This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.
توسيع خلايا بيتا في البنكرياس في الجسم الحي أو خارج الجسم، أو توليد خلايا بيتا التي كتبها التمايز من الخلايا الجذعية الجنينية أو الكبار، يمكن أن توفر مصادر للتوسيع جديدة من خلايا بيتا للتخفيف من ندرة المانحة في زرع جزيرة البشري كعلاج لمرض السكري. وعلى الرغم من إحراز تقدم في الآونة الأخيرة نحو هذا الهدف، الآليات التي تنظم بيتا توسيع الخلايا والتمايز من الخلايا الجذعية / السلف لا تزال تتسم. هنا، نحن تصف بروتوكول للنموذج إصابة في الماوس البنكرياس الكبار التي يمكن أن تعمل كأداة لدراسة آليات إعادة تشكيل الأنسجة وتكاثر الخلايا بيتا والتمايز. الجزئي لاصق ربط (PDL) هو ضرر الناجم تجريبيا البنكرياس القوارض التي تنطوي على الربط الجراحي للقناة البنكرياس الرئيسية مما أدى إلى إعاقة تصريف المنتجات الإفرازية للخروج من منطقة الذيل من البنكرياس. الأضرار التي لحقت يدفع ضمور عنيبية، infilt الخلايا المناعيةالتموينية وإعادة تشكيل الأنسجة شديدة. لقد ذكرت سابقا تفعيل Neurogenin (NGN) 3 معربا عن الخلايا الشبيهة السلف الذاتية وزيادة في تكاثر الخلايا بيتا بعد PDL. ولذلك، يوفر PDL أساس لدراسة الإشارات تشارك في ديناميات خلايا بيتا وخصائص من السلف الغدد الصماء في البنكرياس الكبار. منذ ذلك الحين، فإنه لا يزال من غير الواضح إلى حد كبير، مما العوامل ومسارات تسهم في neogenesis خلايا بيتا والانتشار في PDL، فإن بروتوكول موحد لPDL تسمح للمقارنة عبر المختبرات.
تزايد انتشار مرض السكري، والتي تؤثر على أكثر من 300 مليون شخص على مستوى العالم 1،2 عزز البحث عن مصادر جديدة للخلايا بيتا المنتجة للأنسولين، على حد سواء في المختبر وفي الجسم الحي، لتجديد نقص كتلة خلايا بيتا. 3 تحديد الرئيسي يمكن لآليات والعوامل التي تنظم تكاثر الخلايا بيتا وبيتا خلية neogenesis، أي تمايز الخلايا بيتا من خلية خلية أو السلف غير بيتا، وتوفير أهداف جديدة لتطوير علاجات التجدد في مرض السكري.
في البنكرياس القوارض النامية، جميع أنواع الخلايا والغدد الصماء التفريق من السكان الرحل من خلايا الغدد الصماء السلف، معربا عن عامل النسخ Neurogenin3 (Ngn3). 4،5 في البنكرياس القوارض الكبار، في ظل ظروف فسيولوجية طبيعية، كتلة خلايا بيتا هي الحفاظ على العدد الأمثل لتلبية مطالب الأيضية. التغييرات في بيتا حجم الخلية،موت الخلايا المبرمج والتكرار تشكل آليات رئيسية لبيتا توسيع الخلايا وتتحول إلى أكثر من 6-8 الرغم من أن إمكانيات خلايا بيتا لتتكاثر في ظل ظروف طبيعية فسيولوجية غير متجانسة بين جميع السكان من 9 معدل انتشارها منخفضة ويقتصر إعادة تكرارها من قبل فترة دينامية السكون أو فترة صهر 6،7، وتتأثر العمر وايض الجلوكوز. 10 منذ حتى الآن لم يتم تحديد خلايا الغدد الصماء في البنكرياس السلف الكبار العادي، ويعتقد neogenesis لعدم المساهمة في نمو الخلايا بيتا الكبار العادي. 8
وبالتالي، فإن تحديد خلية الغدد الصماء السلف الاختيارية في البنكرياس الكبار التي يمكن توسيعها وقادرة على إنتاج خلايا بيتا الجديدة ستوفر رواية، وربما مصدر غير محدود من خلايا بيتا.
