Introduction
Sebrafisk er et veletablert virveldyr modellorganisme for å studere mange aspekter av utvikling, fysiologi, sykdom og regenerering. Med den økende bruk av sebrafisk som en modell for post-embryonale biologiske prosesser, eksperimentelle verktøy for induserbar, vev-spesifikk manipulering av genekspresjon eller signalveier er blitt stadig viktigere. Spesielt har undersøkelser i organ og vedheng regenerering hos voksne sebrafisk lidd av mangel på verktøy for disseksjon av rom-tid-kravene til signalveier i disse regenerative prosesser.
Foreløpig har tre forskjellige systemer blitt brukt til å oppnå betinget, vev-spesifikk genekspresjon i regenererende organer av voksen sebrafisk: Cre-lox system, mosaikk uttrykk for varmesjokk induserbare transgener ved hjelp transposonet-mediert somatisk transgenesis, og Teton system 1 -3. Teton refererer til en variant av en tetracyklin-contvalset transkripsjonen aktiveringssystem, hvor ekspresjon blir aktivert i nærvær av antibiotikumet tetracyklin, eller et derivat, f.eks doksycyklin. CRE lox-system, slik det hittil har vært brukt i voksen fisk, er avhengig av en Tamoxifen styrt Cre rekombinase (CreERT2), hvis ekspresjon er romlig begrenset av vevsspesifikke regulatoriske elementer. Cre-drevet fjerning av et STOP kassett letter ekspresjon av genet av interesse drevet av en promoter som skal være aktive i alle celletyper en. Transposon-mediert etableringen av mosaically uttrykt somatiske transgener gir et system for induserbar transgene uttrykk i enkelte celle linjene. Injeksjon av sebrafisk embryoer med et Tol2 transposon bærer et gen av interesse under transkripsjonen kontroll av en varmesjokkpromotor resulterer i kimære individer vanligvis bærer transgenet bare i adskilte celle linjer av et regenererende organ 2. Mens begge systemene tillater betinget tissue-specific genuttrykk, er Cre-lox systemet ikke reversible, og strategien bruker transposonet baserte klonal merking lider av sin stokastiske natur. Dermed har vi og andre nylig tilpasset transgene Teton systemer til bruk i sebrafisk, som letter timelig og romlig-kontrollerte genuttrykk som er i tillegg fleksibel og reversibel 3-5.
The Jackson system som brukes her omfatter en transgen linje driver (TetActivator) hvor en Doksycyklin (DOX) -inducible transkripsjonen aktivator (forbedret omvendt tetracyklin transaktivator, irtTA, kort TETA) er under kontroll av vevsspesifikke regulatoriske genomiske sekvenser. For det andre krever den en transgen linje responder (TetResponder) som havner et gen av interesse under transkripsjonen kontroll av Tetracycline operatør (Tet responselement, Tetre) (figur 1A). Dermed tillater bruk av bestemte kombinasjoner av TetActivator og TetResponder linjer for betinget tissue-spesiFIC manipulering av genuttrykk.
Vi har nylig brukt Teton system å sondere for vevsspesifikke funksjoner av Wnt / beta-catenin signale i voksen regenererende sebrafisk halefinnen tre. I protokollen skissert her beskriver vi en arbeidsflyt for oppsett og bruk av Teton system i sebrafisk, spesielt for studier av fin regenerering. Dette inkluderer detaljerte instruksjoner om hvordan å generere stabile transgene TetActivator og TetResponder linjer og en protokoll for transgen induksjon i embryoer og voksen sebrafisk. Videre beskrives metoder for verifikasjon av vev-spesifikk genekspresjon i finnen regenerere, inkludert en protokoll for fremstilling av frysesnitt av voksne sebrafisk finnene. I tillegg diskuterer vi hensyn til utformingen av TetActivator transgenet, valg av en transgenesis metode, og påvisning av TetResponder uttrykk. Derfor er den overordnede målet med denne protokollen er å tjene som en blåkopifor å sette opp et funksjonelt Jackson system i sebrafisk for å oppnå betinget vev-spesifikk genekspresjon, som kan brukes på alle vev av interesse.
Vi har laget en TetActivator vektor slik at for I-SCEI eller Tol2-mediert generasjon av stabile TetActivator linjer ved hjelp av korte genomiske regulatoriske sekvenser (enhancer fragmenter; Weidinger lab plasmid database no 1247;. Figur 1B). Denne konstruksjon inneholder et TetActivator kassett bestående av M2 muterte variant av den reverserte Tet repressor domene fusert med Herpes simplex virus VP16 trans domene-derivatet 3F [irtTAM2 (3F)]. Ekspresjon av TetActivator (TETA) kan lett overvåkes siden det er ko-uttrykt med fluoroforen AmCyan fra den samme åpne leseramme; en P2A peptid medierer ribosomalt hopper, som skulle resultere i produksjon av TETA og AmCyan som separate proteiner ved et 1: 1-forhold 5,6. Konstruksjonen inneholder også en poylinker 5 'av TetActivator kassett for lettere å plassere genomiske regulatoriske sekvenser av interesse med konvensjonelle kloning metoder.
