
- Clone CDS af genet af interesse 3 'af tetracyclin operatørog 5 'af YPet CDS henhold til standardprocedurer. Sikre, at stopkodonen er blevet fjernet fra genet af interesse CDS.
- Forbered toksin-frit plasmid DNA-præparater under anvendelse af kommercielt tilgængelige kits.
- Generation af transgene TetResponder fisk linjer
- Udfør mikroinjektion af TetResponder konstruere ifølge standardprocedurer 9.
- Injicer 25-50 pg af plasmid-DNA'et i cytoplasmaet af en-celle-embryoer sammen med udjævnede sense-RNA koder for tol2 transposasen for transposon-medieret transgenese eller med I-Scel enzym til meganuklease-aided transgenese.
BEMÆRK: Overvejelser vedrørende valg af transgenese metode kan findes i diskussionen sektion.
BEMÆRK: Sprøjt fortrinsvis ind i cytoplasmaet, ikke blommen, eftersom effektivitet af transgenese kan falde, når DNA'et ikke leveres ind i cytoplasmaet.
- Injicer 25-50 pg af plasmid-DNA'et i cytoplasmaet af en-celle-embryoer sammen med udjævnede sense-RNA koder for tol2 transposasen for transposon-medieret transgenese eller med I-Scel enzym til meganuklease-aided transgenese.
- Hæv injicerede G0 embryoner til endulthood.
- Vurdere vellykket integration kim-line og inducerbarhed af transgenet ved parring individuelle G0 fisk med en tidligere etableret TetActivator linje efterfulgt af doxycyclin behandling af F1 embryoer eller F1 larver.
BEMÆRK: Normalt bruger vi en ubiquitinpromotoren drevet TetActivator linie (ubiquitin: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2, kort ubiquitin: Teta AmCyan 3) at screene for funktionelle TetResponder luftfartsselskaber, da denne linje driver temmelig allestedsnærværende udtryk i embryoner og voksne fisk og dermed er velegnet til at vurdere TetResponder inducerbarhed i alle væv af interesse. Denne linje er tilgængelig fra Weidinger laboratoriet efter anmodning. - Indsamle embryoner af hver kobling i en separat 10 cm petriskål indeholdende E3 embryo-medium (se Materialer tabel) og inkuberes skåle ved 28,5 ° C.
- Sted G0 fisk, der gav embryoner i individuelle nummererede tanke (avl kasser, se Materialer tabellen), indtil embryoner har været skærmred. Dette giver mulighed for inddrivelse af G0 fisk, der viser kønsceller transmission af transgenet.
- Hvis kun halvdelen af embryonerne forventes at bære TetActivator transgen (i tilfælde en heterozygot TetActivator luftfartsselskab blev krydset til en TetResponder grundlægger fisk), skal du vælge for embryoner, der indeholder TetActivator transgen ved fremkomsten af AmCyan fluorescens på et passende udviklingsstadiet.
- Fremkald TetActivator transkriptionsaktivitet ved at behandle fostre med Doxycyclin (DOX) som beskrevet i afsnit 2.3.
- Screen F1 embryoner til fremkomsten af YPet fluorescens. Foretrækker linjer (G0 fisk), der producerer homogene YPet udtryk, der er embryoner i koblingen skal vise lidt mosaicisme inden for det forventede udtryk domæne og lidt variation mellem individuelle embryoer. Se pilespidser i figur 1F og figur 1G for repræsentative eksempler.
- Mate G0 fisk transmission af en inducerbar TetResponder transgen identificeret itrin 2.2.8 med vildtype fisk og hæve alle F1 embryoner til voksenalderen.
- Identificer voksne F1 transgene fisk enten ved PCR-baseret genotypebestemmelse (se sektion eller ved at krydse individuelle F1 fisk til en TetActivator linje efterfulgt af DOX behandling af F2 embryoner og fremkomsten af YPet fluorescens (se afsnit 2.5).
