Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

الإصابات الجراحية للماوس البنكرياس من خلال من ربط والبنكرياس القناة نموذجا للالغدد الصماء وخارجية الإفراز إعادة برمجة وانتشار

doi: 10.3791/52765 Published: August 7, 2015

Abstract

توسيع خلايا بيتا في البنكرياس في الجسم الحي أو خارج الجسم، أو توليد خلايا بيتا التي كتبها التمايز من الخلايا الجذعية الجنينية أو الكبار، يمكن أن توفر مصادر للتوسيع جديدة من خلايا بيتا للتخفيف من ندرة المانحة في زرع جزيرة البشري كعلاج لمرض السكري. وعلى الرغم من إحراز تقدم في الآونة الأخيرة نحو هذا الهدف، الآليات التي تنظم بيتا توسيع الخلايا والتمايز من الخلايا الجذعية / السلف لا تزال تتسم. هنا، نحن تصف بروتوكول للنموذج إصابة في الماوس البنكرياس الكبار التي يمكن أن تعمل كأداة لدراسة آليات إعادة تشكيل الأنسجة وتكاثر الخلايا بيتا والتمايز. الجزئي لاصق ربط (PDL) هو ضرر الناجم تجريبيا البنكرياس القوارض التي تنطوي على الربط الجراحي للقناة البنكرياس الرئيسية مما أدى إلى إعاقة تصريف المنتجات الإفرازية للخروج من منطقة الذيل من البنكرياس. الأضرار التي لحقت يدفع ضمور عنيبية، infilt الخلايا المناعيةالتموينية وإعادة تشكيل الأنسجة شديدة. لقد ذكرت سابقا تفعيل Neurogenin (NGN) 3 معربا عن الخلايا الشبيهة السلف الذاتية وزيادة في تكاثر الخلايا بيتا بعد PDL. ولذلك، يوفر PDL أساس لدراسة الإشارات تشارك في ديناميات خلايا بيتا وخصائص من السلف الغدد الصماء في البنكرياس الكبار. منذ ذلك الحين، فإنه لا يزال من غير الواضح إلى حد كبير، مما العوامل ومسارات تسهم في neogenesis خلايا بيتا والانتشار في PDL، فإن بروتوكول موحد لPDL تسمح للمقارنة عبر المختبرات.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تزايد انتشار مرض السكري، والتي تؤثر على أكثر من 300 مليون شخص على مستوى العالم 1،2 عزز البحث عن مصادر جديدة للخلايا بيتا المنتجة للأنسولين، على حد سواء في المختبر وفي الجسم الحي، لتجديد نقص كتلة خلايا بيتا. 3 تحديد الرئيسي يمكن لآليات والعوامل التي تنظم تكاثر الخلايا بيتا وبيتا خلية neogenesis، أي تمايز الخلايا بيتا من خلية خلية أو السلف غير بيتا، وتوفير أهداف جديدة لتطوير علاجات التجدد في مرض السكري.

في البنكرياس القوارض النامية، جميع أنواع الخلايا والغدد الصماء التفريق من السكان الرحل من خلايا الغدد الصماء السلف، معربا عن عامل النسخ Neurogenin3 (Ngn3). 4،5 في البنكرياس القوارض الكبار، في ظل ظروف فسيولوجية طبيعية، كتلة خلايا بيتا هي الحفاظ على العدد الأمثل لتلبية مطالب الأيضية. التغييرات في بيتا حجم الخلية،موت الخلايا المبرمج والتكرار تشكل آليات رئيسية لبيتا توسيع الخلايا وتتحول إلى أكثر من 6-8 الرغم من أن إمكانيات خلايا بيتا لتتكاثر في ظل ظروف طبيعية فسيولوجية غير متجانسة بين جميع السكان من 9 معدل انتشارها منخفضة ويقتصر إعادة تكرارها من قبل فترة دينامية السكون أو فترة صهر 6،7، وتتأثر العمر وايض الجلوكوز. 10 منذ حتى الآن لم يتم تحديد خلايا الغدد الصماء في البنكرياس السلف الكبار العادي، ويعتقد neogenesis لعدم المساهمة في نمو الخلايا بيتا الكبار العادي. 8

وبالتالي، فإن تحديد خلية الغدد الصماء السلف الاختيارية في البنكرياس الكبار التي يمكن توسيعها وقادرة على إنتاج خلايا بيتا الجديدة ستوفر رواية، وربما مصدر غير محدود من خلايا بيتا.

