Abstract
扩张胰腺β细胞在体内或体外 ，或产生β细胞通过分化从胚胎或成体干细胞，可以提供β细胞的新扩展的来源，以减轻在人类胰岛移植的治疗糖尿病的供体短缺。虽然最近已经取得进展实现这一目标，调节β细胞扩增和分化的干/祖细胞的机制仍有待特点。在这里，我们描述了一个协议，用于在成年小鼠胰腺可作为研究组织重构和β细胞的增殖和分化的机制的工具功能的损伤模型。局部管结扎（PDL）是啮齿动物胰腺涉及造成阻塞的外分泌产物引流出来的尾部区域胰腺的主胰管手术结扎的实验诱导的损伤。在造成损伤诱导腺泡萎缩，免疫细胞infilt口粮和严重组织重塑。我们以前曾报道神经元素（NGN）3的活化表达内源祖细胞样细胞和PDL后增加β细胞增殖。因此，PDL提供了基础，研究涉及β细胞动力学信号，并在成人胰腺内分泌祖细胞的性质。因为，它仍然在很大程度上仍然不清楚，哪些因素和途径促进β细胞新生和增殖的客运专线，标准化的协议将PDL允许跨实验室比较。
Introduction
糖尿病的患病率增加，影响超过3亿人口的世界级1,2提振了寻找新产生胰岛素的β细胞的来源，无论是在体外和体内，以补充不足的β细胞质量。3识别关键机制和因素调节β细胞增殖和β细胞新生， 即 β细胞从非β细胞或祖细胞的分化，可以用于再生治疗的糖尿病的发展提供了新的目标。
在显影啮齿动物胰腺，所有的内分泌细胞类型，从内分泌祖细胞的流动人口区分，表达转录因子Neurogenin3（Ngn3的）。4,5在成年啮齿动物胰腺，在正常生理条件下，β细胞量是保持在一个最佳的数量，以满足代谢需求。改变β细胞的大小，凋亡和复制构成为β细胞扩张和关上。6-8的主要机制虽然β细胞的潜力，在正常生理条件下增殖是整个人口均匀的，9其增殖率低和再复制是通过限制由于内分泌祖细胞迄今尚未在正常成人胰腺确定一个动态静止期间或不应期6,7，按年龄和葡萄糖代谢的影响。10，新生被认为不利于正常成人的β细胞的生长。8
因此，在成人胰腺即膨胀并能产生新的β细胞将提供一种新的，β细胞可能无限来源的兼性内分泌祖细胞的鉴定。
局部管结扎（PDL）是已经描述以诱导β细胞neogenesi动物损伤模型S在成人胰腺11,12在此模型中，主胰管引流胰尾被手术结扎。外分泌引流阻塞造成重大诱导组织重塑，伴有炎症和腺泡萎缩远端结扎12-14在这种炎症环境中，重新表达的内分泌祖标记Ngn3的是诱导β细胞的体积会增加两倍。此加倍的β细胞量的结果从新的β细胞的产生由一个Ngn3的表达胚胎型内分泌祖细胞，并从预先存在的和新形成的β细胞，它们很容易重新复制没有“静止时期”的增殖。 11,15
β细胞新生和复制在损伤模型，如胰腺6,7,16-19和β细胞20的选择性消融已被广泛地描述。但是，在采取这些再生结果E型是由造成损伤的程度的影响，与降低的初始β细胞量21相关联。 PDL是其中最初的β细胞的质量不会受到影响，β细胞新生和增殖被鲁棒地激活一个外科模型。事实上，在小鼠接受PDL的胰腺，Ngn3的表达细胞被识别为靠近管道的上皮衬里。这些细胞可以从Ngn3的-GFP转基因小鼠的结扎胰腺使用荧光激活细胞分选（FACS）分离，并能够以下植入入和离体 E12.5 Ngn3的胰腺的培养分化朝官能β细胞- / - 。小鼠11同样，在Ngn3的CreERT; R26 YFP小鼠中细胞激活基因Ngn3的他莫昔芬注射，标签阳性Ngn3的细胞衍生的β细胞被PDL后发现后都将被永久标记15。此外，新成立的β细胞预稀释-exist荷兰国际集团的β细胞，并优先在找到小胰岛在其中β细胞显示出高增殖潜力。15 Ngn3的是PDL后β细胞扩张很重要，因为使用目标特定的短发夹RNA显著减少β细胞大规模和β细胞的增殖后下降Ngn3的表达PDL 11值得注意的是，Ngn3的细胞来源的β细胞的PDL后的级分和β细胞量的关键取决于Ngn3的感应15的水平。这是根据该观察结果Ngn3的表达的高水平是用于从多能胰祖细胞胰腺发育过程中的内分泌承诺的一个关键步骤22此外，Ngn3的表达细胞由白喉毒素给药于Ngn3的CreERT选择性烧蚀; R26 IDTR小鼠结果在降低的胰岛素含量和降低的β细胞增殖，特别是在小的胰岛15
这些相互矛盾的结果可能，至少部分地，被最重要的归因于各种因素，包括变化的小鼠，手术后的生理和环境条件，并进行分析，体重，性别和年龄的手术后的时间点的组合，差异手术技术。30在我们的手中，β细胞增殖，胰岛素含量，β细胞体积和小岛的数量PDL后持续增加。还NGN3 mRNA的持续增加，但在PDL胰腺尾部，为此我们没有直接的解释之间的Ngn3的表达差异较大。我们假设，Ngn3的 mRNA的水平可能与来自非β细胞15的β细胞新生的程度相关，但这需要进一步属实。虽然它不会删除所有的实验变化，标准化的方法进行手术PDL允许在结果更好的一致性，并在研究β细胞的增殖和新生开辟了新的途径。