- Etablere og karakterisere mindst 3 forskellige TetResponder underlinjer afledt af forskellige G0 grundlægger fisk, da inducerbarhed kan variere i de enkelte linjer. Navnlig opnåelige ekspressionsniveauer og om responder kan aktiveres i alle celletyper kan variere. Desuden vil modtagelighed for inaktivering variere mellem linjerne. Endelig er der i nogle tilfælde kan det være at foretrække at vælge linjer, som medierer kun moderate ekspressionsniveauer af proteinet af interesse, især hvis der forventes utætte ekspression produceret i kombination med en TetActivator linje i fravær af Doxycycline at forårsage udviklingsmæssige defekter eller toksicitet.
BEMÆRK: TetResponder linjer, der er robust inducerbare i embryoner kan enten helt eller delvist bragt til tavshed i sen-fase larver eller voksne fisk. Hvis således linjer er beregnet til at blive anvendt i voksne fisk, flere uafhængige linjer skal karakteriseret for inducerbarhed hos voksne. Hvis induktion af genet af interesse er kompatibel med videreudvikling, er det blevet bevist nyttigt at skabe dobbelt transgene embryoner (TetActivator x TetResponder), at inducere GOI udtryk med embryoner og til at vælge og hæve kun de personer, der viser den mest robuste og mindst mosaik induktion. - For at opretholde og udbrede etablerede TetResponder linjer, genotype voksne fisk som beskrevet i afsnit 2.5).
- Udfør mikroinjektion af TetResponder konstruere ifølge standardprocedurer 9.
- Doxycyclin behandling af embryoner
- Forbered 2,000x Doxycyclin (DOX) bestande. Løs DOX i 50% EtOH til opnåelse af en koncentration på 50 mg / ml (97 mM). Store DOX lagre beskyttet mod lys ved -20 ° C.
- Dekanteres størstedelen af E3 medium fra embryoner og erstatte det medE3 embryo medium indeholdende DOX ved en endelig koncentration på 25 pg / ml DOX (2,5 pi 2,000x DOX lager pr 50 ml E3). Dechorionation er ikke påkrævet.
- Retur embryoner til 28,5 ° C i mindst 6 timer, før vurderingen udtryk for mærkede gen af interesse ved fremkomsten af YPet fluorescens.
- Vurdere utæthed af TetActivator / TetResponder kombination ved at behandle embryoner med kun EtOH opløsningsmiddel.
BEMÆRK: In situ-hybridisering (ISH) eller RT-PCR til påvisning af TetResponder mRNA kan anvendes som mere følsomme målinger af utæthed end fluorescens af mærkede gen af interesse. Omfanget af utæthed vil afhænge af den særlige TetActivator / TetResponder line kombination, og det kan også variere mellem væv og udviklingstrin.
- Anæstesi af voksne zebrafisk
- Forbered diameter på 10 cm petriskål eller lille bægerglas fyldt med fisk systemet vand indeholdende 1 mg / ml tricaine (ethyl-3-aminobenzoat methanesulfonate, MS-222).
- Overfør fisk til beholder, der indeholder bedøvelsesmiddel, og vent, indtil den når niveau 4 af anæstesi som indikeret ved fuldstændigt tab af ligevægt (fisk ligger på siden), ingen bevægelser og ingen svar på røre 11.
- Overføre omhyggeligt fisk med en pincet eller en ske på et objektglas, låg af plast petriskål eller agarose-coatede petriskål og udfør fin amputation eller billeddannelse (se afsnit 3.2).
- Retur fisk til en beholder indeholdende et stort volumen af frisk fisk systemets vand og overvåge den. Hvis gælle bevægelser ikke genoptages inden 3 min, hjælpe ved at blæse vand over gællerne ved hjælp af en plastik overførsel pipette.
- PCR-baseret genotypebestemmelse af TetResponder fisk
- Udfør en delvis amputation af halefinnen 12. Placer fisken i individuelle, nummererede tanke (avl kasser, se Materialer tabel). Dette giver mulighed for inddrivelse af transgene fisk efter en vellykket genotypebestemmelse.
- Transfer FIN væv til individuelle brønde i en 96-brønds PCR-plade fyldt med 20 pi DNase-frit vand til isolering af genomisk DNA 13.