I tillegg har vi laget en konstruksjon som består av de ovenfor beskrevne TetActivator kassetten samt et Kanamycin utvalg kassetten (Weidinger lab plasmid database no 1180;. Figur 1C), som kan bli rekombinert inn i et bakterielt kunstig kromosom (BAC) som inneholder en stor genomisk region ( vanligvis inn i startkodonet til et gen hvis ekspresjon mønster som skal etterlignes ved transgenet). Begge konstruksjoner er tilgjengelige fra Weidinger lab på forespørsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generasjon av transgene TetActivator Fisk Lines
- Generering av TetActivator konstruere
- Clone regulatoriske sekvenser av interesse oppstrøms for TetActivator kassett i vektor # 1247 ved bruk av standard teknikker. Alternativt kan bruke rekombinasjonsteknikker for å generere en BAC, hvor TetActivator kassetten (vektor # 1180) settes inn i det første exon av målgenet, og hvor Tol2 inverterte gjentagelser føres inn i BAC ryggraden (for en detaljert recombineering protokollen ser 7,8).
- Forbered giftfrie plasmid DNA eller BAC DNA-preparater ved bruk av kommersielle kits.
- Generering av transgen TetActivator fiskelinjer
- Utføre mikroinjeksjon av TetActivator konstruksjon ifølge standardprosedyrer 9.
- Injiser 25-50 pg av plasmid-DNA eller opp til 250 pg BAC-DNA inn i en celle-trinns embryoer sammen med avkortet sense RNA som koder for tol2 transposase for transposon-mediert transgenesis, eller med I-SCEI protein for I-SCEI-mediert transgenesis.
MERK: Betraktninger om valget av den transgenesis metoden kan bli funnet i diskusjonen delen.
MERK: Sprøyt helst inn i cytoplasma, ikke eggeplomme, siden effektiviteten av transgenesis kan redusere når DNA ikke er levert inn i cytoplasma.
- Injiser 25-50 pg av plasmid-DNA eller opp til 250 pg BAC-DNA inn i en celle-trinns embryoer sammen med avkortet sense RNA som koder for tol2 transposase for transposon-mediert transgenesis, eller med I-SCEI protein for I-SCEI-mediert transgenesis.
- Hev injisert G0 embryoer til voksen. Eventuelt skjermen G0 embryoer for AmCyan fluorescens og fortrinnsvis vokse embryoer som viser ønsket uttrykk mønster. Dette kan øke frekvensen av bakterie-linje overføring, spesielt for Tol2-mediert transgenesis.
- Vurdere vellykket bakterie-linje integrasjon ved kryssings individ G0 fisk til vill-type fisk og utseende av AmCyan fluorescens i det forventede uttrykksmønster i F1 embryoer eller larver ved anvendelse av en fluorescerende stereomikroskop (eksempel er vist i figur 1D).
- Hev fluorescens-positiveF1 embryoer til voksen alder og mate dem med vill-type fisk for å oppnå stabil F2 transgene fisken.
- Hev og karakter minst 3 forskjellige underlinjer som stammer fra ulike G0 grunnleggeren fisk, siden enkelte linjer kan variere i uttrykk nivåer, uttrykk mønster, evne til å indusere TetResponder linjer, leakiness, og deres mottakelighet for lyddemping.
MERK: Mange transgener som er robust uttrykt i embryoer er enten delvis eller helt stille på tribunen i sent stadium larver eller voksen fisk. Dermed, hvis linjer er ment å bli brukt i voksen fisk, karakter flere uavhengige linjer for deres TetActivator ekspresjon og funksjon i løpet av voksenlivet.
MERK: Vi har generert et panel av TetActivator linjer for vevsspesifikt uttrykk for TetActivator både embryoer og voksen fisk, som er oppført i tabell 1 Disse linjene er tilgjengelig fra Weidinger lab på forespørsel..
- Utføre mikroinjeksjon av TetActivator konstruksjon ifølge standardprosedyrer 9.
2. Generering av Transgenic TetResponder Fisk Lines
MERK: Vi har generert en TetResponder konstruksjon som åpner for I-SCEI eller Tol2-mediert generasjon av stabile TetResponder linjer, som er tilgjengelig fra Weidinger lab ved forespørsel (Weidinger lab plasmid database no 1444, figur 1E.). Denne konstruksjon inneholder et Tetracycline operator, etterfulgt av en polylinker region å lette innsetting av kodende sekvenser (CDS) av et gen av interesse og YFP-derivatet YPet kodende sekvens. Dermed er konstruksjonen utformet for teta-mediert ekspresjon av en C-terminal fusjon av proteinet av interesse med YPet. Dersom uttrykk for en merket fusjonsprotein har unngås, kan en P2A eller T2A peptid bli introdusert med genet av rente CDS, som muliggjør samtidig uttrykk av proteinet av interesse og YPet som separate polypeptider 6,10.
