Introduction
Il pesce zebra è una ben consolidata organismo modello vertebrato per studiare molti aspetti dello sviluppo, fisiologia, patologia, e la rigenerazione. Con la crescente adozione di zebrafish come modello per i processi biologici post-embrionali, strumenti sperimentali per, la manipolazione inducibile tessuto-specifica dell'espressione genica o vie di segnalazione sono diventati sempre più importanti. In particolare, gli studi in organo e rigenerazione appendice in zebrafish adulti hanno sofferto di una mancanza di strumenti per la dissezione dei requisiti spazio-temporali di vie di segnalazione durante questi processi rigenerativi.
Attualmente, tre diversi sistemi sono stati utilizzati per realizzare condizionale, espressione tessuto-specifica del gene in rigenerazione organi di zebrafish adulto: il sistema Cre-lox, espressione mosaico di heat-shock transgeni inducibile mediante trasposoni mediata transgenesi somatica, e il sistema di Teton 1 -3. TETON riferisce ad una variante di un tetraciclina-CONTlaminati sistema di attivazione trascrizionale, dove l'espressione viene attivato in presenza di tetraciclina o un suo derivato, ad esempio doxiciclina. Il sistema Cre-lox, come è finora stato utilizzato in pesci adulti, si basa su un ricombinasi Tamoxifen controllato Cre (CreERT2), la cui espressione è spazialmente limitata da elementi regolatori tessuto-specifici. Rimozione Cre-driven di una cassetta di STOP facilita l'espressione del gene di interesse guidata da un promotore che deve essere attiva in tutti i tipi cellulari 1. Creazione Transposon mediata di transgeni somatiche mosaically espresse offre un sistema di espressione del transgene inducibile in linee cellulari individuali. Iniezione di embrioni di zebrafish con trasposone Tol2 che porta un gene di interesse sotto il controllo trascrizionale di un shock termico risultati promotore in individui chimerici tipicamente portano il transgene solo in linee cellulari discreti di un organo rigenerante 2. Mentre entrambi i sistemi permettono condizionale tessuti speespressione genica fica, il sistema Cre-lox non è reversibile, e la strategia di utilizzo di etichettatura clonale basato trasposoni-risente della sua natura stocastica. Così, noi ed altri hanno recentemente adattato sistemi Teton transgenici per l'utilizzo in zebrafish, che facilitano temporalmente e l'espressione genica spazialmente controllata che si aggiunge sintonizzabile e reversibile 3-5.
Il sistema di Teton qui utilizzato comprende una linea pilota transgenica (TetActivator), in cui un Doxiciclina (DOX) -inducible attivatore trascrizionale (migliorato transattivatore tetraciclina inverso, irtTA, breve Teta) è sotto il controllo di sequenze regolatorie genomiche tessuto-specifici. In secondo luogo, esso richiede una linea transgenica responder (TetResponder) che ospita un gene di interesse sotto il controllo trascrizionale del gestore tetraciclina (Tet elemento di risposta; tetre) (Figura 1A). Pertanto, l'uso di combinazioni specifiche di linee TetActivator e TetResponder consente condizionale tessuto-specificomanipolazione fic dell'espressione genica.
Abbiamo recentemente utilizzato il sistema di Teton a sondare per le funzioni di tessuto-specifici di Wnt segnalazione / beta-catenina nell'adulto rigeneranti coda zebrafish fin 3. Nel protocollo descritto qui si descrive un flusso di lavoro per la messa a punto e l'uso del sistema di Teton in zebrafish, in particolare per gli studi di rigenerazione fin. Questo include le istruzioni dettagliate su come generare linee TetActivator e TetResponder transgeniche stabili e di un protocollo per l'induzione transgene in embrioni e zebrafish adulto. Inoltre, si descrivono tecniche per la verifica dell'espressione genica tessuto-specifica nel rigenerato aletta, compreso un protocollo per la preparazione di criosezioni di pinne zebrafish adulti. Inoltre, si discute considerazioni per la progettazione del transgene TetActivator, la scelta di un metodo di transgenesi e rilevamento di espressione TetResponder. Quindi, l'obiettivo generale di questo protocollo è quello di servire da modelloprevista per il montaggio di un sistema téton funzionale zebrafish per ottenere l'espressione genica condizionale tessuto-specifico, che può essere applicato a qualsiasi tessuto di interesse.
Abbiamo creato un vettore TetActivator consentendo I-SCEI o generazione Tol2 mediata delle linee TetActivator stabili utilizzando sequenze di regolazione genomica brevi (frammenti enhancer; Weidinger laboratorio banca dati plasmide no 1247;. Figura 1B). Questo costrutto contiene una cassetta TetActivator consistente della variante mutante M2 del dominio repressore Tet inverso fuso con il virus Herpes simplex VP16 transattivazione dominio derivato 3F [irtTAM2 (3F)]. Espressione dei TetActivator (TETA) può essere facilmente monitorato dal momento che è co-espressa con il fluoroforo AmCyan dalla stessa griglia di lettura aperta; un peptide P2A media ribosomiale per saltare, che dovrebbe portare la produzione di Teta e AmCyan proteine separate a un rapporto 1: 1 5,6. Il costrutto contiene anche un poylinker 5 'del Tcassette etActivator per facilitare l'inserimento di genomica sequenze regolatrici di interesse utilizzando metodi di clonazione convenzionali.