- Tilføj 120 pi 1 M NaOH til hver brønd og inkuberes prøver i 20 minutter ved 95 ° C under anvendelse af en thermocycler.
- Chill prøver til 4 ° C, tilsættes 14 pi 1 M Tris-HCl (pH 8,0) til hver brønd, og kort vortex prøver. Centrifugér prøver i 5 minutter ved 16.000 xg for at pelletere celledebris. Opbevar genomisk DNA ved 4 ° C indtil brug.
- Design primere til specifikt at amplificere et fragment af TetResponder transgen. Bruge 2 pi isoleret DNA i en standard PCR-reaktion og analysere PCR-produkt på en agarosegel.
3. Vævsspecifik Induktion af transgenekspression i Adult Regenerating Zebrafisk Tail Fin
- Etablering af TetActivator; TetResponder dobbelt transgene fisk
- Mate TetActivator luftfartsselskaber med TetResponder Carriter.
- Vælg embryoner med den TetActivator transgen på et udviklingstrin, når de regulatoriske elementer der driver TetActivator kassetten er aktive. Transgene embryoner kan nemt identificeres ved fremkomsten af AmCyan fluorescens ved hjælp af et stereo-fluorescerende mikroskop.
BEMÆRK: TetActivator transgene-positive fisk kan alternativt identificeres i voksenalderen ved billeddannelse af bedøvede fisk, f.eks. efter amputation af halefinnen og fremkomsten af AmCyan fluorescens i regenerere. - Hæv udvalgte embryoner til voksenalderen.
- Identificere dobbelt transgene voksne fisk (fisk, der bærer TetResponder ud over TetActivator) ved PCR-baserede genotypebestemmelse eller (fortrinsvis) ved deres evne til at inducere ekspression af TetResponder i vævet af interesse. En protokol til TetResponder induktion og detektion i regenererende halefinnen er beskrevet i afsnit 2.3 og afsnit 4.
BEMÆRK: Hvis forbigående TetResponder udtryk er kompatibelmed yderligere embryonale eller larveudvikling, er det nyttigt at identificere dobbelt transgene embryoner med TetActivator og TetResponder transgener efter DOX behandling under fosterudviklingen, som beskrevet ovenfor (afsnit 2.3, figur 1 H). Dobbelt positive embryoner vil vise AmCyan og YPet fluorescens. Hæv positive embryoner til voksenalderen.
- Amputation af zebrafisk hale finner og induktion af transgen ekspression i regenererende finne
- Udfør en delvis amputation af halefinnen på bedøvede fisk (se afsnit 2.4) 12. Behandl fisk enten straks med DOX eller returnere dem til fisken staldsystem.
- Forbered avl boks (figur 2A, se Materialetabel) fyldt med 1 l af fisk systemets vand indeholdende 25 pg / ml DOX (tilføj 500 pi 2,000x 50 mg / ml stamopløsning til 1 I fisk systemets vand).
BEMÆRK: Induktion af transgenekspression umiddelbart efter amputation muliggør somdering af virkningerne på tidlige begivenheder under regenerering, mens induktion ved 3 dage efter amputation (3 dpa) bør anvendes til at vurdere transgen ekspression eller funktion under regenerativ vækst. - Overfør op til 10 tidligere amputeret, dobbelt transgene fisk til opdræt kassen og tæt kasse med et låg, således at fisken ikke kan slippe ud (figur 2A).
- Placer avl kasser ind i mørket for at reducere stress. Vi plejer placere kasserne i en 28,5 ° C luftinkubator at sikre en konstant mørke og temperatur.
- Forkæl negativ kontrol dobbelt transgene fisk med EtOH eneste (250 pi per 1L fisk systemet vand).
BEMÆRK: Single transgene eller vildtype fisk behandlet med DOX kan anvendes som yderligere negativ kontrol, selv om vi aldrig har observeret bivirkninger af DOX doser, der anvendes her på fin regenerering. - Bedøver fisk som beskrevet i afsnit 2.4 og overførsel fisk ved hjælp af en pincet eller en ske på en fugtet agarose belagt petri skål. Spredes forsigtigt halefinnen med en pincet.