- Generering av TetResponder konstruere
- Klone CDS av genet av interesse 3 'av Tetracycline operatørenog 5 'av YPet CDS i henhold til standardprosedyrer. Sørg for at stoppkodonet har blitt fjernet fra det aktuelle genet CDS.
- Forbered giftfrie plasmid DNA forberedelsene bruker kommersielt tilgjengelige kits.
- Generering av transgen TetResponder fiskelinjer
- Utføre mikroinjeksjon av TetResponder konstruere henhold til standardprosedyrer 9.
- Injisere 25-50 pg av plasmid DNA inn i cytoplasma av én celle-trinns embryoer sammen med avkortet forstand RNA som koder for tol2 transposase for transposon-mediert transgenesis eller med I-SCEI enzym for meganuclease assistert transgenesis.
MERK: Betraktninger om valget av den transgenesis metoden kan bli funnet i diskusjonen delen.
MERK: Sprøyt helst inn i cytoplasma, ikke eggeplomme, siden effektiviteten av transgenesis kan redusere når DNA ikke er levert inn i cytoplasma.
- Injisere 25-50 pg av plasmid DNA inn i cytoplasma av én celle-trinns embryoer sammen med avkortet forstand RNA som koder for tol2 transposase for transposon-mediert transgenesis eller med I-SCEI enzym for meganuclease assistert transgenesis.
- Hev injisert G0 embryo til endulthood.
- Vurdere vellykket bakterie-linje integrering og induserbarhet av transgenet ved å parre enkelte G0 fisk med en tidligere etablert TetActivator linje etterfulgt av Doxycycline behandling av F1 embryoer eller F1 larver.
MERK: Vanligvis bruker vi en ubiquitin promoter-drevet TetActivator linje (ubiquitin: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2, kort ubiquitin: Teta AmCyan 3) for å screene for funksjonelle TetResponder bærere, som denne linjen kjører ganske utbredt uttrykk i embryoer og voksen fisk og dermed er godt egnet til å vurdere TetResponder induserbarhet i alle vev av interesse. Denne linjen er tilgjengelig fra Weidinger lab på forespørsel. - Samle embryoer fra hver clutch i en egen 10 cm petriskål inneholder E3 embryo medium (se Materialer tabell) og inkuberes retter på 28,5 ° C.
- Sted G0 fisk som ga embryoer til individuelle nummererte tanker (avl bokser, se Materials tabell) inntil embryoer har vært skjermened. Dette gjør det mulig for gjenvinning av G0 fisk som viser bakterie linje overføring av transgenet.
- Dersom man forventer bare halvparten av embryoene å bære TetActivator transgenet (i tilfelle en heterozygot TetActivator føreren ble krysset til en TetResponder grunnleggeren fisk), velg for embryoer som inneholder TetActivator transgen av utseendet AmCyan fluorescens på riktig utviklingsstadiet.
- Indusere TetActivator transkripsjonen aktivitet ved å behandle embryoer med Doxycycline (DOX) som beskrevet i kapittel 2.3.
- Screen F1 embryoer for fremveksten av YPet fluorescens. Foretrekker linjer (G0 fisk) som produserer homogene YPet uttrykk, som er embryoer i clutchen bør vise litt mosaicism innenfor det forventede uttrykk domene og liten variasjon mellom individuelle embryoer. Se pilspisser i figur 1F og Figur 1G for representative eksempler.
- Mate G0 fisk overføre en induserbar TetResponder transgen identifisert itrinn 2.2.8 med vill-type fisk og heve alle F1 embryoer til voksen.
- Identifisere voksen F1 transgen fisk enten ved PCR-basert genotyping (se avsnitt eller ved å krysse enkelte F1 fisk til en TetActivator linje etterfulgt av DOX behandling av F2 embryoer og fremveksten av YPet fluorescens (se avsnitt 2.5).
- Etablere og karakter minst tre forskjellige TetResponder underlinjer som stammer fra ulike G0 grunnleggeren fisk, siden induserbarhet kan variere i enkelte linjer. Spesielt oppnåe uttrykk nivåer og om responder kan aktiveres i alle celletyper kan variere. I tillegg vil mottakelighet for lyddemping variere mellom linjene. Til slutt, i noen tilfeller kan det være foretrukket å velge linjer som medierer kun moderate ekspresjonsnivåer av proteinet av interesse, spesielt dersom lekk ekspresjon produsert i kombinasjon med et TetActivator linje i fravær av doxycycline forventes å forårsake utviklingsdefekter eller toksisitet.