Inoltre, abbiamo creato un costrutto costituito dal cassetto sopra descritto TetActivator più una cassetta di selezione kanamicina (Weidinger database di plasmide laboratorio no 1180;. Figura 1C), che possono essere ricombinati in un cromosoma artificiale batterico (BAC) contenente una grande regione genomica ( di solito nel codone di inizio di un gene la cui espressione modello deve essere imitata dal transgene). Entrambi i costrutti sono disponibili presso il laboratorio Weidinger su richiesta.
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Protocol
1. Generazione di transgeniche TetActivator pesce Lines
- Generazione di TetActivator costrutto
- Clone sequenze regolatrici di interesse monte della cassetta TetActivator nel vettore # 1247 utilizzando tecniche standard. In alternativa, utilizzare tecniche di ricombinazione per generare un BAC, in cui la cassetta TetActivator (vector # 1180) è inserito nel primo esone del gene bersaglio, e dove il Tol2 invertita ripetizioni sono introdotti nel backbone BAC (per un protocollo recombineering dettagliata vedere 7,8).
- Preparare tossina-libero plasmide DNA o preparazioni di DNA BAC utilizzando kit disponibili in commercio.
- Generazione di linee di pesce TetActivator transgenici
- Eseguire microiniezione del costrutto TetActivator secondo le procedure standard 9.
- Iniettare 25-50 pg del DNA plasmide o fino a 250 pg BAC DNA in embrioni di una cella stadio insieme con ridotta codificazione RNA per Tra tol2nsposase per transgenesi trasposoni-mediata, o con proteine I-SCEI per transgenesi I-SCEI-mediata.
NOTA: Considerazioni sulla scelta del metodo transgenesi si trovano nella sezione di discussione.
NOTA: Iniettare preferibilmente nel citoplasma, non il tuorlo, dal momento che l'efficienza di transgenesi potrebbe diminuire quando il DNA non viene consegnato nel citoplasma.
- Iniettare 25-50 pg del DNA plasmide o fino a 250 pg BAC DNA in embrioni di una cella stadio insieme con ridotta codificazione RNA per Tra tol2nsposase per transgenesi trasposoni-mediata, o con proteine I-SCEI per transgenesi I-SCEI-mediata.
- Sollevare embrioni G0 iniettati fino all'età adulta. Facoltativamente, embrioni schermo G0 per AmCyan fluorescenza e preferenzialmente crescono embrioni che mostrano il pattern di espressione desiderata. Questo potrebbe aumentare il tasso di trasmissione della linea germinale, in particolare per transgenesi Tol2-mediata.
- Valutare positiva integrazione germinale da incroci pesci G0 individualmente wild-type pesci e l'aspetto della fluorescenza AmCyan nel pattern di espressione previsto embrioni F1 o larve usando uno stereomicroscopio a fluorescenza (esempio è mostrato nella Figura 1D).
- Sollevare fluorescenza positivaEmbrioni F1 all'età adulta e si accoppiano con wild-type di pesce per ottenere stabile pesce F2 transgenici.
- Sollevare e caratterizzare almeno 3 diversi sottolinee derivate da diversi pesci G0 fondatore, dal momento che le singole linee potrebbero differire in livelli di espressione, pattern di espressione, la capacità di indurre linee TetResponder, leakiness, e la loro predisposizione a tacere.
NOTA: Molti transgeni che sono robustamente espressi in embrioni sono parzialmente o completamente al silenzio in fase avanzata o larve di pesci adulti. Così, se le linee sono destinati ad essere utilizzati in pesci adulti, caratterizzare diverse linee indipendenti per la loro espressione e la funzione TetActivator durante l'età adulta.
NOTA: Abbiamo generato un pannello di linee TetActivator per l'espressione tessuto-specifica del TetActivator sia in embrioni e adulti pesci, che sono elencati nella tabella 1 Queste linee sono disponibili presso il laboratorio Weidinger su richiesta..
- Eseguire microiniezione del costrutto TetActivator secondo le procedure standard 9.
2. Generazione di transgenici TetResponder Pesci Lines
NOTA: Abbiamo generato un costrutto TetResponder consentendo I-SCEI o generazione Tol2 mediata delle linee TetResponder stabili, che è disponibile presso il laboratorio Weidinger su richiesta (Weidinger database di laboratorio plasmide no 1444; Figura 1E.). Questo costrutto contiene un operatore Tetraciclina, seguita da una regione polilinker facilitare l'inserimento di sequenze codificanti (CDS) di un gene di interesse e la sequenza codificante YFP-derivato YPet. Pertanto, il costrutto è progettato per l'espressione teta-mediata di una fusione C-terminale della proteina di interesse con YPet. Se deve essere evitato espressione di una proteina di fusione etichettato, un P2A o t2a peptide può essere introdotto con il gene di interesse CDS, che facilita co-espressione della proteina di interesse e YPet come polipeptidi separati 6,10.