- Screen fisk til udseendet af YPet inden regeneratet anvendelse af en fluorescerende stereomikroskop (figur 2B).
BEMÆRK: Normalt kan TetResponder drevet fluorescens være robust observeres efter 6 timer i DOX behandling. Vi anbefaler dog, at karakterisere dynamik TetResponder udtryk for hver linje genereret. - Retur fisk til fisk staldsystem at opsige TetResponder transgen induktion eller fortsætte behandlinger.
BEMÆRK: For behandlinger> 24 timer (langtidsbehandling) det er vigtigt at udveksle vand og grundigt rengør ynglende kasser dagligt. - Under langvarige behandlinger, foder fisk hver 2-3 dage ved at overføre fisk i en ren beholder med frisk fisk systemet vand, før returnere dem til avl kasser efter fodring.
4. Karakterisering af TetResponder Expression i Fin Regenererer
t "> BEMÆRK:. Vi plejer kontrollere vævsspecifik genekspression i regenererende halefinnen med fluorescerende billeddannelse af kryosektioner ved 3 dpa På dette tidspunkt de forskellige væv rum i en regenerere har dannet og kan klart identificeres på væv-sektioner, og cryosectioning er enklere end på senere stadier af regenerering. Figur 2C viser de væv domæner, der kan skelnes i regenerere og lister nogle molekylære markører for disse domæner. Følgende protokol beskriver fremstillingen af langsgående eller tværgående kryosektioner til direkte billeddannelse eller immunfarvning .- Cryosectioning af voksne halefinnerne
- Behandl fisk, hvis hale finner blev amputeret fra 2 dpa indtil 3 dpa med DOX, som beskrevet i afsnit 3.2
- Bedøver fisk som beskrevet i afsnit 2.4
- Brug en ske eller pincet til forsigtigt overføre fisk på et låg af en plast Petri-skål.
- Re-amputere finnen regenerere på omkring 4-5 knoklet segments proximalt til amputation oprindelige plan ved hjælp af en skalpel og returnere fisk til fersk fisk kedelvandet.
- Omhyggeligt overførsel regenererer til en lille petriskål (f.eks, 35 mm) indeholdende 4% (vægt / volumen) paraformaldehyd (PFA) i 1x phosphatpufret saltvand (PBS; se Materialer tabel) under anvendelse af fine pincetter. Rør ikke ved regenerere men kun stump del af vævet.
- Placere væv fladt på den petriskål bund og løse O / N ved 4 ° C.
- Vask regenererer to gange i 1 x PBS indeholdende 0,1% Tween (PBT) til fjernelse PFA og inkuberes regenererer o / n ved 4 ° C i 0,5 M EDTA-PBS (pH 7,5) til afkalkning knoglematrix.
- Inkuber regenererer ved stuetemperatur i 10% saccharose-PBS, 20% saccharose-PBS, 30% saccharose-PBS og 30% saccharose-PBS: væv frysning medium ved en 1: 1-forhold (TFM; se Materialer tabel) i 30 minutter hver. Efterfølgende inkuberes finner ved 4 ° C i> 2 timer i væv frysning medium.
- Placer cryomolds på et objektglas og fyldem med væv frysning medium. Undgå at indføre luftbobler.
- Transfer regenererer ind cryomolds og orient væv hensigtsmæssigt at opnå langsgående eller tværgående sektioner af fin regenererer (figur 2D). Sørg for, at regenerat er lige, hvilket letter sektionering.
- Overførsel cryomolds sammen med objektglas på en metal rist på en seng af tøris for at starte fryseprocessen (figur 2D).
- Når vævet frysemedium er blevet fast, sted kryoformen på bænken og lad sidde ved stuetemperatur i et par minutter, således at vævet frysemedium optør ved plast-medium interface.
- Brug en kuglepen eller lignende til at skubbe den frosne blok ud af kryoformen. Opbevar cryoblocks i en kasse ved -80 ° C indtil væv sektionering.
- Forbered 10-14 um tykke kryosnit ved hjælp af en Cryo-mikrotom og indsamle afsnit om vedhæftning objektglas (se Materialer tabel). Opbevar dias ved -20 ° C indtil needed.