MERK: TetResponder linjer som er robust induserbar i embryoer kan være enten delvis eller fullstendig taushet i sent stadium larver eller voksen fisk. Dermed, hvis linjer er ment å bli brukt i voksen fisk, flere uavhengige linjer skal preges for induserbarhet i voksne. Hvis induksjon av det aktuelle genet er kompatibel med videre utvikling, har det vist seg nyttig å lage doble transgene embryoer (TetActivator x TetResponder), for å indusere GOI uttrykk i embryoer og for å velge og heve bare enkeltpersoner som viser den mest robuste og minst mosaikk induksjon. - For å opprettholde og spre etablerte TetResponder linjer, genotype voksen fisk som beskrevet i kapittel 2.5).
- Utføre mikroinjeksjon av TetResponder konstruere henhold til standardprosedyrer 9.
- Doksycyklin behandling av embryoer
- Forbered 2,000x Doxycycline (DOX) aksjer. Løs DOX i 50% EtOH for å oppnå en konsentrasjon på 50 mg / ml (97 mM). Oppbevar DOX aksjer beskyttet mot lys ved -20 ° C.
- Dekanter fleste E3 medium fra embryoer og erstatte det medE3 embryo medium inneholdende DOX ved en sluttkonsentrasjon på 25 ug / ml DOX (2,5 mL av 2,000x DOX lager per 50 ml E3). Dechorionation er ikke nødvendig.
- Returner embryoer til 28,5 ° C i minst 6 timer før måling ekspresjon av det kodede genet av interesse ved opptreden av YPet fluorescens.
- Vurdere leakiness av TetActivator / TetResponder kombinasjon av behandling embryoer med EtOH løsemiddel.
MERK: In situ hybridisering (ISH) eller RT-PCR for å påvise TetResponder mRNA kan brukes som mer sensitive mål på leakiness enn fluorescens av den merkede genet av interesse. Omfanget av lekkasjen vil avhenge av den spesielle TetActivator / TetResponder linje kombinasjonen, og det vil også kunne variere mellom vev og utviklingsstadier.
- Anestesi av voksen sebrafisk
- Forbered 10 cm diameter petriskål eller lite begerglass fylt med fisk system vann inneholdende 1 mg / ml Tricaine (etyl 3-aminobenzoat methanesulfonate, MS-222).
- Overføre fisk til container inneholder bedøvelse og vente til den når nivå 4 av anestesi som indikert av fullstendig tap av likevekt (fisk ligger på siden), ingen bevegelser og ingen svar på berøre 11.
- Overføre nøye fisk ved hjelp av pinsett eller en skje på en glassplate, lokket av en plast petriskål, eller agarose-belagt petriskål og utføre fin amputasjon eller imaging (se punkt 3.2).
- Returner fisk til en beholder inneholdende et stort volum av fersk fisk system vann og overvåke den. Hvis gill bevegelser ikke fortsette innen 3 min, bistå ved å blåse vann over gjellene ved hjelp av en plast transfer pipette.
- PCR-basert genotyping av TetResponder fisk
- Utfør delvis amputasjon av halefinnen 12. Plassere fisk i individuelle, nummererte beholdere (avl bokser, se Materials tabell). Dette gjør det mulig for utvinning av transgene fisken etter vellykket genotyping.
- Transfer finn vev til individuelle brønner i en 96-brønners PCR-plate forhåndsfylt med 20 ul DNase-fritt vann for isolering av genomisk DNA 13.
- Legg 120 pl 1 M NaOH til hver brønn og inkuber prøvene i 20 minutter ved 95 ° C ved hjelp av et termo.
- Chill prøvene til 4 ° C, tilsett 14 pl av 1 M Tris-HCl (pH 8,0) til hver brønn, og kort vortex prøver. Sentrifuger prøver for 5 min på 16 000 xg til pellet celleavfall. Oppbevar genomisk DNA ved 4 ° C inntil behov.
- Design primere for å spesifikt amplifisere et fragment av TetResponder transgenet. Bruk 2 mL av isolerte DNA i en standard PCR-reaksjon og analysere PCR-produkt på en agarosegel.
3. Tissue-spesifikke Induksjon av transgene uttrykk i Adult Regenerating Sebrafisk Tail Fin
- Etablering av TetActivator; TetResponder dobbel transgen fisk
- Mate TetActivator bærere med TetResponder Carriers.
- Velg embryoer bærer TetActivator transgenet på et utviklingsstadium når de regulatoriske elementer som driver TetActivator kassetten er aktive. Transgene embryoer kan lett identifiseres ved utseendet AmCyan fluorescens bruker et stereo fluorescerende mikroskop.
MERK: TetActivator transgene-positiv fisk kan alternativt bli identifisert i voksen alder ved avbildning av bedøvet fisk, f.eks. etter amputasjon av halefinnen og fremveksten av AmCyan fluorescens i regenerere. - Hev utvalgte embryoer til voksen.