- Generazione di TetResponder costrutto
- CDS clone del gene di interesse 3 'dell'operatore tetraciclinae 5 'dei CDS YPet secondo le procedure standard. Assicurarsi che il codone di stop è stato rimosso dal gene di interesse CDS.
- Preparare senza tossine preparativi plasmide DNA utilizzando kit disponibili in commercio.
- Generazione di linee di pesce TetResponder transgenici
- Eseguire la microiniezione di TetResponder costruire secondo le procedure standard 9.
- Iniettare 25-50 pg del DNA plasmide nel citoplasma di embrioni di una cella stadio insieme con ridotta senso codificazione RNA per tol2 trasposasi per transgenesi transposon mediata o con I-SCEI enzimatico per transgenesi meganuclease assistita.
NOTA: Considerazioni sulla scelta del metodo transgenesi si trovano nella sezione di discussione.
NOTA: Iniettare preferibilmente nel citoplasma, non il tuorlo, dal momento che l'efficienza di transgenesi potrebbe diminuire quando il DNA non viene consegnato nel citoplasma.
- Iniettare 25-50 pg del DNA plasmide nel citoplasma di embrioni di una cella stadio insieme con ridotta senso codificazione RNA per tol2 trasposasi per transgenesi transposon mediata o con I-SCEI enzimatico per transgenesi meganuclease assistita.
- Sollevare iniettato embrioni G0 ad undulthood.
- Valutare riuscita integrazione germinale e inducibilità del transgene accoppiando pesce G0 individuo con una linea TetActivator precedentemente stabilito, seguito da un trattamento doxiciclina degli embrioni F1 o F1 larve.
NOTA: Di solito si usa una linea TetActivator promotore-driven ubiquitina (ubiquitina: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2, breve ubiquitina: Teta AmCyan 3) per lo screening per i vettori TetResponder funzionali, come la linea guida espressione abbastanza onnipresenti in embrioni e adulti pesce e quindi è adatto a valutare TetResponder inducibility in tutti i tessuti di interesse. Questa linea è disponibile presso il laboratorio Weidinger su richiesta. - Raccogliere gli embrioni di ogni innesto in un piatto a parte 10 centimetri di Petri contenente E3 medio embrione (vedi tabella dei materiali) e incubare piatti a 28,5 ° C.
- Fish Place G0 che ha dato gli embrioni in singole vasche numerati (scatole di allevamento; vedi tabella Materiali) finché gli embrioni sono stati schermoed. Questo permette un ripristino di pesci G0 che mostrano germe trasmissione riga del transgene.
- Se solo la metà degli embrioni sono tenuti a portare il transgene TetActivator (nel caso in cui un vettore TetActivator eterozigote era attraversato da uno dei fondatori di pesce TetResponder), selezionate per gli embrioni contenenti il transgene TetActivator dalla comparsa di AmCyan fluorescenza in fase di sviluppo adeguato.
- Indurre attività trascrizionale TetActivator trattando embrioni con doxiciclina (DOX), come descritto nella sezione 2.3.
- Embrioni schermo F1 per emergere YPet fluorescenza. Preferire le linee (pesce G0) che producono l'espressione YPet omogeneo, cioè embrioni in frizione dovrebbero mostrare poco mosaicismo all'interno del dominio espressione atteso e piccole variazioni tra i singoli embrioni. Vedi punte di freccia in Figura 1F e Figura 1G per esempi rappresentativi.
- Mate G0 pesce trasmettere un transgene TetResponder inducibile identificatopunto 2.2.8 con wild-type di pesce ed aumentare tutti gli embrioni di F1 per l'età adulta.
- Identificare adulto pesce F1 transgenici mediante genotipizzazione basata sulla PCR (vedi sezione o attraversando pesce F1 individuale ad una linea TetActivator seguito da trattamento DOX di embrioni F2 e comparsa di YPet fluorescenza (vedi paragrafo 2.5).
- Stabilire e caratterizzare almeno 3 diversi sottolinee TetResponder derivate da diversi pesci G0 fondatore, dal momento che inducibilità potrebbe differire in singole linee. In particolare i livelli di espressione realizzabili e se il risponditore può essere attivato in tutti i tipi di cellule può variare. In aggiunta, la suscettibilità alle silenziamento sarà diverso tra le righe. Infine, in alcuni casi può essere preferibile selezionare linee che mediano solo livelli moderati di espressione della proteina di interesse, in particolare se espressione leaky prodotto in combinazione con una linea TetActivator in assenza di doxiciclina dovrebbe causare difetti di sviluppo o tossicità.