- Karakterisering af TetResponder udtryk på fin sektioner baseret på YPet fluorescens
- Behandle finnesektioner i 30 minutter med 100% MeOH afkølet til -20 ° C for at forbedre overholdelse af objektglas efterfulgt af to vaske ved stuetemperatur i PBT og 1 vask i PBS, 5 min hver.
- Visualisere kerner ved inkubering sektioner i 10 minutter i 4 ', 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) i PBS (1: 5000) efterfulgt af to vaske 10 minutter hver i PBS.
- Mount sektioner i 75% glycerol-PBS eller kommercielt tilgængelige antiblegemiddel mounts og dække med en dækning dias.
- Billede YPet og AmCyan fluorescens under en konfokal eller bred-felt fluorescerende mikroskop (Figur 1E).
BEMÆRK: For at lette entydig identifikation af celletyper, der udtrykker YPet, immunofluorescens eller immunohistokemi med antistoffer mod celle-typespecifikke antigener sammen med anti-GFP-antistoffer (som reagerer med YPet, men ikke AmCyan) kan udføres. Alternativt lette afsløringen af svage YPet udtryk, kan RNA in situ hybridisering mod YPet RNA udføres enten på hel-mount finner eller paraffinsnit af finner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
At etablere et funktionelt teton system til vævsspecifik inducerbar genekspression, transgene TetActivator og TetResponder linjer skal genereres (figur 1A). Dette opnås ved mikroinjektion TetActivator (figur 1B - C) eller TetResponder (figur 1E) konstruktioner i tidlige zebrafisk embryoner og efterfølgende integration kim-linie. Funktionelle TetActivator konstruktioner kan enten genereres ved kloning af korte regulatoriske sekvenser (enhancerelementer) opstrøms for TetActivator kassette (figur 1B) eller ved rekombination af TetActivator kassetten i en BAC indeholder regulatoriske elementer af genet af interesse (Figur 1C). Kimcellelinje integration af TetActivator konstruktionen kan vurderes ved udkrydsning injiceres individet G0 fisk og udseende AmCyan fluorescens i F1 embryoner i den forventede ekspressionsmønster (figur 1D). Germline integration og funktionaliteten af TetResponder transgen kan vurderes ved at krydse individuel G0 injiceret fisk til etablerede TetActivator fisk (her ubiquitin: TETA AmCyan), efterfulgt af behandling med DOX og udseendet af YFP / YPet fluorescens (figur 1F). Fisk, der har en stærk og homogen YFP / YPet udtryk bør foretrækkes for at etablere en stabil TetResponder linje (figur 1G). Have etableret en stabil TetActivator og TetResponder fisk linjer, specifikke TetActivator / TetResponder kombinationer kan genereres ved at krydse. Bærere af TetActiator og TetResponder transgener kan identificeres under embryogenese efter DOX behandling ende fremkomsten af YFP / Ypet på udviklingsstadiet for TetActivator er aktiv (Figur 1 H). Alternativt kan identificeres dobbelt transgene fisk efter DOX behandling og TetResponder transgen induktion i regenererende halefinnen (figur 2A - B).