- Identifiser dobbelt transgen voksen fisk (fisk som bærer TetResponder i tillegg til TetActivator) ved PCR-basert genotyping eller (fortrinnsvis) ved deres evne til å indusere ekspresjon av TetResponder i vevet av interesse. En protokoll for TetResponder induksjon og deteksjon i regenererende halefinnen er beskrevet i kapittel 2.3 og § 4.
MERK: Hvis transient TetResponder uttrykk er kompatibelmed ytterligere embryonale eller larveutvikling, er det nyttig å identifisere doble transgene embryoer bærer TetActivator og TetResponder transgener følgende DOX behandling under embryonal utvikling som beskrevet ovenfor (pkt 2.3, Figur 1 H). Doble positive embryoer vil vise AmCyan og YPet fluorescens. Hev positive embryoer til voksen.
- Amputasjon av sebrafisk halefinnene og induksjon av transgene uttrykk i regenererende finnen
- Utfør delvis amputasjon av halefinnen på bedøvet fisk (se avsnitt 2.4) 12. Behandle fisk enten umiddelbart med DOX eller returnere dem til fisken bolig system.
- Forbered avl (Figur 2A, se tabell Materials) som er fylt med 1 liter av fisk system vann inneholdende 25 ug / ml DOX (tilsett 500 ul av 2,000x 50 mg / ml lager i en L av fisk system vann).
MERK: Induksjon av transgene uttrykk umiddelbart etter amputasjon tillater somvurderingen av effekter på tidlige hendelser under regenerering, mens induksjon på tre dager etter amputasjon (3 DPA) bør brukes til å vurdere transgene uttrykk eller funksjon under regenerativ vekst. - Overføre opptil 10 tidligere amputert, dobbel transgen fisk til avl boksen og tett boks med lokk, slik at fisken ikke kan unnslippe (Figur 2A).
- Plasser avl bokser i mørket for å redusere stress. Vi pleier å plassere boksene i en 28,5 ° C luftinkubator for å sikre konstant mørke og temperatur.
- Behandle negativ kontroll dobbelt transgen fisk med EtOH bare (250 ul pr 1L fisk system vann).
MERK: En transgen eller vill-type fisk behandlet med DOX kan brukes som ekstra negativ kontroll, selv om vi ikke har observert ugunstige virkninger av DOX doser brukt her på finnen regenerering. - Bedøve fisk som beskrevet i kapittel 2.4 og overføre fisk ved hjelp av pinsett eller en skje på en fuktet agarose-belagt petri parabolen. Spre halefinnen forsiktig med pinsett.
- Screen fisk for utseendet YPet innenfor regenerere bruker en fluorescerende stereo-mikroskop (figur 2B).
MERK: Vanligvis kan TetResponder drevet fluorescens være robust observert etter 6 timer av DOX behandling. Vi anbefaler imidlertid å karakterisere dynamikken i TetResponder uttrykk for hver linje generert. - Tilbake fisk til fisk bolig system for å avslutte TetResponder transgen induksjon eller fortsette behandlinger.
MERK: For behandlinger> 24 timer (langsiktige behandlinger) er det viktig å bytte vann og rengjør grundig avl bokser daglig. - Under langsiktige behandlinger, fôr fisk hver 2-3 dager ved å overføre fisk i en ren beholder med fersk fisk system vann før retur dem til avl bokser etter fôring.
4. Karakterisering av TetResponder Expression i Finn Regenerer
t ">. MERK: Vi kontrollerer vanligvis vevsspesifikt genuttrykk i regenererende halefinnen ved hjelp av fluorescerende avbildning av frysesnitt på tre dpa På dette tidspunktet de ulike vev avdelinger av en regenerere har dannet og klart kan identifiseres på vev-seksjoner, og cryosectioning er enklere enn ved senere stadier av regenerering. Figur 2C viser vevet domener som kan skilles i regenerere og viser noen molekylære markører for disse domenene. Følgende protokoll beskriver fremstillingen av langsgående eller tversgående frysesnitt for direkte avbildning eller farging .- Cryosectioning av voksne halefinnene
- Behandle fisken med halen finnene ble amputert fra to dpa inntil tre dpa med DOX som beskrevet i kapittel 3.2
- Bedøve fisk som beskrevet i kapittel 2.4
- Bruk en skje eller pinsett for å forsiktig overføre fisk på et lokk av en plast petriskål.
- Re-amputere fin regenerere på ca 4-5 benete segments proksimalt for den første amputasjon planet ved hjelp av en skalpell og returnere til fisken fersk fisk system vann.