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Protocol
所有操作遵循保护脊椎动物用于试验和其他科学目的发行的欧洲公约的准则（ETS 123和2010/63 / EU）。
1.准备工作区
- 提供专用的准备区，给外科手术区域和回收区。
- 进行整个手术过程中的层流柜，以尽量减少环境污染物。
- 组装用品所需的制备，手术和恢复区（如在材料和方法中列出），采用适当的无菌技术。
- 确保手术工具在手术前高压灭菌。
- 提供一个再循环水加热垫在38℃的温度稳定在手术过程中的温度。覆盖加热垫用无菌防水垫。
- 提供一种手术显微镜用至少6.3X的倍率。
- 使用仪器免缝lizer，如热珠灭菌，消毒器械在外科手术过程之间。
- 准备恢复区组成的大笼子中，由平板纸床上用品内衬
2.准备动物外科手术
- 对于PDL和假手术，使用8个周龄雄性小鼠，圈养在标准笼子里，维持12小时光照/ 12小时黑暗循环，并饲喂标准的啮齿动物饮食随意 。
注：在这里，我们用BALB / cJrJ小鼠，但我们也成功地使用其他的菌株和各种转基因品系。 - 丁丙诺啡使用作为超前镇痛（0.05 - 0.1毫克/千克）30分钟前手术。
- 10mg / kg的甲苯噻嗪 - 通过腹膜内注射100mg / kg的氯胺酮和5麻醉小鼠。
- 通过观察随意运动和肌肉松弛逐渐丧失正确评估麻醉。测试反射由脚趾捏的损失。
- 应用眼药膏上一页眼睛干涩耳鼻喉科，而在麻醉下。
3.手术场地准备
- 消毒胸部和腹部用消毒洗必泰溶液。
- 剃为2.5cm×1.5cm的腹部的区域。
- 用消毒纱布浸泡洗必泰溶液，再用酒精溶液和洗必泰溶液的最终应用领域剃。
- 定位动物在手术区，使得所制备的手术部位向上面对外科医生。
- 使用防水外科被单有开口留下露出而覆盖身体的其他部分来创建一个无菌工作场的消毒腹部区域悬垂鼠标。监测之前对麻醉深度的方法的鼠标。
4.胰管结扎
- 剖腹手术
- 使上部中线切口，在皮肤用无菌从剑突延伸到肚脐手术刀片。分离底层白线，并使用无菌剪刀以暴露上腹部象限腹膜。
- 防止干燥出内脏定期喷洒消毒用0.9％氯化钠。
- 使用无菌镊子或拭子，缩回胃优，露出脾和胰腺的脾叶（尾区）。
- 轻轻缩回空肠上段的十二指肠和部分向右上腹部象限以暴露覆盖由内脏腹膜胰腺的头部，颈部和主体区域。
- 结扎
- 定位在胰腺的颈部区域中的胰主导管的解剖位置。
- 切开脏腹膜和结肠韧带，准许访问腹膜后，露出胰腺的主体和尾部区域。为了暴露颈部区域，执行科赫尔机动。提起十二指肠和头部关闭腹膜后胰腺从下腔静脉和主动脉之下他们提升。
- 小心地将颈部下方的铲。结扎胰管用6-0 Prolene线螺纹在门静脉分隔胃十二指肠和脾瓣的左侧。
- 执行在靠近第二结扎到第一结扎，以确保瓣适当分开。
- 结扎非常小心，以便不损坏下层的血管，即上级胰十二指肠动脉，胰十二指肠下动脉和脾动脉的胰一部分。
- 将器官放回腹腔。
- 关闭使用4-0聚乙二醇丝状螺纹切口以连续缝合图案为肌肉/腹膜层和在对皮肤的不连续的缝合图案。
5.假手术
- 执行所有的步骤去4.1.4通过划线步骤1。而胰腺暴露，不执行胰管结扎。
- 在步骤4.1.4结束时，将内脏放回腹腔。
- 关闭切口在4.2.7中描述。
6，后期运营维护和监控
- 手术过程完成后，将鼠标在回收区。这包括一个笼子放置在一个加热垫，并镶有平纸张的床上用品，以保持正常的体温。
- 提供营养支持，以避免手术后的低血糖蘸通过食物放置在笼底。为了这个目的，用浸在水中的标准啮齿动物饮食粒料直到它们变软。
- 由食品润湿液提供支持，并提供水随意 。
- 使用丁丙诺啡作为镇痛（0.05 - 0.1毫克/公斤），每天两次2天手术后。在整个实验，跟进，observE中的小鼠发生感染的可能迹象，包括分泌液体或脓液从伤口，或用于修饰行为和活动水平的特点是减少身体每况愈下，食欲降低体重和损失。
7.成功的评价PDL和PDL尾的收获和深尾胰腺
- 安乐死的小鼠通过颈脱位。
- 再剃腹部，避免皮草结转。
- 打开腹部皮肤和肌肉层和除去大面积皮肤和肌肉得到良好的访问胰腺。
- 使用无菌镊子或拭子，胃被优缩回，露出脾和胰腺的脾叶（尾区）。
- 轻轻拉出空肠上段的十二指肠及部分露出胰腺的胃十二指肠叶（头部区域）。
注意：将PDL胰腺的连接部分现在已减小尺寸，并已成为几乎半透明使胰岛白色小圆点可见。胰腺的头部是不透明的粉红色和不同外分泌lobuli可以观察到。 - 使用无菌剪刀，从脾脏中分离的结扎尾巴部分的胰腺，通过沿脾切割。切松结缔组织尾部区域胰腺连接到内部器官。
- 切PDL尾部区域正好在结扎前，但不包括的绑带与所述组织立即从收获的组织邻接它。