NOTA: TetLinee risponditore che sono robustamente inducibile in embrioni possono essere parzialmente o totalmente a tacere in fase avanzata larve o pesci adulti. Così, se le linee sono destinati ad essere utilizzati in pesci adulti, diverse linee indipendenti devono essere caratterizzati per inducibilità negli adulti. Se l'induzione del gene di interesse è compatibile con ulteriore sviluppo, si è dimostrata utile per creare doppie embrioni transgenici (TetActivator x TetResponder), per indurre l'espressione GOI in embrioni e per selezionare e sollevare solo gli individui che mostrano il mosaico più robusta e meno induzione. - Per mantenere e diffondere linee TetResponder stabiliti, il genotipo dei pesci adulti come descritto nel paragrafo 2.5).
- Eseguire la microiniezione di TetResponder costruire secondo le procedure standard 9.
- Trattamento Doxiciclina degli embrioni
- Preparare 2,000x Doxiciclina (DOX) le scorte. Risolvere DOX in 50% EtOH per ottenere una concentrazione di 50 mg / ml (97 mM). Conservare le scorte DOX al riparo dalla luce a -20 ° C.
- Decantare la maggioranza di E3 medio da embrioni e sostituirlo conMedio E3 embrione contenente DOX ad una concentrazione finale di 25 mg / ml DOX (2,5 ml di 2,000x DOX magazzino per 50 ml E3). Dechorionation non è necessaria.
- Embrioni Torna a 28,5 ° C per un minimo di 6 ore prima di valutare l'espressione del gene tag di interesse da parte di comparsa di YPet fluorescenza.
- Valutare leakiness del / combinazione di TetActivator TetResponder trattando embrioni con EtOH solo solvente.
NOTA: L'ibridazione in situ (ISH) o RT-PCR per rilevare la TetResponder mRNA può essere utilizzato come misure più sensibili leakiness rispetto alla fluorescenza del gene tag di interesse. Il grado di leakiness dipenderà dalla particolare combinazione linea TetActivator / TetResponder e può anche variare tra tessuti e stadi di sviluppo.
- Anestesia di zebrafish adulto
- Preparare 10 cm di diametro Petri dish o piccolo bicchiere pieno d'acqua sistema pesce contenente 1 mg / ml Tricaine (Etil-3 amminobenzoato methanesulfonate, MS-222).
- Trasferire pesce contenitore contenente anestetico e attendere fino a raggiungere il livello 4 di anestesia come indicato dalla completa perdita di equilibrio (pesce si trova su un lato), senza movimenti e nessuna risposta a toccare 11.
- Trasferimento con attenzione il pesce con una pinzetta o un cucchiaio su un vetrino, coperchio di una scatola di Petri in plastica, o Petri agarosio rivestite ed eseguire l'amputazione delle pinne o per immagini (vedi paragrafo 3.2).
- Pesci ritorno ad un contenitore contenente un grande volume di acqua sistema di pesce fresco e monitorare. Se i movimenti delle branchie non riprendono nel raggio di 3 minuti, assistere soffiando acqua sulle branchie con una pipetta di trasferimento in plastica.
- Genotipizzazione PCR-based di TetResponder pesce
- Eseguire l'amputazione parziale della pinna caudale 12. Mettere il pesce in singole, serbatoi numerate (scatole di allevamento; vedi tabella dei materiali). Questo consente il recupero di pesci transgenici seguente genotipizzazione successo.
- Transfer tessuti fin ai singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti PCR pre-riempita con acqua priva di DNase 20 microlitri per l'isolamento del DNA genomico 13.
- Aggiungere 120 microlitri 1 M NaOH a ciascun pozzetto ed incubare campioni per 20 min a 95 ° C utilizzando un termociclatore.
- Campioni Chill 4 ° C, aggiungere 14 ml di 1 M Tris-HCl (pH 8.0) per ogni bene, e campioni brevemente vortex. Campioni di centrifugazione per 5 minuti a 16.000 xg a pellet detriti cellulari. Conservare DNA genomico a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Primer design per amplificare specificamente un frammento del transgene TetResponder. Utilizzare 2 ml di DNA isolato in una reazione PCR standard e analizzare prodotto di PCR su un gel di agarosio.
3. Tissue-specifica induzione del transgene espressione in coda Adult Rigenerante Zebrafish Fin
- Istituzione di TetActivator; TetResponder doppio pesci transgenici
- Mate vettori TetActivator con TetResponder carriers.
- Selezionare embrioni aventi il transgene TetActivator in fase di sviluppo in cui gli elementi regolatori che guidano la cassetta TetActivator sono attivi. Embrioni transgenici possono essere facilmente identificati dalla comparsa di AmCyan fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza stereo.
NOTA: i pesci transgenici positivi TetActivator possono inoltre essere identificati durante l'età adulta per l'imaging di pesce anestetizzato, per esempio. dopo l'amputazione della pinna caudale e l'emergere della fluorescenza AmCyan nel rigenerato. - Sollevare embrioni selezionati per l'età adulta.