الجزئي لاصق ربط (PDL) هو نموذج إصابة الحيوان الذي تم وصفه للحث على neogenesi خلايا بيتاالصورة في البنكرياس الكبار. 11،12 في هذا النموذج، والقناة البنكرياسية الرئيسي تجفيف ذيل البنكرياس هو ligated جراحيا. العرقلة الناتجة من الصرف خارجية الإفراز يستحث إعادة تشكيل الأنسجة كبير، يرافقه التهاب وضمور عنيبية البعيدة إلى ربط 12-14 ضمن هذه البيئة التهابات، وإعادة التعبير للعلامة الغدد الصماء السلف هو فعل Ngn3 وحجم خلايا بيتا يزيد شقين . هذا الضعف في بيتا النتائج حجم الخلية من توليد خلايا بيتا جديدة من Ngn3 التعبير عن نوع الجنين خلية الغدد الصماء والسلف من انتشار الخلايا الموجودة مسبقا والتي شكلت حديثا بيتا التي تكون عرضة لإعادة ازدواجية دون "فترة هدوء". 11،15
neogenesis خلايا بيتا وتكرارها في النماذج الإصابة، مثل استئصال البنكرياس 6،7،16-19 والاجتثاث الانتقائي للخلايا بيتا 20 وقد وصفت على نطاق واسع. ومع ذلك، فإن النتيجة التجدد في تسايتأثر النماذج الإلكترونية وفقا لمدى الأضرار التي لحقت ويرتبط مع بيتا كتلة الخلايا الأولية انخفضت 21. PDL هو نموذج العمليات الجراحية التي لا يتأثر كتلة خلايا بيتا الأولية ويتم تنشيط neogenesis خلايا بيتا والانتشار بقوة. في الواقع، في بنكرياس الفئران التي خضعت PDL، ويتم تحديد الخلايا معربا عن Ngn3 بالقرب من البطانة الطلائية للقناة. هذه الخلايا يمكن عزل من البنكرياس ligated من Ngn3-GFP الفئران المعدلة وراثيا باستخدام مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) وقادرون على تمييز تجاه خلايا بيتا الوظيفية التالية engraftment في الجسم الحي وخارج ثقافة البنكرياس من E12.5 Ngn3 – / – . الفئران 11 وبالمثل، في Ngn3 CreERT؛ 15 الفئران R26 YFP فيها الخلايا التي تنشط الجين Ngn3 وصفت بشكل دائم بعد الحقن تاموكسيفين، تم الكشف عن Ngn3 خلايا بيتا المشتقة من خلية التسمية إيجابية بعد PDL وعلاوة على ذلك، وخلايا بيتا التي شكلت حديثا تمييع قبل -موجودةجي خلايا بيتا وتحديد موقع تفضيلي في الجزر الصغيرة من خلاله تظهر خلايا بيتا قدرة عالية الانتشار. 15 Ngn3 مهمة لتوسيع خلايا بيتا بعد PDL منذ انخفض Ngn3 التعبير عن الرأي محددة الهدف RNA قصيرة دبوس انخفاضات كبيرة في كتلة خلايا بيتا وتكاثر الخلايا بيتا بعد PDL. 11 والجدير بالذكر أن جزء من Ngn3 خلايا بيتا المشتقة من خلية وكتلة خلايا بيتا بعد PDL يعتمد بشكل كبير على مستوى Ngn3 تحريض 15. هذا هو وفقا لملاحظة أن مستوى عال من Ngn3 التعبير هو خطوة حاسمة لالتزام الغدد الصماء من الأسلاف البنكرياس متعددة القدرات خلال تطوير البنكرياس 22 بالإضافة إلى ذلك، الاجتثاث الانتقائي للNgn3 معربا عن الخلايا عن طريق إدارة الخناق والسم لNgn3 CreERT؛ الفئران R26 iDTR 15 نتائج في المحتوى الأنسولين انخفاض وانخفاض تكاثر الخلايا بيتا، وخاصة في الجزر الصغيرة.