- 为了隔离假尾巴组织，按照步骤7.1至7.5。用无菌剪刀沿脾切分开尾部区域的假胰腺脾脏。切成胰腺的颈部区域和切割松开结缔组织尾部胰腺连接到内脏隔离尾部区域
注：假胰腺的两个尾部和头部区域是不透明的粉红色，分别隔离两个部分，切在颈部区域中的胰腺。
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Representative Results
PDL诱导腺泡萎缩和炎症，但不影响体重和血糖
在第8周龄雄性BALB / c小鼠，所述管道排出从胰腺的尾部外分泌酶结扎而器官的头部，位于邻近所述胃和十二指肠，不受影响。年龄，性别和体重匹配的雄性BALB / c小鼠进行假手术扼要所有步骤局部结扎的手术，除了胰管的结扎。胰腺组织收获3，7，14，后30天手术。
当PDL进行正确执行，小鼠出现健康和不显示在体重一个显著差异（ 图1A）或血糖（ 图1B）相比，假手术小鼠。外分泌腺腺泡组织逐渐丧失的PDL手术（ 图2A-E）后，导致P的连接部的小型化和重量 DL胰腺（ 图3），从关于此称为PDL尾巴。三天后的PDL，腺泡组织形态变得破碎和腺泡细胞凋亡（ 图4），并有可能通过渗透CD45 +免疫细胞（ 图5）吞噬。在后第7天的PDL，许多腺泡小叶由纤维化（ 图6）和脂肪组织（ 图2C-E），而其余的腺泡细胞经历腺泡到导管化生取代。在第14天后的PDL，几乎所有的腺泡lobuli是缺乏腺泡细胞（ 图2A-E）的制造中的PDL尾胰腺出现半透明的，使得胰岛变得可见，以肉眼（ 图3）。一致腺泡细胞凋亡的开始时，增加的导管上皮细胞周期活动观察（ 图7）。
PDL引起的增加胰岛素+β细胞体积
内容】“>两周的PDL后在PDL中尾的总β细胞体积比非结扎深水尾了一倍。β细胞量是通过测量INS +区域4微米的部分量化，36微米间隔，横跨整个组织占总胰腺体积的10％。PDL诱导如可以示出通过自动整-tissue光学断层摄影（OPT）。15由于β细胞大小的PDL后不改变手术相比，非结扎胰腺两周后增加胰岛素含量增加β细胞量是增加β细胞数的结果。PDL导致增加β细胞的增殖和Ngn3的表达激活
β细胞增殖免疫组织化学（IHC）染色分析胰腺中收获7天14天假或PDL手术后。 β细胞阳性增殖标记物Ki-67的的百分比通过在量化spection单个细胞在非自动化方式。在第7和14天后的PDL手术，在PDL中尾的β细胞增殖显著相比增加非结扎胰腺。
内PDL中的胚胎胰岛祖标记相比，非结扎胰腺中的PDL尾Ngn3的是显著增加的表达后3天。 Ngn3的成绩单最高水平1周内达成，随后缓慢下降。我们经常测量Ngn3的基因激活表达的PDL胰腺相对于十二指肠稳定Ngn3的水平Ngn3的编码mRNA的水平。最近，我们建议，新生的PDL中的程度可能取决于Ngn3的基因活化的水平。15,30
图1. PDL不影响体重和血糖。体重（G）（A）和血糖（毫克/ dL）的（B）中从假手术（白色条）和PDL小鼠（黑色条），测量在不同时间点（第0天，第7，第14和30），在手术后，并没有表现出假和PDL之间的任何显著差异手术小鼠在任何时间点。图最初由Xu 等出版，2008年11。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. PDL导致腺泡细胞的逐渐丧失 。由苏木精-伊红染色，在第3天（B），7（C），14（D）和30（E）手术后显露PDL胰腺尾部相比，假手术胰尾（A）的形态变化。 3天后结扎，腺泡组织只有一个微妙的破坏可为Observed（B）中 。 7天后结扎，腺泡组织被严重破坏和导管配合已经形成（C）。 14天结扎后，一些腺泡细胞保持和lobuli通过导管结构取代腺泡，纤维网和脂肪细胞（与面板C和E星号（*）表示）。 请点击此处查看该图的放大版本。 。
图3. PDL尾巴在收获。深水尾（A）和PDL尾（B）中收获的第14天手术后。 PDL尾巴是大大减小尺寸相比深水尾巴。图象（C）示出的PDL尾巴在14天手术后在原位 。由于腺泡细胞流失，PDL尾出现半透明的，主胰管清晰可见（用黑色箭头指示）和小岛是可见的白色小点（用白色箭头表示）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4. PDL诱导的腺泡细胞凋亡。在3,7和14天的PDL尾免疫染色裂解-胱天蛋白酶3手术后揭示凋亡小体中的腺泡隔室在第3天以及7天后手术，而腺泡细胞来自几乎不存在PDL尾巴14天倍率条是25微米。图最初由Xu 等出版，2008年11。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图5. PDL诱导免疫细胞浸润。免疫染色的白细胞标记物CD45，呈现出高数量的免疫细胞中的PDL尾部存在手术后第7天相比假胰腺。放大倍率酒吧50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6. PDL引起的纤维化。免疫染色α-平滑肌肌动蛋白显示了一个纤维网络的PDL尾部存在手术后14天相比，假胰腺。放大倍率酒吧50微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