- Identificare doppia pesci adulti transgenici (pesce che portano il TetResponder oltre al TetActivator) di genotipizzazione basato su PCR o (preferibilmente) dalla loro capacità di indurre l'espressione del TetResponder nel tessuto di interesse. Un protocollo per l'induzione TetResponder e la rilevazione della pinna caudale rigenerante è descritta nella sezione 2.3 e la sezione 4.
NOTA: Se l'espressione TetResponder transitoria è compatibilecon ulteriore sviluppo embrionale o larvale, è utile identificare doppie embrioni transgenici portatori TetActivator e TetResponder transgeni seguenti trattamento DOX durante lo sviluppo embrionale come descritto sopra (punto 2.3, figura 1H). Embrioni doppi positivi mostreranno AmCyan e YPet fluorescenza. Sollevare embrioni positivi verso l'età adulta.
- Amputazione di alette di coda zebrafish e induzione di espressione del transgene nella pinna rigenerante
- Eseguire l'amputazione parziale della pinna caudale di pesce anestetizzato (vedi paragrafo 2.4) 12. Trattare pesce sia immediatamente con DOX o restituirli per il sistema abitativo pesce.
- Preparare scatola allevamento (Figura 2A; vedi tabella materiali) riempito con 1 l di acqua sistema di pesce contenente 25 mg / ml DOX (aggiungere 500 ml di 2,000x 50 mg / ml di brodo di 1 l di acqua sistema di pesce).
NOTA: Induzione dell'espressione del transgene immediatamente dopo amputazione permette avaluta- degli effetti sulla eventi precoci durante la rigenerazione, mentre l'induzione a 3 giorni dopo l'amputazione (3 dpa) dovrebbe essere utilizzato per valutare l'espressione o la funzione transgene durante la crescita rigenerativa. - Trasferimento fino a 10 precedentemente amputata, doppio pesci transgenici alla casella di allevamento e vicino scatola con un coperchio in modo che il pesce non può sfuggire (Figura 2A).
- Mettere scatole allevamento nel buio per ridurre lo stress. Noi di solito poniamo le scatole in un incubatore d'aria 28.5 ° per garantire l'oscurità e temperatura costanti.
- Trattare controllo negativo doppio pesci transgenici con EtOH solo (250 ml per acqua sistema 1L pesce).
NOTA: transgenico singolo o wild-type pesci trattati con DOX può essere utilizzato come ulteriore controllo negativo, anche se non abbiamo mai osservato effetti negativi delle dosi DOX usati qui sulla rigenerazione della pinna. - Anestetizzare pesce come descritto nella sezione 2.4 e pesce trasferimento con una pinzetta o un cucchiaio su un petri agarosio rivestite bagnata piatto. Diffondere con cautela la pinna caudale con una pinzetta.
- Pesce schermo per comparsa di YPet all'interno rigenerato con una fluorescente stereomicroscopio (Figura 2B).
NOTA: Di solito, fluorescenza TetResponder-driven può essere osservato con fermezza dopo 6 ore di trattamento DOX. Tuttavia, si consiglia di caratterizzare le dinamiche di espressione TetResponder per ogni linea generata. - Pesce Tornare al sistema di allevamento dei pesci di interrompere induzione transgene TetResponder o continuare i trattamenti.
NOTA: Per i trattamenti> 24 ore (trattamenti a lungo termine), è essenziale per lo scambio di acqua e pulire accuratamente le caselle di allevamento quotidiano. - Durante trattamenti a lungo termine, pesce mangimi ogni 2-3 giorni per il trasferimento di pesce in un contenitore pulito con acqua sistema pesce fresco prima di restituirli alle scatole di allevamento dopo la poppata.
4. Caratterizzazione di TetResponder espressione in Fin Rigenera
t ">. NOTA: Di solito verifichiamo l'espressione genica tessuto-specifica nella pinna caudale rigenerazione utilizzando immagini a fluorescenza di criosezioni alle 3 dpa A questo punto momento i diversi compartimenti di un rigenerato sono formate e sono chiaramente identificati in tessuto sezioni, e criosezionamento è più semplice rispetto a successive fasi di rigenerazione. Figura 2C mostra i domini di tessuto che si possono distinguere in rigenerare e elenca alcuni marcatori molecolari per questi domini. Il protocollo che segue descrive la preparazione di criosezioni longitudinali o trasversali per l'imaging diretto o immunocolorazione .- Criosezionamento di alette di coda per adulti
- Trattare pesce la cui coda pinne furono amputate da 2 dpa fino al 3 dpa con DOX come descritto nella sezione 3.2
- Anestetizzare pesce come descritto nella sezione 2.4
- Utilizzare un cucchiaio o una pinzetta per trasferire delicatamente il pesce su un coperchio di una piastra di Petri di plastica.
- Re-amputare il rigenerato aletta a circa 4-5 segmento osseos prossimale al piano di amputazione iniziale utilizzando un bisturi e restituire il pesce di acqua dell'impianto di pesce fresco.
- Trasferire accuratamente rigenera in una piccola capsula di Petri (ad esempio, 35 mm) contenente 4% (w / v) paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS; vedi tabella Materials) utilizzando una pinzetta sottile. Non toccare il rigenerato, ma solo la parte ceppo del tessuto.