الجزئي لاصق ربط (PDL) هو نموذج إصابة الحيوان الذي تم وصفه للحث على neogenesi خلايا بيتاالصورة في البنكرياس الكبار. 11،12 في هذا النموذج، والقناة البنكرياسية الرئيسي تجفيف ذيل البنكرياس هو ligated جراحيا. العرقلة الناتجة من الصرف خارجية الإفراز يستحث إعادة تشكيل الأنسجة كبير، يرافقه التهاب وضمور عنيبية البعيدة إلى ربط 12-14 ضمن هذه البيئة التهابات، وإعادة التعبير للعلامة الغدد الصماء السلف هو فعل Ngn3 وحجم خلايا بيتا يزيد شقين . هذا الضعف في بيتا النتائج حجم الخلية من توليد خلايا بيتا جديدة من Ngn3 التعبير عن نوع الجنين خلية الغدد الصماء والسلف من انتشار الخلايا الموجودة مسبقا والتي شكلت حديثا بيتا التي تكون عرضة لإعادة ازدواجية دون "فترة هدوء". 11،15

neogenesis خلايا بيتا وتكرارها في النماذج الإصابة، مثل استئصال البنكرياس 6،7،16-19 والاجتثاث الانتقائي للخلايا بيتا 20 وقد وصفت على نطاق واسع. ومع ذلك، فإن النتيجة التجدد في تسايتأثر النماذج الإلكترونية وفقا لمدى الأضرار التي لحقت ويرتبط مع بيتا كتلة الخلايا الأولية انخفضت 21. PDL هو نموذج العمليات الجراحية التي لا يتأثر كتلة خلايا بيتا الأولية ويتم تنشيط neogenesis خلايا بيتا والانتشار بقوة. في الواقع، في بنكرياس الفئران التي خضعت PDL، ويتم تحديد الخلايا معربا عن Ngn3 بالقرب من البطانة الطلائية للقناة. هذه الخلايا يمكن عزل من البنكرياس ligated من Ngn3-GFP الفئران المعدلة وراثيا باستخدام مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) وقادرون على تمييز تجاه خلايا بيتا الوظيفية التالية engraftment في الجسم الحي وخارج ثقافة البنكرياس من E12.5 Ngn3 - / - . الفئران 11 وبالمثل، في Ngn3 CreERT؛ 15 الفئران R26 YFP فيها الخلايا التي تنشط الجين Ngn3 وصفت بشكل دائم بعد الحقن تاموكسيفين، تم الكشف عن Ngn3 خلايا بيتا المشتقة من خلية التسمية إيجابية بعد PDL وعلاوة على ذلك، وخلايا بيتا التي شكلت حديثا تمييع قبل -موجودةجي خلايا بيتا وتحديد موقع تفضيلي في الجزر الصغيرة من خلاله تظهر خلايا بيتا قدرة عالية الانتشار. 15 Ngn3 مهمة لتوسيع خلايا بيتا بعد PDL منذ انخفض Ngn3 التعبير عن الرأي محددة الهدف RNA قصيرة دبوس انخفاضات كبيرة في كتلة خلايا بيتا وتكاثر الخلايا بيتا بعد PDL. 11 والجدير بالذكر أن جزء من Ngn3 خلايا بيتا المشتقة من خلية وكتلة خلايا بيتا بعد PDL يعتمد بشكل كبير على مستوى Ngn3 تحريض 15. هذا هو وفقا لملاحظة أن مستوى عال من Ngn3 التعبير هو خطوة حاسمة لالتزام الغدد الصماء من الأسلاف البنكرياس متعددة القدرات خلال تطوير البنكرياس 22 بالإضافة إلى ذلك، الاجتثاث الانتقائي للNgn3 معربا عن الخلايا عن طريق إدارة الخناق والسم لNgn3 CreERT؛ الفئران R26 iDTR 15 نتائج في المحتوى الأنسولين انخفاض وانخفاض تكاثر الخلايا بيتا، وخاصة في الجزر الصغيرة.