“图7”SRC =“/文件/ ftp_upload / 52765 / 52765fig7.jpg”/>
图7. PDL引起的增加导管的细胞增殖。双重免疫染色的导管细胞标记细胞角蛋白19（CK19）和增殖标志物的BrdU示出了增加在管细胞的细胞周期的活性。放大倍率酒吧25微米。图最初由Xu 等出版，2008年11。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for preparation area | |||
| Hibiscrub | Regent Medical | 5601IE5F11 | Chlorhexidin diglucon |
| Ketamin | Ceva | BE-V202526 | anesthesia |
| Rompun(2%) (Xylazin) | Bayer | BE-V041815 | anesthesia |
| Duratears | Alcon | 34335-8 | ointment for eyes |
| Razor | |||
| Supplies for surgical area | |||
| Leica Operating microscope | Leica | 10446320 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools (FST) | 18000-45 | |
| autoclaved surgical instruments | Fine Science Tools (FST) | ||
| Recirclulating water heating pad | Gaymar Industries, Inc. | TP702 | |
| Adhesive OP-towel | BARRIER | 706500-07 | |
| OP-tape | BARRIER | 381035-00 | |
| Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) | Lohmann&Rauscher International | 35968 | |
| Mini Plasco 0.9% NaCl solution | B.BRAUN | 3521680 | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 4-0 polyglycol suture | Ethicon | SL-607 | |
| Supplies for recovery area | |||
| Paper bedding (paper towel) | |||
| Vetergesic | ecuPhar | BE-V342955 | |
| Materials for analysis | |||
| Taqman Ngn3 primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.56a.33574796.gs | |
| Taqman CycloA primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.39a.2.gs | |
| anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) | Cell Signaling | 5A1E | |
| anti-mouse/rat Ki-67 antibody | eBioscience | 14-5698-82 | |
| monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) | Sigma | 085K4889 | |
| anti-rat Cytokeratin 19 | DSHB | ||
| monoclonal Mouse anti-BrdU | Dako | M0744 | |
| Hoechst | Sigma | 33342 |
References
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