< p class = "jove_content"> Vi anvender rutinemæssigt dette system at opnå inducerbar, vævsspecifik genekspression i regenererende zebrafisk halefinnen. Vi kontrollere vævsspecifik TetResponder transgen ekspression ved fluorescens billeddannelse af kryosnit på 3 DPA fin regenererer, da de forskellige væv rum i en regenerere tydeligt kan identificeres på væv-sektioner på dette tidspunkt-punkt (figur 2C). Længde- eller tværgående fin regenererer sektioner opnås ved cryosectioning efter cryoprotecting væv og indlejring fin regenerere passende (figur 2D). Efter sektionering, kan TetResponder transgenekspression (Ypet / YFP fluorescens) skal afbildes under anvendelse af fluorescens eller konfokal mikroskopi (figur 2E). Bemærk, at her4.3 promotor-drevne TetActivator inducerer TetResponder udtryk i den proksimale mediale blastema, mens den distale blastema (pilespids), og epidermis (pil) er blottet for udtryk. ove_content ">
Figur 1: Frembringelse af transgene TetActivator og TetResponder linjer. (A) Cartoon viser strategi for vævsspecifik inducerbart genekspression hjælp Teton system. (B) Transgene TetActivator konstruere (Weidinger lab plasmid database nr. 1247). En polylinker 5 'af TetActivator irtTAM2 (3F) letter cloning af regulatoriske sekvenser af interesse. Kodningssekvensen AmCyan er adskilt fra TetActivator via en P2A "selv-spaltende" peptid. Kassetten indeholder også et SV40 polyadenyleringssignal, er flankeret af Tol2 transposon inverterede gentagelser og indeholder en enkelt I-Scel meganukleasen genkendelsessted. (C) TetActivator kassette til BAC recombineering (Weidinger lab plasmid database nr. 1180). Kassetten omfatter kanamycin til selektion, som drives af en Gb3 prokaryot promotor. FRT flankerer kanamycinresistensgenet tillader dets Flp-recombinase medieret fjernelse efter en vellykket integration i BAC. (D) Identifikation af G0 grundlægger fisk transmitterer her4.3: Teta AmCyan konstruere gennem deres kim-line. Bærere identificeres via fremkomsten af AmCyan fluorescens i nogle F1 embryoner (pilespidser). (E) Transgenic TetResponder konstruere (Weidinger lab plasmid database nr. 1444).Dette konstruktioner består af en polylinker og YPet CDS under kontrol af optimerede Tet responselementer (Tetre-tight, Clontech) og termineret med SV40-polyadenyleringssignal. Det er flankeret af Tol2 transposon inverterede gentagelser og indeholder en enkelt I-Scel meganukleasen genkendelsessted. (F) Identifikation af G0 grundlægger fisk sende et funktionelt TetResponder Tetre: Axin1-YFP konstruere gennem deres kimcellelinjen. Bærere identificeres ved krydsning med en etableret TetActivator linje (her ubiquitin: TETA AmCyan) og induktion af YFP fluorescens efter DOX behandling i 6 timer (pilespidser). (G) Luk op ofembryos vist i (F) efter alt 12 timer af DOX behandling. Bemærk temmelig allestedsnærværende induktion af YFP fluorescens. (H) Identifikation af dobbelt transgene embryoner med TetActivator (her4.3: TETA AmCyan) og TetResponder (Tetre: Axin1-YFP) transgener (pilespidser). Embryoner vire behandlet med DOX i 6 timer. (A - H) Målestok: 500 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Anvendelse af Teton for vævsspecifik genekspression i regenererende zebrafisk halefinnen. (A) Opdræt, der anvendes for DOX behandling af voksne zebrafisk. (B) Induktion af Tetre: Axin1-YFP TetResponder transgen af her4.3: tetA AmCyan TetActivatori regenererende halefinnen efter 12 timer af DOX behandling. Bemærk fraværet af YFP fluorescens i EtOH-behandlet kontrol fisk. (C) Cartoon afbilder nogle af vævsrum indenfor en finne regenerere på 3 DPA i et langsgående snitbillede. (D) forberedelse Prøve til cryosectioning. Fin regenererer anbringes i vævs-frysemedium (TFM) -filled cryomolds, orienteret korrekt for at opnå enten langsgående eller tværgående sektioner af regeneratet, og overført til et metal rack sidder på toppen af tøris indtil TFM er størknet. Snitplanet er angivet med rødt. Forkortelser: dist .: distal, prox .: proksimale, vent .: ventrale, Dors .: dorsale. (E) Konfokal billede af YFP fluorescens i et længdesnit af en fin stråle regenerere afledt af finner er vist i (B). Bemærk, at her4.3: Teta AmCyan TetActivator linje driver YFP induktion specifikt i den proksimale-mediale blastema. YFPfluorescens ikke påvist i en række rum, herunder de viklede epidermis (pil) og den mest distale domæne af mesenkym (pilespids) (BC) Målestok: 500 um; (E) Målestok:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.