Ngn3 التعبير في خلايا القناة بعد PDL من قبل العديد 11،15،16،23،24، Ngn3 التعبير في الجزر خلايا 24،25 والتضارب في نتائج PDL الطعن الملاحظات الأولية لدينا زيادة كتلة خلايا بيتا 26،27، ظهور Ngn3 يعبرون عن المستمدة من القناة الأسلاف الغدد الصماء 24،26،28،29، وزيادة تكاثر الخلايا بيتا 27 بعد PDL 30

يمكن، على الأقل جزئيا، أن تعزى هذه النتائج المتضاربة إلى مجموعة من العوامل، بما في ذلك التغيرات في نقطة زمنية ما بعد العمليات الجراحية في التحليل، ووزن الجسم والجنس وعمر الفئران، الظروف الفسيولوجية والبيئية اللاحقة للعمليات الجراحية، والأهم من ذلك، تزداد باستمرار الخلافات في تقنية جراحية. 30 في أيدينا، وانتشار الخلايا بيتا، والمحتوى الأنسولين، وحجم خلايا بيتا وعدد من الجزر الصغيرة بعد PDL. أيضاNgn3 مرنا يزيد باستمرار، ولكن هناك اختلافات كبيرة في التعبير Ngn3 مرنا بين PDL البنكرياس الذيل، والتي لدينا أي تفسير المباشر. افترضنا أن مستوى Ngn3 مرنا قد تتطابق مع درجة من neogenesis خلايا بيتا من الخلايا غير بيتا 15، ولكن هذا يحتاج إلى مزيد من الأدلة. على الرغم من أنه لا يزيل كل الاختلافات التجريبية، طريقة موحدة لأداء جراحة PDL يسمح التوحيد أفضل في النتائج ويفتح آفاقا جديدة في دراسة تكاثر الخلايا بيتا وneogenesis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

جميع التلاعب اتباع المبادئ التوجيهية الصادرة عن الاتفاقية الأوروبية لحماية الحيوانات الفقارية المستخدمة للأغراض العلمية والتجريبية الأخرى (ETS 123 وو 2010/63 / EU).

1. إعداد مساحة العمل

  1. توفير منطقة مخصصة إعداد، ومنطقة العمليات الجراحية ومنطقة الانتعاش.
  2. إجراء عملية جراحية كامل في مجلس الوزراء تدفق الصفحي للحد من الملوثات البيئية.
  3. تجميع الإمدادات (كما هو موضح في المواد وطرق) اللازمة في مجال إعداد والجراحية والانتعاش، وذلك باستخدام تقنية العقيم المناسبة.
  4. التأكد من أن الأدوات الجراحية وتعقيمها قبل الجراحة.
  5. توفير وسادة تسخين المياه إعادة تدوير عند درجة حرارة 38 ° C لتحقيق الاستقرار في درجة الحرارة أثناء الجراحة. تغطية لوحة التدفئة مع وسادة للماء معقم.
  6. توفير المجهر التشغيل مع التكبير على الأقل 6.3X.
  7. استخدام أداة ستيريكتبها Lizer، مثل حبة تعقيم الساخن، لتعقيم الأدوات بين العمليات الجراحية.
  8. إعداد منطقة الانتعاش تتألف من قفص كبير، تصطف بجانب الفراش ورقة مسطحة

2. إعداد الحيوانات لجراحة

  1. لPDL وجراحة صورية، استخدم 8 الاسبوع الفئران الذكور القديمة، ويضم في أقفاص القياسية والحفاظ على 12 ساعة ضوء / 12 ساعة دورة الظلام وتغذية القياسية القوارض النظام الغذائي بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية.
    ملاحظة: يتم هنا استخدام الفئران BALB / cJrJ ولكن أيضا نحن قد استخدمت بنجاح سلالات أخرى ومختلف السلالات المعدلة وراثيا.
  2. استخدام Buprenophine كما تسكين وقائية (0،05 حتي 0،1 ملغ / كلغ) 30 دقيقة قبل الجراحة.
  3. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغم / كغم من الكيتامين و 5-10 ملغم / كغم من زيلازين.
  4. تقييم التخدير المناسبة من خلال مراقبة فقدان تدريجي للحركة الطوعية واسترخاء العضلات. اختبار فقدان ردود الفعل من قبل أخمص القدمين معسر.
  5. تطبيق مرهم للعين لالسابقجفاف الأنف والحنجرة العينين في حين تحت التخدير.

3. الموقع الجراحي إعداد

  1. تطهير الصدر والبطن بمحلول الكلورهيكسيدين مطهر.
  2. يحلق على مساحة 2.5 سم × 1.5 سم من البطن.
  3. تطهير المنطقة حليق باستخدام الشاش غارقة مع حل الكلورهيكسيدين، ثم حل الكحول وتطبيق النهائي من حل الكلورهيكسيدين.
  4. وضع الحيوان في منطقة العمليات الجراحية بحيث موقع الجراحية استعداد يواجه صعودا الجراح.
  5. ثنى الماوس باستخدام ثنى الجراحية للماء مع الافتتاح ان يترك منطقة البطن تطهيرها يتعرض بينما تغطي باقي الجسم لإنشاء حقل العمل العقيمة. مراقبة الماوس قبل إجراء عمق التخدير.