- Nøye overføring regenererer til en liten petriskål (for eksempel 35 mm) inneholdende 4% (w / v) paraformaldehyd (PFA) i 1 x fosfatbufret saltvann (PBS, se Materialer tabell) ved hjelp av fin pinsett. Ikke berør regenerere men bare stubben del av vevet.
- Plasser vev flate på petriskålen bunnen og feste O / N ved 4 ° C.
- Vask regenererer to ganger i 1 x PBS inneholdende 0,1% Tween (PBT) for å fjerne PFA og inkuber regenererer o / n ved 4 ° C i 0,5 M EDTA-PBS (pH 7,5) For å fjerne bein matrise.
- Inkuber regenererer ved RT i 10% sukrose-PBS, 20% sukrose-PBS, 30% sukrose-PBS og 30% sukrose-PBS: vev frysemedium ved et 1: 1-forhold (TFM, se Materialer tabell) i 30 minutter hver. Deretter inkuberes finnene ved 4 ° C i> 2 timer på vev frysemedium.
- Plasser cryomolds på et objektglass og fyllm med vev frysing medium. Unngå å innføre luftbobler.
- Transfer regenererer inn cryomolds og orient vev hensiktsmessig å skaffe langsgående eller tverrgående delene av finne regenererer (figur 2D). Sørg for at regenerere er rett, noe som letter seksjonering.
- Overføring cryomolds sammen med objektglass på en metallstativ plassert på en seng av tørris for å starte fryseprosessen (figur 2D).
- Når vevet frysemedium er blitt fast, plasserer cryomold på benk og la sitte ved romtemperatur i noen få minutter, slik at vevet frysemedium tiner ved plast-medium grensesnitt.
- Bruk en penn eller lignende for å presse den frosne blokken ut av cryomold. Oppbevar cryoblocks i en boks ved -80 ° C inntil vev seksjonering.
- Forbered 10-14 mikrometer tykke frysesnitt bruker en Cryo-mikrotom og samle deler på vedheft objektglass (se Materialer tabell). Oppbevar lysbilder ved -20 ° C inntil neerD cEDED.
- Karakterisering av TetResponder uttrykk på finne seksjoner basert på YPet fluorescens
- Behandle finn seksjoner i 30 min med 100% MeOH avkjølt til -20 ° C for å forbedre overholdelse av objektglass, etterfulgt av to vaskinger ved RT i PBT og en vask i PBS, 5 minutter hver.
- Visual kjerner ved å inkubere seksjoner i 10 minutter i 4 ', 6-diamidino-2-phenylinodole (Dapi) i PBS (1: 5000), etterfulgt av to vaskinger 10 min hver i PBS.
- Mount seksjoner i 75% glyserol-PBS eller kommersielt tilgjengelige antifade mounts, og dekk til med et dekke lysbilde.
- Bilde YPet og AmCyan fluorescens under en confocal eller bred-feltet fluorescerende mikroskop (figur 1E).
NB: For å lette entydig identifisering av celletyper som uttrykker YPet, immunofluorescens eller immunhistokjemi med antistoffer mot celletypespesifikke antigenene sammen med anti-GFP antistoff (som reagerer med YPet, men ikke AmCyan) kan bli utført. Alternativt, for å forenkle oppdagelse av svak YPet uttrykk, kan RNA in situ hybridisering mot YPet RNA utføres enten på hel-mount finner eller parafinsnitt av finnene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å etablere et funksjonelt Teton system for vevsspesifikt induserbar genuttrykk, transgen TetActivator og TetResponder linjer må genereres (figur 1A). Dette oppnås ved microinjecting TetActivator (figur 1 B - C) eller TetResponder (figur 1E) konstruerer i tidlige embryoer sebrafisk og påfølgende bakterie-line integrasjon. Funksjonelle TetActivator konstruksjoner kan enten frembringes ved kloning av korte regulatoriske sekvenser (enhancerelementer) oppstrøms for TetActivator kassetten (figur 1 B), eller ved å rekombinere TetActivator kassetten inn i en BAC som inneholder regulatoriske elementer av genet av interesse (figur 1C). Kimlinje integrering av TetActivator konstruksjonen kan vurderes ved kryssings individuell injisert G0 fisk og utseende av AmCyan fluorescens i F1 embryoer i den forventede uttrykksmønster (figur 1D). Kimlinje integrasjon og funksjonaliteten til TetResponder transgenet kan vurderes ved å krysse individuell G0 injisert fisk til etablerte TetActivator fisk (her ubiquitin: TETA AmCyan), etterfulgt av behandling med DOX og utseende av YFP / YPet fluorescens (figur 1F). Fisk som viser sterk og homogen YFP / YPet uttrykk bør foretrekkes for å etablere en stabil TetResponder linje (figur 1G). Å ha etablert stabil TetActivator og TetResponder fiskelinjer, bestemte TetActivator / TetResponder kombinasjoner kan genereres ved å krysse. Bærere av TetActiator og TetResponder transgener kan bli identifisert i løpet embryogenese følgende DOX behandling slutten veksten av YFP / Ypet på utviklingsstadiet den TetActivator er aktiv (figur 1 H). Alternativt kan identifiseres doble transgene fisken følgende DOX behandling og TetResponder transgen induksjon i regenererende halefinnen (Figur 2A - B).