- Collocare il tessuto di piatto sul fondo capsula di Petri e fissare O / N a 4 ° C.
- Lavare rigenera due volte in PBS 1x contenente 0,1% Tween (PBT) per rimuovere PFA e incubare rigenera O / N a 4 ° C in 0,5 M EDTA-PBS (pH 7,5) alla decalcificazione matrice ossea.
- Incubare rigenera a RT al 10% di saccarosio-PBS, 20% di saccarosio-PBS, 30% di saccarosio-PBS e 30% di saccarosio-PBS: tessuto congelamento medio a rapporto 1: 1 (TFM; vedi tabella Materiali) per 30 minuti ciascuno. Successivamente, incubare alette a 4 ° C per> 2 ore nel tessuto medio congelamento.
- Mettere cryomolds su un vetrino da microscopio e riempire ilm con il mezzo di congelamento dei tessuti. Evitare l'introduzione di bolle d'aria.
- Trasferimento rigenera in cryomolds e tessuti orientare opportunamente per ottenere sezioni longitudinali o trasversali di rigenera fin (Figura 2D). Assicurarsi che rigenerare è dritto, che facilita il sezionamento.
- Transfer cryomolds insieme microscopio su una griglia metallica posizionata su un letto di ghiaccio secco per avviare il processo di congelamento (Figura 2D).
- Una volta che il mezzo di congelamento del tessuto è diventato solido, luogo cryomold sulla panchina e lasciate riposare a temperatura ambiente per qualche minuto in modo che il tessuto congelamento medio scongela all'interfaccia plastica-medio.
- Utilizzare una penna o simile per spingere il blocco congelato dal cryomold. Conservare cryoblocks in una scatola a -80 ° C fino al sezionamento dei tessuti.
- Preparare 10-14 micron di spessore criosezioni utilizzando un Cryo-microtomo e raccogliere sezioni su vetrini da microscopio di adesione (vedi tabella dei materiali). Conservare i vetrini a -20 ° C fino a quando neEDED.
- Caratterizzazione di espressione TetResponder sui tratti fin sulla base YPet fluorescenza
- Trattare sezioni pinna per 30 minuti con 100% MeOH raffreddato a -20 ° C per migliorare l'aderenza al vetrino seguito da due lavaggi a RT in PBT e 1 lavaggio in PBS, 5 min ciascuna.
- Visualizzare nuclei per sezioni incubando per 10 min a 4 ', 6- diamidino-2-phenylinodole (DAPI) in PBS (1: 5.000) seguito da due lavaggi 10 min ciascuno in PBS.
- Sezioni Mount nel 75% glicerolo-PBS o supporti antifade disponibili in commercio, e coprire con un vetrino di copertura.
- Immagine YPet e fluorescenza AmCyan al microscopio a fluorescenza confocale o grande campo (Figura 1E).
NOTA: Per facilitare l'identificazione univoca dei tipi di cellule che esprimono YPet, immunofluorescenza o immunoistochimica con anticorpi contro antigeni specifici delle cellule di tipo insieme con gli anticorpi anti-GFP (che reagisce con YPet, ma non AmCyan) possono essere eseguite. In alternativa, per facilitare l'individuazione di espressione YPet deboli, RNA ibridazione in situ contro YPet RNA può essere effettuato con il tutto il montaggio pinne o sezioni di paraffina di pinne.
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Representative Results
Per stabilire un sistema di Teton funzionale per l'espressione del gene inducibile tessuto-specifica, TetActivator transgenici e linee TetResponder bisogno di essere generato (Figura 1A). Questo si ottiene microinjecting TetActivator (Figura 1B - C) o TetResponder (Figura 1E) costruisce in embrioni di zebrafish e la successiva integrazione della linea germinale. Costrutti TetActivator funzionali possono essere generati sia per clonazione di brevi sequenze regolatorie (elementi enhancer) a monte della cassetta TetActivator (Figura 1B), o ricombinando la cassetta TetActivator in un BAC contenente elementi regolatori del gene di interesse (Figura 1C). L'integrazione della linea germinale del costrutto TetActivator può essere valutata mediante incroci individuale iniettato pesce G0 e l'aspetto del AmCyan fluorescenza negli embrioni di F1 nel pattern di espressione prevista (Figura 1D). Linea germinale integrazione e la funzionalità del transgene TetResponder possono essere valutati incrociando individuale G0 pesce iniettato al pesce TetActivator stabilito (qui ubiquitina: teta AmCyan), seguito da un trattamento con DOX e l'aspetto di YFP / YPet fluorescenza (Figura 1F). Pesce mostrando espressione forte e omogeneo YFP / YPet dovrebbe essere preferito a stabilire una linea TetResponder stabile (Figura 1G). Avendo stabilito TetActivator stabile e linee di pesce TetResponder, specifiche combinazioni TetActivator / TetResponder può essere generato da attraversare. Portatori di TetActiator e TetResponder transgeni possono essere identificati durante l'embriogenesi dopo il trattamento DOX fine emergere di YFP / Ypet nella fase dello sviluppo del TetActivator è attivo (Figura 1 H). In alternativa, i pesci transgenici doppie possono essere identificati in seguito a trattamento DOX e induzione transgene TetResponder nella pinna caudale rigenerante (Figura 2A - B).