4. البنكرياس وربط القناة

  1. البطن
    1. إجراء شق خط الوسط العلوي في الجلد تمتد من عملية الخنجري الى السرة باستخدام العقيمةشفرة جراحية. فصل الكامنة ألبا والصفاق باستخدام مقص العقيمة من أجل فضح رباعي البطن العلوي.
    2. منع جفاف التدريجي من الأعضاء الداخلية التي كتبها الرش المنتظم مع معقم 0.9٪ كلوريد الصوديوم.
    3. استخدام ملاقط معقمة أو مسحة، سحب المعدة متفوق، وفضح الطحال والفص الطحال (منطقة الذيل) في البنكرياس.
    4. سحب بلطف الاثني عشر وجزء من الصائم العلوي إلى رباعي البطن العلوي الأيمن لفضح الرأس والعنق ومنطقة الجسم من البنكرياس من الصفاق الحشوي تغطيتها.
  2. رباط
    1. تحديد موقع تشريحي من القناة الرئيسية البنكرياس في منطقة الرقبة من البنكرياس.
    2. شق الصفاق الحشوي والرباط المعدي، منح الوصول إلى خلف البريتوان، وتعريض المنطقة الجسم والذيل من البنكرياس. من أجل فضح منطقة الرقبة، نفذ مناورة كوشر. رفع الاثني عشر ورئيسالبنكرياس قبالة خلف البريتوان رفعهم من الوريد الأجوف السفلي والشريان الأورطي أدناه.
    3. وضع بعناية ملعقة تحت منطقة الرقبة. Ligate القناة البنكرياسية مع 6-0 البرولين موضوع في الجانب الأيسر من الوريد البابي الذي يفصل بين الفصين أمراض المعدة والاثني عشر والطحال.
    4. إجراء عملية ربط الثاني في مقربة من ربط الأول للتأكد من أن فصوص يتم فصل كاف.
    5. Ligate بعناية فائقة حتى لا تتلف الأوعية الدموية الكامنة، وهما الشريان البنكرياسي الإثناعشري متفوقة، والشريان البنكرياسي الإثناعشري السفلي والجزء البنكرياس من الشريان الطحال.
    6. وضع الأجهزة مرة أخرى إلى تجويف البطن.
    7. إغلاق شق باستخدام 4-0 الجليوكول موضوع الخيطية في نمط خياطة المستمر لعضلة / طبقة البريتوني وفي نمط خياطة متقطع للبشرة.

5. الشام جراحة

  1. تنفيذ كافة الخطوات ديمكتوب في الخطوات من 1 إلى 4.1.4. في حين يتعرض البنكرياس، لا يؤدون ربط من القناة البنكرياسية.
  2. في نهاية الخطوة 4.1.4، وضع الأعضاء الداخلية مرة أخرى إلى تجويف البطن.
  3. إغلاق شق كما هو موضح في 4.2.7.

6. العناية ما بعد العمليات والمراقبة

  1. بعد العملية الجراحية كاملة، ضع الماوس في منطقة الانتعاش. هذا يتكون من القفص وضعها على وسادة التدفئة واصطف مع الفراش ورقة مسطحة من أجل الحفاظ على درجة حرارة الجسم العادية.
  2. توفير الدعم الغذائي لتجنب نقص السكر في الدم بعد العمليات الجراحية عن طريق الطعام مبلل وضعت في أسفل القفص. لهذا الغرض، استخدم القياسية الكريات القوارض حمية ينقع في الماء حتى تلين.
  3. تقديم الدعم السوائل عن طريق الغذاء مبلل وتوفير المياه الإعلانية libitum.
  4. استخدام Buprenophine كما تسكين (0،05 حتي 0،1 ملغ / كلغ) مرتين يوميا لمدة 2 أيام بعد الجراحة. خلال التجريبية بأكملها، متابعة، observالبريد الفئران لحدوث علامات محتملة للعدوى، بما في ذلك إفراز السائل أو الصديد من الجرح، أو التدهور المادي تتميز انخفاض في الاستمالة السلوك ومستوى النشاط، وانخفاض الشهية وفقدان وزن الجسم.