<pالطبقة = "jove_content"> وعلى الرغم من تأكيد تحريض Ngn3 التعبير في خلايا القناة بعد PDL من قبل العديد 11،15،16،23،24، Ngn3 التعبير في الجزر خلايا 24،25 والتضارب في نتائج PDL الطعن الملاحظات الأولية لدينا زيادة كتلة خلايا بيتا 26،27، ظهور Ngn3 يعبرون عن المستمدة من القناة الأسلاف الغدد الصماء 24،26،28،29، وزيادة تكاثر الخلايا بيتا 27 بعد PDL 30يمكن، على الأقل جزئيا، أن تعزى هذه النتائج المتضاربة إلى مجموعة من العوامل، بما في ذلك التغيرات في نقطة زمنية ما بعد العمليات الجراحية في التحليل، ووزن الجسم والجنس وعمر الفئران، الظروف الفسيولوجية والبيئية اللاحقة للعمليات الجراحية، والأهم من ذلك، تزداد باستمرار الخلافات في تقنية جراحية. 30 في أيدينا، وانتشار الخلايا بيتا، والمحتوى الأنسولين، وحجم خلايا بيتا وعدد من الجزر الصغيرة بعد PDL. أيضاNgn3 مرنا يزيد باستمرار، ولكن هناك اختلافات كبيرة في التعبير Ngn3 مرنا بين PDL البنكرياس الذيل، والتي لدينا أي تفسير المباشر. افترضنا أن مستوى Ngn3 مرنا قد تتطابق مع درجة من neogenesis خلايا بيتا من الخلايا غير بيتا 15، ولكن هذا يحتاج إلى مزيد من الأدلة. على الرغم من أنه لا يزيل كل الاختلافات التجريبية، طريقة موحدة لأداء جراحة PDL يسمح التوحيد أفضل في النتائج ويفتح آفاقا جديدة في دراسة تكاثر الخلايا بيتا وneogenesis.
In the present study, we describe in detail the methodology behind PDL, a mouse injury model to study beta cell neogenesis and proliferation and transdifferentiation of pancreatic non-beta cells. Ambiguity in data on PDL among labs stimulates the need for a standardized protocol for PDL surgery.
Critical steps in the PDL protocol include the selection of healthy, young mice for surgery. Preferably male mice should be used since unpublished data from our lab suggest that estrogen receptor signa…
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge all colleagues who made this work possible; Ann Demarré, Veerle Laurysens, Jan De Jonge and Erik Quartier for technical assistance. Financial support was from the VUB Research Council, the Institute for the Promotion of Innovation by Science and Technology in Flanders (IWT), the Beta Cell Biology Consortium (BCBC), the Fund for Scientific Research Flanders (FWO), Diabetes Onderzoek Nederland (DON) and Interuniversity Attraction Pole (IAP).
Supplies for preparation area | |||
Hibiscrub | Regent Medical | 5601IE5F11 | Chlorhexidin diglucon |
Ketamin | Ceva | BE-V202526 | anesthesia |
Rompun(2%) (Xylazin) | Bayer | BE-V041815 | anesthesia |
Duratears | Alcon | 34335-8 | ointment for eyes |
Razor | |||
Supplies for surgical area | |||
Leica Operating microscope | Leica | 10446320 | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools (FST) | 18000-45 | |
autoclaved surgical instruments | Fine Science Tools (FST) | ||
Recirclulating water heating pad | Gaymar Industries, Inc. | TP702 | |
Adhesive OP-towel | BARRIER | 706500-07 | |
OP-tape | BARRIER | 381035-00 | |
Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) | Lohmann&Rauscher International | 35968 | |
Mini Plasco 0,9% NaCl solution | B.BRAUN | 3521680 | |
6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
4-0 polyglycol suture | Ethicon | SL-607 | |
Supplies for recovery area | |||
Paper bedding (paper towel) | |||
Vetergesic | ecuPhar | BE-V342955 | |
Materials for analysis | |||
Taqman Ngn3 primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.56a.33574796.gs | |
Taqman CycloA primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.39a.2.gs | |
anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) | Cell Signaling | 5A1E | |
anti-mouse/rat Ki67 antibody | eBioscience | 14-5698-82 | |
monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) | Sigma | 085K4889 | |
anti-rat Cytokeratin 19 | DSHB | ||
monoclonal Mouse anti-BrdU | Dako | M0744 | |
Hoechst | Sigma | 33342 |