< p class = "jove_content"> Usiamo abitualmente questo sistema per raggiungere inducibile, l'espressione genica tessuto-specifica nella rigenerazione pinna caudale zebrafish. Verifichiamo tessuto-specifica espressione TetResponder transgene per imaging di fluorescenza di criosezioni di 3 DPA rigenera pinna, dal momento che i vari compartimenti di una rigenerata possono essere chiaramente identificati in tessuto sezioni in questo momento-punto (Figura 2C). Pinna longitudinale o trasversale rigenerare sezioni sono ottenuti criosezionamento dopo cryoprotecting tessuti e l'inclusione fin rigenerare in modo appropriato (Figura 2D). A seguito di sezionamento, l'espressione del transgene TetResponder (Ypet / YFP fluorescenza) può essere ripreso con fluorescenza o microscopia confocale (Figura 2E). Si noti che il TetActivator her4.3 promotore-driven induce TetResponder espressione nel blastema mediale prossimale, mentre il blastema distale (freccia) e l'epidermide (freccia) sono privi di espressione. ove_content ">
Figura 1: Generazione di linee TetActivator e TetResponder transgenici. (A) del fumetto che mostra strategia per l'espressione del gene inducibile tessuto-specifica utilizzando il sistema di Teton. (B) transgenico TetActivator costruire (Weidinger database di plasmide laboratorio n. 1247). Un polylinker 5 'della TetActivator irtTAM2 (3F) facilita cLöning di sequenze regolatrici di interesse. La sequenza codificante AmCyan è separato dal TetActivator tramite un P2A peptide 'auto-scissione'. La cassetta contiene anche un segnale SV40 poliadenilazione, è affiancata da Tol2 trasposoni invertito ripete e contiene un unico sito di riconoscimento meganuclease I-SCEI. (C) cassette TetActivator per BAC recombineering (Weidinger database di plasmide laboratorio n. 1180). La cassetta include il gene kanamicina per la selezione, che è guidato da un promotore procariotico gb3. Siti FRT che fiancheggiano il gene di resistenza Kanamicina consentono la sua Flp-ricombinasi rimozione mediata seguente riuscita integrazione della BAC. (D) Identificazione di G0 fondatore pesce trasmettere il her4.3: Teta AmCyan costruire attraverso la loro linea germinale. I vettori sono identificati con comparsa di fluorescenza AmCyan in alcuni embrioni F1 (frecce). (E) transgenico TetResponder costruire (Weidinger database di plasmide laboratorio n. 1444).Questo costruisce costituito da un polylinker e YPet CDS sotto il controllo degli elementi di risposta ottimizzati Tet (tetre tenuta, Clontech) e terminato dal segnale SV40 poliadenilazione. E 'affiancata da Tol2 trasposoni invertito ripete e contiene un unico sito di riconoscimento meganuclease I-SCEI. (F) Identificazione di G0 fondatore pesce trasmettere un funzionale TetResponder tetre: Axin1-YFP costruire attraverso la loro linea germinale. I vettori sono identificati da incrocio con una linea consolidata TetActivator (qui ubiquitina: Teta AmCyan) e induzione di YFP fluorescenza dopo il trattamento DOX per 6 ore (punte di freccia). (G) Primo piano ofembryos mostrati in (F) dopo un totale di 12 ore di trattamento DOX. Nota di induzione abbastanza onnipresente YFP fluorescenza. (H) Identificazione di doppi embrioni transgenici portatori TetActivator (her4.3: Teta AmCyan) e TetResponder (tetre: Axin1-YFP) transgeni (frecce). Embrioni noire trattati con DOX per 6 ore. (A - H) Scala bar: 500 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: L'utilizzo del sistema Teton per l'espressione genica tessuto-specifica nella rigenerazione pinna caudale zebrafish. (A) scatole di allevamento utilizzati per il trattamento DOX di zebrafish adulto. (B) Induzione di tetre: Axin1-YFP TetResponder transgene dal her4.3: Teta AmCyan TetActivatornella pinna caudale rigenerante dopo 12 ore di trattamento DOX. Si noti l'assenza di YFP fluorescenza pesci di controllo EtOH-trattata. (C) del fumetto raffigurante alcuni dei compartimenti si trovano all'interno di un rigenerato pinna alle 3 dpa in una vista in sezione longitudinale. (D) Preparazione del campione per criosezionamento. Rigenera Fin sono messi in mezzo tessuto-congelamento (TFM) -filled cryomolds, orientati in modo appropriato per ottenere sezioni o longitudinali o trasversali della rigenerare, e trasferiti in un telaio metallico seduta sulla cima di ghiaccio secco fino a TFM si è solidificato. Piano di sezione è indicato in rosso. Abbreviazioni: dist .: distale, prox .: prossimali, sfogo .: ventrale, dors .: dorsale. (E) Confocal immagine di YFP fluorescenza in una sezione longitudinale di un rigenerato raggio aletta derivato da alette mostrati in (B). Si noti che la her4.3: linea di Teta AmCyan TetActivator spinge induzione YFP in particolare nel blastema prossimale-mediale. YFPfluorescenza non viene rilevata in una varietà di scomparti, compreso l'epidermide ferita (freccia) e distale più a dominio del mesenchima (freccia) (BC) barra Scala: 500 micron; (E) bar Scala:. 100 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Linea TetActivator | Riferimento | Elementi normativi utilizzati | Principalmente espresso in |