< p class = "jove_content"> Vi bruker rutinemessig dette systemet for å oppnå induserbar, vev-spesifikk genekspresjon i regenererende sebrafisk halefinnen. Vi kontrollerer vevsspesifikt TetResponder transgene uttrykk ved fluorescens avbildning av frysesnitt av 3 DPA finne regenererer, siden de forskjellige vev avdelinger av en regenerere klart kan identifiseres på vev-seksjoner på denne tiden-punktet (figur 2C). Langsgående eller tverrgående finne regenerere seksjoner oppnås ved cryosectioning etter kryobeskyttende vev og innebygging fin regenerere riktig (figur 2D). Etter seksjonering kan TetResponder transgene uttrykk (Ypet / YFP fluorescens) avbildes med fluorescens eller konfokalmikroskopi (figur 2E). Merk at her4.3 promoter-drevet TetActivator induserer TetResponder uttrykk i proksimale medial blastema, mens distal blastema (pilspiss) og epidermis (pil) er blottet for uttrykk. ove_content ">
Figur 1: Generering av transgene TetActivator og TetResponder linjer. (A) Cartoon viser strategi for vevsspesifikt induserbar genuttrykk bruker Teton system. (B) Transgenic TetActivator konstruere (Weidinger lab plasmid database no. 1247). En polylinker 5 'av TetActivator irtTAM2 (3F) letter cLöning av regulatoriske sekvenser av interesse. Den AmCyan kodende sekvensen er adskilt fra TetActivator via en P2A "selv-spaltende 'peptid. Kassetten inneholder også en SV40 polyadenyleringssignal, er flankert av Tol2 transposon invertert gjentar og inneholder en enkelt I-SCEI meganuclease anerkjennelse nettstedet. (C) TetActivator kassett for BAC recombineering (Weidinger lab plasmid database no. 1180). Kassetten inneholder kanamycingenet for seleksjon, som drives av en Gb3 prokaryot promoter. FRT områder flankerer kanamycinresistensgenet tillate dens Flp-rekombinase mediert fjerning etter vellykket integrering i BAC. (D) Identifikasjon av G0 grunnleggeren fisk overføre her4.3: Teta AmCyan konstruere gjennom sin bakterie-linje. Carriers er identifisert via veksten av AmCyan fluorescens i noen F1 embryoer (pilspisser). (E) Transgenic TetResponder konstruere (Weidinger lab plasmid database no. 1444).Dette konstruerer består av en polylinker og YPet CDS under kontroll av optimaliserte Tet responselementer (Tetre tett, Clontech) og terminert av SV40 polyadenyleringssignal. Det er flankert av Tol2 transposon invertert gjentar og inneholder en enkelt I-SCEI meganuclease anerkjennelse nettstedet. (F) Identifisering av G0 grunnleggeren fisk sender et funksjonelt TetResponder Tetre: Axin1-YFP konstruere gjennom deres kimlinje. Carriers er identifisert ved krysset med en etablert TetActivator linje (her ubiquitin: Teta AmCyan) og induksjon av YFP fluorescens følgende DOX behandling i 6 timer (pilspisser). (G) lukke opp ofembryos vist i (F) Etter totalt 12 timers behandling av DOX. Merk ganske utbredte induksjon av YFP fluorescens. (H) Identifisering av doble transgene embryoer bærer TetActivator (her4.3: Teta AmCyan) og TetResponder (Tetre: Axin1-YFP) transgener (pilspisser). Embryoer vire behandlet med DOX etter 6 timer. (A - H) Scale bar: 500 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Bruk av Teton system for vevsspesifikt genuttrykk i regenererende sebrafisk halefinnen. (A) Avl boksene brukes for DOX behandling av voksne sebrafisk. (B) Induksjon av Tetre: Axin1-YFP TetResponder transgen av her4.3: Teta AmCyan TetActivatori den regenererende halefinnen etter 12 timers behandling av DOX. Legg merke til fraværet av YFP fluorescens i EtOH-behandlede kontrollfisk. (C) tegneserie som viser noen av de vevsområder innenfor et finne regenerere 3 DPA i et lengdesnitt. (D) for prøveopparbeidelse for cryosectioning. Fin regenererer er plassert i vev-frysing medium (TFM) -filled cryomolds, orientert hensiktsmessig å få enten langsgående eller tverrgående deler av regenerere, og overført til en metallstativ sitter på toppen av tørris til TFM har stivnet. Seksjonering flyet er angitt i rødt. Forkortelser: dist .: distal, prox .: proksimale, vent .: ventral, Dors .: rygg. (E) Confocal bilde av YFP fluorescens i et lengdesnitt av en fin stråle regenerere avledet fra finnene er vist i (b). Merk at her4.3: Teta AmCyan TetActivator linje driver YFP induksjon spesielt i proksimale-medial blastema. YFPfluorescens blir ikke påvist i en rekke kamre, inkludert såret epidermis (pil) og den mest distale domene av mesenchyme (pilspiss) (BC) Skala: 500 mikrometer; (E) Skala:. 100 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| TetActivator linje | Referanse | Regulatoriske elementer brukes | Primært uttrykt i |