7. تقييم نجاح PDL وحصاد PDL الذيل والشام ذيل البنكرياس

  1. الموت ببطء الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم.
  2. إعادة حلق منطقة البطن لتجنب المرحل من الفراء.
  3. فتح البطن الجلد والعضلات طبقة وإزالة مساحة كبيرة من الجلد والعضلات للحصول على سهولة الوصول إلى البنكرياس.
  4. استخدام ملاقط معقمة أو مسحة، وتراجع المعدة متفوق، وفضح الطحال والفص الطحال (منطقة الذيل) في البنكرياس.
  5. سحب للخارج برفق الاثني عشر وجزء من الصائم العلوي لفضح الفص المعدي الاثنى عشر (منطقة الرأس) في البنكرياس.
    ملاحظة: وقد خفضت جزء ligated البنكرياس PDL الآن في الحجم وأصبح تقريباشفافة بحيث الجزر مرئية كنقاط صغيرة بيضاء. جزء من رأس البنكرياس وردي غير واضحة وخارجية الإفراز متميزة للفصيص يمكن ملاحظتها.
  6. باستخدام مقص العقيمة، فصل الذيل جزء ligated البنكرياس من الطحال، عن طريق قطع على طول الطحال. قطع فضفاضة النسيج الضام الذي يربط بين منطقة الذيل من البنكرياس إلى الأعضاء الداخلية.
  7. قطع المنطقة ذيل PDL الحق في الجبهة من الربط، باستثناء ضمد والأنسجة المجاورة على الفور لأنه من النسيج المقطوع.
  8. لعزل الأنسجة ذيل صورية، اتبع الخطوات 7.1 خلال 7.5. باستخدام مقص العقيمة منفصلة المنطقة ذيل البنكرياس صورية من الطحال عن طريق قطع على طول الطحال. عزل المنطقة عن طريق قطع الذيل في منطقة الرقبة من البنكرياس وقطع فضفاضة النسيج الضام الذي يربط بين البنكرياس الذيل إلى الأجهزة الداخلية
    ملاحظة: كل من الذيل ومنطقة رأس البنكرياس صورية والوردي مبهمة، لعزل كل من أجزاء منفصلة،قطع البنكرياس في منطقة الرقبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PDL يدفع ضمور عنيبية والالتهاب لكنها لا تؤثر على وزن الجسم وسكر الدم

في 8 أسابيع من العمر من الذكور BALB / ج الفئران، هو ligated القناة استنزاف إنزيمات خارجية الإفراز من ذيل البنكرياس بينما رئيس الجهاز، ويقع بالقرب من المعدة والاثني عشر، لا تزال تتأثر. العمر والجنس ويقابل وزن الذكور BALB / ج الفئران الخضوع لعملية جراحية صورية تلخص جميع خطوات جزئية لعملية جراحية لاصق ربط، باستثناء ربط لقناة البنكرياس. كان حصادها أنسجة البنكرياس 3، 7، 14، 30 أيام بعد الجراحة.

عندما يتم تنفيذ PDL بشكل صحيح، تظهر الفئران السليمة وعدم إظهار اختلاف كبير في وزن الجسم (الشكل 1A) أو سكر الدم (الشكل 1B) مقارنة مع الفئران الشام التي تديرها. يتم فقدان الأنسجة خارجية الإفراز عنيبية تدريجيا بعد خضوعه لجراحة PDL (الشكل 2A-E)، مما أدى إلى انخفاض في حجم ووزن الجزء ligated من P DL البنكرياس (الشكل 3)، من دعا هناعلى ذيل PDL. ثلاث آخر أيام PDL، مورفولوجيا الأنسجة عنيبية يصبح تعطلت وخلايا عنيبية يخضع موت الخلايا المبرمج (الشكل 4)، وعلى الأرجح محاطا التسلل CD45 + الخلايا المناعية (الشكل 5). في يوم 7 آخر PDL، يتم استبدال العديد من الفصيصات عنيبية التي كتبها تليفي (الشكل 6) والأنسجة الدهنية (الشكل 2C-E)، في حين تخضع المتبقية خلايا عنيبية-عنيبية إلى الأقنية حؤول. يوم 14 آخر PDL، كل عنيبية تقريبا فصيصات تخلو من خلايا عنيبية (الشكل 2A-E) مما يجعل البنكرياس ذيل PDL تبدو شفافة بحيث الجزر تصبح مرئية للعين المجردة (الشكل 3). تتزامن مع بدء عنيبية موت الخلايا المبرمج، لوحظ زيادة في النشاط دورة الخلية من الظهارة الأقنية (الشكل 7).