| 7xTCF-Xla.Siam: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan | Wehner & Weidinger, inedito | 7xTCF-Xla.Siam Wnt giornalista 1 | Tessuti Wnt-responsive |
| myl7: irtTAM2 (3F) -p2a-mCherry | Haase & Weidinger, inedito | myl7 (cmlc2) 2 | cardiomiociti maturi |
| her4.3: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm6 | 3 | her4.3 4 | sistema nervoso centrale |
| keratin4: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm5 | 3 | keratin4 5 | epidermide, nella pinna adulti escludendo strato basale |
| keratin18: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm4 | 3 | keratin18 6 | epidermide, nella pinna adulta esclusivamente nello strato basale |
| SP7: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm3 | 3 | SP7 / osx 7 | (Impegnati) osteoblasti |
| ubiquitina: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2 | 3 | ubiquitina 8 | (Abbastanza) onnipresente |
Tabella 1:. Disponibile linee TetActivator transgeniche Questa tabella elenca TetActiva transgenicoLinee tor di espressione tessuto-specifica del TetActivator sia pesce embrionali e adulte, che sono disponibili presso il laboratorio Weidinger su richiesta.
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Discussion
Il zebrafish adulto ha una straordinaria capacità di rigenerare con successo molti organi interni e appendici. Una conoscenza approfondita dei meccanismi molecolari e cellulari coinvolti richiede un'analisi tessuto-specifica delle funzioni dei geni e vie di segnalazione. Verso questo, il sistema di Teton fornisce un efficace strumento per l'espressione genica controllata spatiotemporally in zebrafish embrionali e adulte. I costrutti sistema Teton e metodologie descritte in questo manoscritto sono stati utilizzati con successo in un recente studio del nostro laboratorio 3. I seguenti problemi supplementari devono essere considerati quando si stabilisce il sistema di Teton:
TetActivator Considerazioni sulla progettazione transgene
Abbiamo precedentemente dimostrato che un singolo TetActivator-inducibile consistente della variante mutante M2 del dominio repressore inverso Tet fuso con il virus Herpes simplex VP16 transactivation dominio derivato 3F [irtTAM2 (3F), in breve Teta-M2] conferisce induzione efficiente, ma può mostrare bassa, anche se leakiness misurabile, vale sfondo inducendo l'attività in assenza di doxiciclina (DOX) 5. Pertanto, abbiamo descritto doppiamente sistemi inducibili mediante fusioni con un recettore glucocorticoide (teta-GBD) o in un dominio del recettore ecdisone (teta-ECR), che eliminano leakiness 5. Così, se si intende utilizzare il sistema per esprimere proteine tossiche o molto potenti (per esempio, oncogeni) l'uso di una variante doppiamente inducibile dovrebbe essere considerato. In alternativa, durante la creazione di linee TetActivator e TetResponder possibile selezionare una serie di linee di produzione differenti livelli di espressione e induttori più deboli scelti in caso leakiness è un problema con le linee fortemente che inducono. Costrutti TetActivator contenenti la variante Teta-GBD o teta-ECR sono disponibili presso il laboratorio Weidinger su richiesta.
Metodi transgenesi per la generazione di linee di zebrafish transgenici
TetResponder analisi espressione del transgene
Per rilevare l'espressione del transgene TetResponder tessuto-specifica in pinne adulti usiamo solitamente per immagini a fluorescenza di criosezioni. Nella nostra esperienza, la fluorescenza di proteine fluorescenti espresse dal transgene è conservato per tutta la fixation e criosezionamento procedura e quindi può essere ripreso direttamente. Metodi aggiuntivi per il rilevamento di espressione TetResponder, che sono stati descritti altrove, sono: i) immunocolorazione su sezioni, preferibilmente contro il tag proteina fluorescente, qui YPet, utilizzando un anticorpo anti-GFP, ii) ISH fluorescenti o cromogenico sulle sezioni, o iii ) tutto il montaggio ISH seguito da sezionamento.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano Christa Haase, Doris Weber e Brigitte Korte per l'assistenza tecnica. Il lavoro in laboratorio Weidinger è sostenuto da finanziamenti della Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 e dalla Deutsche Gesellschaft für Kardiologie tramite un Oskar-Lapp-Stipendium e Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g., Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5,000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g., Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
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