| 7xTCF-Xla.Siam: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan | Wehner & Weidinger, upublisert | 7xTCF-Xla.Siam Wnt reporter 1 | Wnt-responsive vev |
| myl7: irtTAM2 (3F) -p2a-mCherry | Haase & Weidinger, upublisert | myl7 (cmlc2) 2 | modne cardiomyocytes |
| her4.3: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm6 | 3 | her4.3 4 | sentralnervesystemet |
| keratin4: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm5 | 3 | keratin4 5 | epidermis, i den voksne finnen unntatt basallaget |
| keratin18: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm4 | 3 | keratin18 6 | epidermis, i den voksne finnen utelukkende i basallaget |
| sp7: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm3 | 3 | sp7 / osx 7 | (Engasjerte) osteoblasts |
| ubiquitin: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2 | 3 | ubiquitin 8 | (Ganske) allestedsnærværende |
Tabell 1:. Ledige transgene TetActivator linjer Denne tabellen viser transgen TetActivator linjer for vev-spesifikk ekspresjon av TetActivator i både embryonisk og voksen fisk, som er tilgjengelig fra Weidinger laboratoriet på forespørsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den voksne sebrafisk har en utrolig evne til å lykkes regenerere mange indre organer og lemmer. En grundig forståelse av molekylære og cellulære mekanismene som er involvert krever vevsspesifikt analyse av genfunksjoner og signalveier. Mot dette, gir Teton systemet et effektivt verktøy for spatiotemporally kontrollert genuttrykk i embryonale og voksen sebrafisk. Teton system konstruerer og metodikk som er beskrevet i dette manuskriptet har blitt brukt i en fersk studie av vårt laboratorium tre. Følgende tilleggsproblemer bør vurderes ved etablering av Teton system:
TetActivator transgen design hensyn
Vi har tidligere vist at et enkelt-induserbar TetActivator bestående av M2 muterte variant av den reverserte Tet repressor domene fusert med Herpes simplex virus VP16 trans domene-derivatet 3F [irtTAM2 (3F), iN kort TETA-M2] confers effektiv induksjon, men kan vise lav, om enn målbar leakiness, som er bakgrunn induserende aktivitet i fravær av doxycycline (DOX) 5. Derfor har vi beskrevet dually induserbare systemer ved hjelp av fusjoner med et glukokortikoid reseptor (Teta-GBD) eller et domene av Ekdyson reseptor (Teta-ECR), som eliminerer leakiness 5. Således, dersom systemet skal brukes til å uttrykke giftige eller meget potente proteiner (for eksempel onkogener) bruk av et dobbeltkrum induserbar variant bør vurderes. Alternativt under etablering av TetActivator og TetResponder linjer en rekke linjer som produserer ulike uttrykk nivåer kan velges og svakere indusere valgt i tilfelle leakiness er et problem med sterkt induserer linjer. TetActivator konstruksjoner som inneholder Teta-GBD eller Teta-ECR variant er tilgjengelige fra Weidinger lab på forespørsel.
Transgenesis metoder for generering av transgene sebrafisk linjer
TetResponder transgene uttrykk analyse
For å oppdage vevsspesifikt TetResponder transgene uttrykk hos voksne finner vi vanligvis bruker fluorescerende avbildning av frysesnitt. Vår erfaring er fluorescens av fluorescerende proteiner uttrykt av transgenet bevart gjennom fixation og cryosectioning prosedyre, og kan således direkte avbildes. Ytterligere metoder for påvisning av TetResponder uttrykk, som er blitt beskrevet andre steder, er: i) farging på seksjonene, fortrinnsvis mot det fluorescerende protein tag, her YPet, ved hjelp av et anti-GFP-antistoff, ii) fluoriserende eller kromogen ISH på seksjonene, eller iii ) hel-mount ISH fulgt av seksjonering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker Christa Haase, Doris Weber og Brigitte Korte for teknisk assistanse. Arbeid i Weidinger lab er støttet med tilskudd av Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, VI 4223 / 4-1 og ved Deutsche Gesellschaft für Kardiologie via en Oskar-Lapp-Stipendium og Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g., Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5,000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g., Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317 (2014).
- Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
- Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610 (2007).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
- Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).