PDL يدفع زيادة في الأنسولين + بيتا حجم الخلية

ontent "> وبعد أسبوعين من PDL تضاعف حجم خلايا بيتا الإجمالي في ذيل PDL بالمقارنة مع غير ligated ذيل الشام. وكميا حجم خلايا بيتا عن طريق قياس منطقة INS + في 4 ميكرون أقسام، 36 ميكرون والتي تمتد بعيدا في النسيج كله يمثل 10٪ من إجمالي حجم البنكرياس. يحرض PDL زيادة في محتوى الأنسولين بعد أسبوعين من الجراحة مقارنة البنكرياس غير ligated كما يمكن أن تظهر من خلال الآلية التصوير المقطعي كله -tissue البصرية (الأراضي الفلسطينية المحتلة). 15 منذ حجم خلايا بيتا لم يتغير بعد PDL الزيادة في حجم خلايا بيتا هي نتيجة للزيادة في عدد الخلايا بيتا.

PDL يدفع زيادة في تكاثر الخلايا بيتا وتفعيل Ngn3 التعبير

ويتم تحليل تكاثر الخلايا بيتا من قبل المناعى (IHC) تلطيخ في بنكرياسات تحصد 7 أيام و 14 يوما بعد الشام أو PDL الجراحة. وكميا النسبة المئوية للخلايا بيتا إيجابية لانتشار علامة كي-67 قبل فيSPECTION من الخلايا الفردية بطريقة غير مؤتمتة. في 7 و 14 أيام بعد الجراحة PDL، تكاثر الخلايا بيتا في ذيل PDL وزيادة كبيرة بالمقارنة مع غير ligated البنكرياس.

في غضون 3 أيام بعد PDL التعبير عن الجنينية علامة جزيرة السلف هو زيادة Ngn3 بشكل كبير في ذيل PDL بالمقارنة مع البنكرياس غير ligated. وقد تم التوصل إلى مستويات القصوى من Ngn3 نص في حدود 1 في الاسبوع وانخفض بعد ذلك ببطء. نحن بشكل روتيني قياس نشاط جينات Ngn3 بالإعراب عن مستوى Ngn3 ترميز مرنا في البنكرياس PDL بالنسبة لمستوى Ngn3 مستقر في الاثني عشر. اقترحنا مؤخرا أن مدى neogenesis في PDL قد تعتمد على مستوى التنشيط الجيني Ngn3. 15،30

الشكل 1
الشكل 1. PDL لا يؤثر على وزن الجسم أو سكر الدم. وزن الجسم (ز) (A) وسكر الدم (ملغوقد تم قياس / دل) (B) من الشام التي تديرها (أشرطة بيضاء) وPDL الفئران (أشرطة سوداء) في نقاط زمنية مختلفة (يوم 0 و 7 و 14 و 30) بعد الجراحة، ولم تظهر أي اختلاف كبير بين الشام وPDL الفئران تعمل في أي نقطة زمنية. الرقم المنشور في الأصل من قبل شو وآخرون، 2008. 11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. PDL يؤدي إلى الفقدان التدريجي للخلايا عنيبية. التغيير الصرفي من PDL البنكرياس الذيل التي كشفت عنها تلطيخ haematoxylin-يوزين في يوم 3 (ب) و 7 (C)، 14 (D) و 30 (E) بعد الجراحة، بالمقارنة مع الشام التي تديرها ذيل البنكرياس (A). في 3 أيام بعد الربط، لا يمكن إلا أن تعطل خفية من الأنسجة عنيبية يكون سbserved (B). في 7 آخر أيام الربط، وتعطلت الأنسجة عنيبية بشدة، وقد شكلت المجمعات الأقنية (C). في 14 يوما بعد ربط، تبقى خلايا عنيبية قليلة وعنيبية فصيصات يتم استبدال هياكل الأقنية، وهي شبكة ليفية والخلايا الشحمية (المشار إليها بعلامة النجمة (*) في لوحة C و E). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم .

الشكل (3)
الشكل 3. PDL الذيل عند الحصاد. ذيل الشام (A) وPDL الذيل (B) التي تحصد في يوم 14 بعد الجراحة. يتم تقليل الذيل PDL بشكل كبير في الحجم بالمقارنة مع ذيل الشام. الصورة (C) معارض PDL الذيل في اليوم 14 بعد الجراحة في الموقع. بسبب فقدان الخلايا عنيبية، والذيل PDLيبدو شفافة، وقناة البنكرياس الرئيسية مرئيا بوضوح (المشار إليها مع السهم الأسود) والجزر واضحة كما بقع بيضاء صغيرة (المشار إليها مع السهم الأبيض). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. PDL يدفع عنيبية موت الخلايا المبرمج. المناعية لالمشقوق كاسباس 3 في ذيل PDL في 3 و 7 و 14 أيام بعد الجراحة تكشف الهيئات أفكارك في المقصورة عنيبية في ما بعد الجراحة يوم 3 ويوم 7، في حين أن الخلايا عنيبية غائبة تقريبا من PDL الذيل في يوم 14. الحانات التكبير و25 ميكرون. الرقم المنشور في الأصل من قبل شو وآخرون، 2008. 11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

= "الشكل 5" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 52765 / 52765fig5.jpg" />
الرقم 5. PDL يدفع تسلل الخلايا المناعية. المناعية لCD45 الكريات البيض علامة، وتبين وجود عدد كبير من الخلايا المناعية في ذيل PDL بعد 7 أيام من الجراحة مقارنة البنكرياس زائفة. الحانات التكبير هي 50 ميكرون. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6. PDL يدفع التليف. المناعية لأكتين ألفا العضلات الملساء تبين وجود شبكة ليفية في ذيل PDL بعد 14 أيام من الجراحة بالمقارنة مع البنكرياس زائفة. الحانات التكبير هي 50 ميكرون. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

</ HTML"الشكل 7" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 52765 / 52765fig7.jpg" />
الرقم 7. PDL يدفع زيادة في تكاثر الخلايا لاصق. المناعية مزدوج لعلامة الخلية القناة Cytokeratin 19 (CK19) وللBrdU انتشار علامة يبين زيادة في النشاط دورة حياة الخلايا لاصق. الحانات التكبير هي 25 ميكرون. الرقم المنشور في الأصل من قبل شو وآخرون، 2008. 11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies for preparation area 
Hibiscrub  Regent Medical 5601IE5F11 Chlorhexidin diglucon
Ketamin Ceva BE-V202526 anesthesia
Rompun(2%) (Xylazin) Bayer BE-V041815 anesthesia
Duratears Alcon 34335-8 ointment for eyes
Razor
Supplies for surgical area 
Leica Operating microscope Leica 10446320
Hot bead sterilizer Fine Science Tools (FST) 18000-45
autoclaved surgical instruments Fine Science Tools (FST)
Recirclulating water heating pad Gaymar Industries, Inc. TP702
Adhesive OP-towel BARRIER 706500-07
OP-tape BARRIER 381035-00
Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) Lohmann&Rauscher International 35968
Mini Plasco 0.9% NaCl solution B.BRAUN 3521680
6-0 prolene suture Ethicon 8706H
4-0 polyglycol suture Ethicon SL-607
Supplies for recovery area
Paper bedding (paper towel)
Vetergesic ecuPhar BE-V342955
Materials for analysis
Taqman Ngn3 primer Integrated DNA technologies Mm.PT.56a.33574796.gs
Taqman CycloA primer Integrated DNA technologies Mm.PT.39a.2.gs
anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) Cell Signaling 5A1E
anti-mouse/rat Ki-67 antibody eBioscience 14-5698-82
monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) Sigma 085K4889
anti-rat Cytokeratin 19  DSHB
monoclonal Mouse anti-BrdU Dako M0744
Hoechst Sigma 33342