| TetActivator line | Henvisning | Regulatoriske elementer anvendt | Primært udtrykt i |
| 7xTCF-Xla.Siam: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan | Wehner & Weidinger, upubliceret | 7xTCF-Xla.Siam Wnt reporter 1 | Wnt-responsive væv |
| myl7: irtTAM2 (3F) -p2a-mCherry | Haase & Weidinger, upubliceret | myl7 (cmlc2) 2 | modne cardiomyocytter |
| her4.3: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm6 | 3 | her4.3 4 | centralnervesystemet |
| keratin4: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm5 | 3 | keratin4 5 | epidermis, i den voksne finne eksklusive det basale lag |
| keratin18: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm4 | 3 | keratin18 6 | epidermis, i den voksne finnen udelukkende i det basale lag |
| SP7: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm3 | 3 | SP7 / OSX 7 | (Engageret) osteoblaster |
| ubiquitin: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2 | 3 | ubiquitin 8 | (Forholdsvis) allestedsnærværende |
Tabel 1:. Tilgængelige transgene TetActivator linjer Denne tabel viser transgene TetActivator linjer for vævsspecifik udtryk for TetActivator i både embryonale og voksne fisk, som er tilgængelige fra Weidinger lab efter anmodning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den voksne zebrafisk har en forbløffende evne til med succes at regenerere mange indre organer og vedhæng. En grundig forståelse af de molekylære og cellulære mekanismer involveret kræver vævsspecifik analyse af gen funktioner og signalveje. Mod dette, Teton system giver et effektivt redskab til spatiotemporally kontrolleret genekspression i embryonale og voksne zebrafisk. Teton systemet konstruktioner og metoder, der er beskrevet i dette manuskript har været anvendt med succes i en nylig undersøgelse af vores laboratorium 3. Følgende yderligere spørgsmål bør overvejes, når oprettelse Teton systemet:
TetActivator transgen design overvejelser
Vi har tidligere vist, at en enkelt-inducerbar TetActivator bestående af M2 mutant variant af den omvendte Tet-repressor domæne fusioneret med Herpes simplex virus VP16-transaktiveringsdomænet-derivat 3F [irtTAM2 (3F), in korte TETA-M2] tillægger effektiv induktion, men kan vise lav, omend målelig utæthed, der er baggrund inducerende aktivitet i fravær af doxycyclin (DOX) 5. Derfor har vi beskrevet duelt inducerbare systemer, der anvender fusioner med en glucocorticoidreceptor (TETA-GBD) eller et domæne af ecdyson-receptor (TETA-ECR), der eliminerer utæthed 5. Hvis således systemet vil blive anvendt til at udtrykke toksiske eller meget potente proteiner (f.eks onkogener) anvendelse af en duelt inducerbar variant bør overvejes. Alternativt kan under etablering af TetActivator og TetResponder linjer vælges en række linjer, der producerer forskellige ekspressionsniveauer og svagere inducere valgt i tilfælde utætheder er et problem med stærkt inducerende linjer. TetActivator konstruktioner indeholdende TETA-GBD eller TETA-EcR varianten er tilgængelige fra Weidinger laboratoriet efter anmodning.
Transgenese metoder til frembringelse af transgene zebrafisk linjer
TetResponder transgen ekspression analyse
For at detektere vævsspecifik TetResponder transgen ekspression hos voksne finner vi normalt bruger fluorescerende billeddannelse af kryosnit. Det er vores erfaring, er fluorescens af fluorescerende proteiner udtrykt af transgen bevaret hele fixation og cryosectioning procedure og kan således direkte afbildes. Yderligere fremgangsmåder til påvisning af TetResponder ekspression, som er blevet beskrevet andetsteds, er: i) immunfarvning på Section, fortrinsvis mod det fluorescerende protein-tag, her YPet, anvendelse af et anti-GFP-antistof, ii) fluorescerende eller chromogene ISH på snit, eller iii ) hel-mount ISH efterfulgt af sektionering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Christa Haase, Doris Weber og Brigitte Korte for teknisk bistand. Arbejdet i Weidinger lab er støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 og af Deutsche Gesellschaft für Kardiologie via en Oskar-Lapp-Stipendium og Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g., Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5,000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g., Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317 (2014).
- Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
- Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610 (2007).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
- Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).