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shaw, J. E., Sicree, R. A. Global estimates of the prevalence of diabetes for. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
  2. Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2·7 million participants. Lancet. 378, 31-40 (2011).
  3. Borowiak, M., Melton, D. A. How to make beta cells. Current opinion in Cell Biology. 21, 727-732 (2009).
  4. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 1607-1611 (2000).
  5. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, 2447-2457 (2002).
  6. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429, 41-46 (2004).
  7. Teta, M., Rankin, M. M., Long, S. Y., Stein, G. M., Kushner, J. A. Growth and regeneration of adult beta cells does not involve specialized progenitors. Dev Cell. 12, 817-826 (2007).
  8. Bonner-Weir, S. Perspective: Postnatal pancreatic beta cell growth. Endocrinology. 141, 1926-1929 (2000).
  9. Brennand, K., Huangfu, D., Melton, D. All beta cells contribute equally to islet growth and maintenance. PLoS Biol. 5, e163 (2007).
  10. Salpeter, S. J., Klein, A. M., Huangfu, D., Grimsby, J., Dor, Y. Glucose and aging control the quiescence period that follows pancreatic beta cell replication. Development. 137, 3205-3213 (2010).
  11. Xu, X., et al. Beta cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse pancreas. Cell. 132, 197-207 (2008).
  12. Wang, R. N., Kloppel, G., Bouwens, L. Duct- to islet-cell differentiation and islet growth in the pancreas of duct-ligated adult rats. Diabetologia. 38, 1405-1411 (1995).
  13. Yasuda, H., et al. Cytokine expression and induction of acinar cell apoptosis after pancreatic duct ligation in mice. Journal of interferon, & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 19, 637-644 (1999).
  14. Van Gassen, N., et al. Macrophage dynamics are regulated by local macrophage proliferation and monocyte recruitment in injured pancreas. European journal of immunology. (2015).
  15. Van de Casteele, M., et al. Neurogenin 3+ cells contribute to beta-cell neogenesis and proliferation in injured adult mouse pancreas. Cell Death Dis. 4, e523 (2013).
  16. Xiao, X., et al. No evidence for beta cell neogenesis in murine adult pancreas. The Journal of clinical investigation. 123, 2207-2217 (2013).
  17. Ackermann Misfeldt, A., Costa, R. H., Gannon, M. Beta-cell proliferation, but not neogenesis, following 60% partial pancreatectomy is impaired in the absence of FoxM1. Diabetes. 57, 3069-3077 (2008).
  18. Lee, C. S., De Leon, D. D., Kaestner, K. H., Stoffers, D. A. Regeneration of pancreatic islets after partial pancreatectomy in mice does not involve the reactivation of neurogenin-3. Diabetes. 55, 269-272 (2006).
  19. Bonner-Weir, S., Sharma, A. Pancreatic stem cells. The Journal of pathology. 197, 519-526 (2002).
  20. Nir, T., Melton, D. A., Dor, Y. Recovery from diabetes in mice by beta cell regeneration. The Journal of clinical investigation. 117, 2553-2561 (2007).
  21. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85, 1255-1270 (2005).
  22. Wang, S., et al. Neurog3 gene dosage regulates allocation of endocrine and exocrine cell fates in the developing mouse pancreas. Developmental biology. 339, 26-37 (2010).
  23. Pan, F. C., et al. Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration. Development. 140, 751-764 (2013).
  24. Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
  25. Wang, S., et al. Sustained Neurog3 expression in hormone-expressing islet cells is required for endocrine maturation and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9715-9720 (2009).
  26. Kopinke, D., et al. Lineage tracing reveals the dynamic contribution of Hes1+ cells to the developing and adult pancreas. Development. 138, 431-441 (2011).
  27. Rankin, M. M., et al. beta-Cells are not generated in pancreatic duct ligation-induced injury in adult mice. Diabetes. 62, 1634-1645 (2013).
  28. Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
  29. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43, 34-41 (2011).
  30. Van de Casteele, M., et al. Partial duct ligation: beta-cell proliferation and beyond. Diabetes. 63, 2567-2577 (2014).
  31. Zhang, J., Rouse, R. L. Histopathology and pathogenesis of caerulein-, duct ligation-, and arginine-induced acute pancreatitis in Sprague-Dawley rats and C57BL6 mice. Histology and histopathology. 29, 1135-1152 (2014).
  32. Martinez-Romero, C., et al. The epigenetic regulators Bmi1 and Ring1B are differentially regulated in pancreatitis and pancreatic ductal adenocarcinoma. The Journal of pathology. 219, 205-213 (2009).
  33. Prevot, P. P., et al. Role of the ductal transcription factors HNF6 and Sox9 in pancreatic acinar-to-ductal metaplasia. Gut. 61, 1723-1732 (2012).
الإصابات الجراحية للماوس البنكرياس من خلال من ربط والبنكرياس القناة نموذجا للالغدد الصماء وخارجية الإفراز إعادة برمجة وانتشار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Groef, S., Leuckx, G., Van Gassen, N., Staels, W., Cai, Y., Yuchi, Y., Coppens, V., De Leu, N., Heremans, Y., Baeyens, L., Van de Casteele, M., Heimberg, H. Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation. J. Vis. Exp. (102), e52765, doi:10.3791/52765 (2015).More

De Groef, S., Leuckx, G., Van Gassen, N., Staels, W., Cai, Y., Yuchi, Y., Coppens, V., De Leu, N., Heremans, Y., Baeyens, L., Van de Casteele, M., Heimberg, H. Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation. J. Vis. Exp. (102), e52765, doi:10.3791/52765 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter