Abstract
L'espansione delle cellule beta pancreatiche in vivo o ex vivo, o la generazione di cellule beta per il differenziamento di una cellula staminale embrionale o adulto, in grado di fornire nuove fonti espandibili di cellule beta per alleviare la scarsità dei donatori nel trapianto di isole umana come terapia per il diabete. Nonostante i recenti progressi sono stati compiuti verso questo obiettivo, i meccanismi che regolano la crescita delle cellule beta e la differenziazione da cellule staminali / progenitrici devono ancora essere caratterizzato. Qui, descriviamo un protocollo per un modello di ferita nel topo pancreas adulto che può funzionare come strumento per studiare i meccanismi di rimodellamento del tessuto e la proliferazione delle cellule beta e la differenziazione. Legatura del dotto parziale (PDL) è una lesione indotta sperimentalmente del pancreas roditore coinvolge legatura chirurgica del dotto pancreatico principale con conseguente ostruzione del drenaggio di prodotti esocrine dalla regione coda del pancreas. Il danno inflitto induce atrofia acinare, infilt cellule immunitarierazione e severo rimodellamento tissutale. Abbiamo già riferito l'attivazione di neurogenina (NGN) 3 esprimono cellule progenitrici simili endogene e un aumento della proliferazione delle cellule beta, dopo Pdl. Pertanto, PDL fornisce una base per studiare segnali coinvolti nella dinamica cellule beta e le proprietà di un progenitore endocrina pancreatica adulta. Dal momento che, resta ancora in gran parte poco chiaro, quali fattori e percorsi contribuiscono alla neogenesi delle cellule beta e la proliferazione in PDL, un protocollo standardizzato per PDL permetterà confronto tra laboratori.
Introduction
La crescente prevalenza del diabete, che colpisce più di 300 milioni di persone in tutto il mondo 1,2 ha favorito la ricerca di nuove fonti di cellule beta produttrici di insulina, sia in vitro che in vivo, per ricostituire la massa di cellule beta carente. 3 Identificazione chiave meccanismi e fattori che regolano la proliferazione delle cellule beta e beta neogenesi delle cellule, cioè, la differenziazione di cellule beta da una cellula cellula o progenitrici non beta, possono fornire nuovi bersagli per lo sviluppo di terapie rigenerative nel diabete.
Nei sviluppo pancreas roditori, tutti i tipi di cellule endocrine differenziare da una popolazione transitoria di cellule progenitrici endocrine, che esprime il fattore di trascrizione Neurogenin3 (Ngn3). 4,5 nel pancreas roditori adulti, in condizioni fisiologiche normali, la massa delle cellule beta è mantenuta ad un numero ottimale per soddisfare esigenze metaboliche. Cambiamenti nella dimensione delle cellule beta,apoptosi e replica costituiscono i principali meccanismi di espansione delle cellule beta e turn-over. 6-8 Mentre il potenziale delle cellule beta di proliferare in condizioni fisiologiche normali è omogenea in tutta la popolazione, 9 il loro tasso di proliferazione è basso e ri-replica è limitato da un periodo di stasi dinamica o periodo refrattario 6,7, influenzato da età e il metabolismo del glucosio. 10 Dato che le cellule progenitrici endocrine non sono finora state identificate nel normale pancreas adulti, neogenesi è pensato di non contribuire alla crescita delle cellule beta adulta normale. 8
Pertanto, l'identificazione di una cellula progenitrice facoltativo endocrine nel pancreas adulto che è espandibile e in grado di produrre nuove cellule beta fornirebbe un romanzo, possibilmente fonte illimitata di cellule beta.
Legatura del dotto parziale (PDL) è un modello di lesione animale che è stato descritto per indurre neogenesi delle cellule betas nel pancreas adulti. 11,12 In questo modello, il dotto pancreatico principale svuotamento della coda pancreatica è chirurgicamente legatura. L'ostruzione conseguente drenaggio esocrina induce rimodellamento tissutale principale, accompagnato da infiammazione e atrofia acinare distale alla legatura. 12-14 All'interno di questo ambiente infiammatorio, ri-espressione del marcatore endocrino progenitore Ngn3 è indotta e il volume delle cellule beta aumenta duplice . Questo raddoppio risultati beta di volume delle cellule dalla generazione di nuove cellule beta da un Ngn3 esprimere embrionale-tipo di cellule endocrine progenitore e dalla proliferazione delle cellule beta preesistenti e di nuova costituzione che tendono a ri-duplicazione senza "periodo di quiescenza". 11,15
Neogenesi delle cellule beta e la replica in modelli di pregiudizio come la pancreatectomia 6,7,16-19 e l'ablazione selettiva delle cellule beta 20 sono stati ampiamente descritti. Tuttavia, il risultato rigenerativa in these modelli è influenzato dalla entità del danno inflitto ed è associata con una diminuzione della beta iniziale massa cellulare 21. PDL è un modello chirurgica in cui la massa di cellule beta iniziale non è interessato e neogenesi e la proliferazione delle cellule beta sono robustamente attivati. Infatti, nel pancreas di topi sottoposti a PDL, cellule che esprimono Ngn3 sono identificati vicino al rivestimento epiteliale del condotto. Queste cellule possono essere isolate dal pancreas legatura di Ngn3-GFP topi transgenici utilizzando la fluorescenza delle cellule attivate (FACS) e sono in grado di differenziare verso le cellule beta funzionali seguente attecchimento in e ex vivo della cultura del pancreas di E12.5 Ngn3 - / - . topi 11 Allo stesso modo, in Ngn3 CreERT;. topi R26 YFP in cui le cellule che attivano il gene Ngn3 sono etichettati in modo permanente dopo l'iniezione tamoxifene, Ngn3 cellule beta cellule derivate label-positivi vengono rilevati dopo Pdl 15 Inoltre, le cellule beta di nuova formazione diluire pre -existing cellule beta e preferenzialmente localizzare in piccoli isolotti entro cui le cellule beta mostrano un alto potenziale di proliferazione. 15 Ngn3 è importante per l'espansione delle cellule beta dopo PDL da ridotta espressione Ngn3 utilizzando RNA breve tornante specifici target diminuisce significativamente la massa delle cellule beta e la proliferazione delle cellule beta dopo PDL. 11 In particolare, la frazione di cellule beta cellule derivate Ngn3 e la massa delle cellule beta dopo PDL dipende criticamente dal livello di Ngn3 induzione 15. Ciò è in accordo con l'osservazione che alto livello di espressione Ngn3 è un passaggio fondamentale per l'impegno endocrino da progenitori pancreatici multipotenti durante lo sviluppo del pancreas 22 Inoltre, ablazione selettiva di Ngn3 cellule che esprimono di amministrazione di tossina difterica per Ngn3 CreERT;. R26 IDTR topi risultati in contenuto di insulina diminuita e ridotta proliferazione delle cellule beta, soprattutto nei piccoli isolotti. 15
Questi risultati contrastanti potrebbero, almeno in parte, essere attribuito ad una combinazione di fattori, tra variazioni di punti di tempo post-chirurgiche di analisi, peso corporeo, il sesso e l'età dei topi, condizioni fisiologiche e ambientali post-operative e, soprattutto, differenze di tecnica chirurgica. 30 Nelle nostre mani, la proliferazione delle cellule beta, il contenuto di insulina, il volume delle cellule beta e il numero di piccoli isolotti sono costantemente aumentati dopo Pdl. AncheNgn3 mRNA aumenta costantemente, ma ci sono grandi differenze nell'espressione Ngn3 mRNA tra pancreas coda PDL, per i quali non abbiamo alcuna spiegazione diretta. Abbiamo ipotizzato che il livello di mRNA Ngn3 potrebbe correlare con il grado di neogenesi delle cellule beta da cellule non-beta 15, ma questo necessita di ulteriori fondatezza. Anche se non rimuove tutte le varianti sperimentali, un metodo standard per l'esecuzione di un intervento chirurgico PDL consente una migliore uniformità dei risultati e apre nuove strade per lo studio della proliferazione delle cellule beta e neogenesi.
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Protocol
Tutte le operazioni seguono le linee guida emanate dalla Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici (STE 123 e il 2010/63 / UE).
1. Preparazione di area di lavoro
- Fornire una zona di preparazione dedicata, una zona di intervento e una zona di recupero.
- Effettuare l'intera procedura chirurgica in una cappa a flusso laminare per minimizzare contaminanti ambientali.
- Montare le forniture (elencati in Materiali e Metodi) necessari sulla zona di preparazione, chirurgica e di recupero, con una corretta tecnica asettica.
- Assicurarsi che gli strumenti chirurgici sono sterilizzati in autoclave prima dell'intervento.
- Fornire un rilievo di riscaldamento dell'acqua di ricircolo ad una temperatura di 38 ° C per la stabilizzazione della temperatura durante l'intervento chirurgico. Coprire la piastra elettrica con un tampone impermeabile sterile.
- Fornire un microscopio operativo con un ingrandimento di almeno 6.3x.
- Utilizzare un strumento sterilizer, come un tallone sterilizzatrice a caldo, per sterilizzare strumenti tra procedure chirurgiche.
- Preparare una zona di recupero costituito da una grande gabbia, fiancheggiata da biancheria da letto di carta piatta
2. Preparare gli Animali per Chirurgia
- Per Pdl e chirurgia simulata, utilizzare 8 settimane di età topi maschi, alloggiati in gabbie standard e mantenuti su una 12 ore di luce / 12 ore ciclo buio e nutriti un roditore dieta ad libitum standard.
Nota: Qui, usiamo topi BALB / cJrJ ma abbiamo anche utilizzato con successo altri ceppi e vari ceppi transgenici. - Utilizzare Buprenophine come preemptive analgesia (0,05-0,1 mg / kg) 30 minuti prima dell'intervento.
- Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg / kg di ketamina e 5 - 10 mg / kg di xilazina.
- Valutare corretta anestesia osservando graduale perdita di movimenti volontari e rilassamento muscolare. Testare la perdita dei riflessi da pizzicamento punta.
- Applicare una pomata oftalmica a prevsecchezza ent degli occhi mentre sotto anestesia.
3. chirurgico Preparazione del sito
- Disinfettare torace e addome con soluzione di clorexidina antisettica.
- Radere un'area di 2,5 cm x 1,5 cm dell'addome.
- Disinfettare la zona rasata con una garza imbevuta di soluzione di clorexidina, poi soluzione alcolica e una applicazione finale di soluzione di clorexidina.
- Posizionare l'animale nella zona di intervento in modo che il sito chirurgico preparato viene rivolto verso l'alto il chirurgo.
- Passare il mouse utilizzando un telo chirurgico impermeabile con un'apertura che lascia la regione addominale disinfettata esposta mentre copre il resto del corpo per creare un campo di lavoro sterile. Monitorare il mouse prima della procedura di profondità dell'anestesia.
4. Dotto pancreatico legatura
- Laparotomia
- Fare un'incisione mediana superiore nella pelle estende dal processo xifoideo all'ombelico utilizzando una sterilelama chirurgica. Separare il sottostante linea alba e il peritoneo usando forbici sterili al fine di esporre il quadrante addominale superiore.
- Prevenire essiccazione-out degli organi interni per aspersione regolare con sterile allo 0,9% di cloruro di sodio.
- Con una pinzetta sterili o tampone, ritrarre lo stomaco superiormente, esponendo la milza e il lobo milza (la regione coda) del pancreas.
- Retrarre delicatamente duodeno e parte del digiuno superiore al quadrante destro dell'addome superiore per esporre la testa, il collo e la regione di body del pancreas coperte dal peritoneo viscerale.
- Legatura
- Individuare la posizione anatomica del dotto pancreatico principale nella regione del collo del pancreas.
- Incidere il peritoneo viscerale e il legamento gastrocolico, la concessione dell'accesso al retroperitoneo, esponendo la regione del corpo e la coda del pancreas. Al fine di esporre la regione del collo, eseguire una manovra di Kocher. Sollevare il duodeno e testa diil pancreas al largo della retroperitoneo elevandoli dalla vena cava inferiore e l'aorta sotto.
- Posizionare con cura la spatola sotto la regione del collo. Legare il dotto pancreatico con 6-0 Prolene filo sul lato sinistro della vena porta che separa i lobi gastro-duodenale e splenica.
- Eseguire una seconda legatura in prossimità della prima legatura per garantire che i lobi sono adeguatamente separati.
- Legare molto attentamente in modo da non danneggiare i vasi sanguigni sottostanti, cioè l'arteria pancreaticoduodenale superiore, l'arteria pancreaticoduodenale inferiore e la parte pancreatica della arteria splenica.
- Posizionare gli organi nella cavità addominale.
- Chiudere l'incisione con filo filamentosa 4-0 poliglicole in un modello sutura continua per il muscolo / strato peritoneale e in un modello di sutura discontinua per la pelle.
5. Sham Chirurgia
- Eseguire tutti i passi come dedescritto nei passaggi da 1 a 4.1.4. Mentre il pancreas è esposto, non eseguire la legatura del dotto pancreatico.
- Alla fine del punto 4.1.4, posizionare gli organi interni nella cavità addominale.
- Chiudere l'incisione come descritto in 4.2.7.
Cura 6. post-operativa e monitoraggio
- Dopo la procedura chirurgica è completa, posizionare il mouse nella zona di recupero. Questo è costituito da una gabbia collocato su una piastra elettrica e allineato con biancheria carta in orizzontale in modo da mantenere la temperatura corporea normale.
- Fornire supporto nutrizionale per evitare ipoglicemia postoperatoria dal cibo inumidito posto sul fondo della gabbia. A questo scopo, utilizzare pellet roditore dieta standard ammollata in acqua fino a quando si ammorbidiscono.
- Fornire un supporto liquido dal cibo umido e fornire acqua ad libitum.
- Utilizzare Buprenophine come analgesico (0,05-0,1 mg / kg) due volte al giorno per 2 giorni post-operatorio. Durante tutto sperimentale, il follow-up, observe il mouse per comparsa di eventuali segni di infezione, tra cui la secrezione di liquido o pus dalla ferita, o per deterioramento fisico caratterizzato da una riduzione nel governare il comportamento e il livello di attività, più basso appetito e perdita di peso corporeo.
7. Valutazione di successo PDL e Harvest del PDL Tail e Sham coda del pancreas
- Euthanize topi di dislocazione cervicale.
- Re-radere regione addominale per evitare riporto di pelliccia.
- Aprire lo strato di pelle e muscoli addominali e rimuovere una grande area di pelle e muscoli per ottenere un buon accesso al pancreas.
- Usando pinzette sterili o tampone, lo stomaco è retratto superiormente, esponendo la milza e il lobo splenica (regione coda) del pancreas.
- Estrarre delicatamente il duodeno e parte del digiuno superiore per esporre lobo gastro-duodenale (regione della testa) del pancreas.
Nota: La parte legatura del pancreas Pdl ha ora ridotto in termini di dimensioni ed è diventato quasitrasparente in modo che le isole sono visibili come piccoli punti bianchi. La porzione di testa del pancreas è rosa opaco e esocrina distinto lobuli può essere osservato. - Usando forbici sterili, separare la parte di coda legatura del pancreas dalla milza, tagliando lungo la milza. Tagliare perdere il tessuto connettivo che collega la regione di coda del pancreas agli organi interni.
- Tagliare regione coda PDL proprio di fronte alla legatura, escludendo la legatura e il tessuto immediatamente adiacente ad esso dal tessuto raccolto.
- Per isolare il tessuto coda finzione, seguire i passaggi da 7.1 a 7.5. Utilizzando forbici sterili separano la regione coda del pancreas farsa dalla milza tagliando lungo la milza. Isolare la regione di coda tagliando nella regione del collo del pancreas e taglio perdere il tessuto connettivo che collega il pancreas coda agli organi interni
Nota: Sia la coda e regione della testa del pancreas sham sono rosa opaco, per isolare due parti separatamente,tagliare il pancreas nella regione del collo.
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Representative Results
PDL induce atrofia acinare e infiammazione, ma non influenza il peso corporeo e la glicemia
In otto settimane vecchio topi maschi BALB / c, la conduttura di scarico gli enzimi esocrine della coda del pancreas è legatura mentre la testa del organo, che si trova adiacente allo stomaco e del duodeno, rimane inalterata. L'età, il sesso e topi maschi BALB / c peso di pari subiscono chirurgia farsa ricapitolando tutte le fasi di un intervento chirurgico condotto legatura parziale, tranne la legatura del dotto pancreatico. Tessuti di pancreas è stato raccolto 3, 7, 14, 30 giorni dopo l'intervento.
Quando PDL viene eseguita correttamente, i topi appaiono sani e non mostrano una differenza significativa del peso corporeo (Figura 1A) o della glicemia (Figura 1B) rispetto ai topi sham. Tessuto esocrino acinose si perde gradualmente dopo chirurgia PDL (Figura 2A-E), con una conseguente riduzione delle dimensioni e del peso della porzione di legatura del P DL pancreas (figura 3), da qui in poi chiamato coda PDL. Tre giorni dopo Pdl, morfologia del tessuto acinare diventa perturbato e cellule acinose apoptosi (Figura 4) e sono probabilmente inghiottito infiltrandosi CD45 + cellule immunitarie (Figura 5). Al giorno 7 dopo Pdl, molti lobuli acinari sono sostituiti da fibrotico (Figura 6) e nel tessuto adiposo (Figura 2C-E) mentre restanti cellule acinose subiscono acinare-to-duttale metaplasia. Entro il giorno 14 dopo Pdl, quasi tutti acinose lobuli sono privi di cellule acinose (Figura 2A-E) rendendo il pancreas coda PDL appaiono traslucido in modo che le isole diventano visibili a occhio nudo (Figura 3). In coincidenza con l'avvio di acinose apoptosi, un aumento dell'attività ciclo cellulare dell'epitelio duttale si osserva (Figura 7).
PDL induce un incremento di insulina + beta volume cellulare
ontent "> Due settimane dopo Pdl il volume totale delle cellule beta nel Pdl coda è raddoppiato rispetto ai non-legatura coda Sham. il volume delle cellule Beta viene quantificato misurando l'area INS + in 4 sezioni micron, 36 micron a parte che attraversa tutto il tessuto che rappresentano 10% del volume totale del pancreas. PDL induce un aumento nel contenuto di insulina due settimane dopo l'intervento chirurgico rispetto al pancreas non ligato come può essere dimostrato da tutta la tomografia automatizzata -tissue ottico (OPT). 15 Poiché dimensione delle cellule beta non è cambiato dopo PDL l'aumento di volume delle cellule beta è il risultato di un aumento del numero di cellule beta.PDL induce un aumento della proliferazione delle cellule beta e l'attivazione dell'espressione Ngn3
La proliferazione delle cellule Beta è analizzato da immunoistochimica (IHC) colorazione in pancreas raccolto 7 giorni e 14 giorni dopo l'intervento chirurgico Sham o PDL. La percentuale di cellule beta positive per l'indicatore di proliferazione Ki-67 viene quantificato inispezione delle singole cellule in modo non automatizzato. A 7 e 14 giorni dopo l'intervento chirurgico Pdl, la proliferazione delle cellule beta nel PDL coda è significativamente aumentata rispetto al pancreas non ligato.
Entro 3 giorni dopo Pdl l'espressione del marcatore isolotto progenitore embrionale Ngn3 è significativamente aumentata nel PDL coda rispetto al pancreas non ligato. I livelli massimi di Ngn3 trascrizione sono state raggiunte entro 1 settimana e, successivamente, sono diminuiti lentamente. Noi abitualmente misura di attivazione genica Ngn3 esprimendo il livello di Ngn3-codificante mRNA nel pancreas PDL relativi al livello Ngn3 stabile nel duodeno. Abbiamo recentemente suggerito che l'entità della neogenesi in PDL potrebbe dipendere dal livello di attivazione del gene Ngn3. 15,30
Figura 1. PDL non influisce peso corporeo o glicemia. Bodyweight (g) (A) e la glicemia (mg/ DL) (B) da sham (barre bianche) e PDL topi (barre nere) è stata misurata in diversi momenti (giorno 0, 7, 14 e 30) dopo l'intervento e non hanno mostrato alcuna differenza significativa tra finzione e PDL topi operati in qualsiasi punto nel tempo. Figura originariamente pubblicato da Xu et al., 2008. 11. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. PDL porta ad una progressiva perdita di cellule acinari. Variazione morfologica del pancreas coda PDL rivelati da ematossilina-eosina al giorno 3 (B), 7 (C), 14 (D) e 30 (E) post intervento chirurgico, rispetto al pancreas coda sham-operated (A). A 3 giorni dopo legatura, solo una perturbazione sottile tessuto acinoso può essere observed (B). A 7 giorni dopo la legatura, il tessuto acinare è gravemente perturbato e complessi duttale hanno costituito (C). A 14 giorni dopo la legatura, poche cellule acinose rimangono e acinare lobuli sono sostituiti da strutture duttali, una rete e adipociti fibroso (indicati con un asterisco (*) nel pannello C ed E). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .
Figura 3. PDL coda al momento della raccolta. Coda Sham (A) e PDL coda (B) raccolte al giorno 14 post-operatorio. PDL coda è drasticamente ridotto in dimensioni rispetto alla coda Sham. Picture (C) mostra PDL coda al giorno 14 dopo l'intervento in situ. A causa della perdita di cellule acinose, la coda Pdlappare traslucido, il dotto pancreatico principale è chiaramente visibile (indicata con la freccia nera) e isolotti sono visibili come piccoli puntini bianchi (indicato con la freccia bianca). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. PDL induce apoptosi acinare. Immunostaining per spaccati Caspase-3 in PDL coda a 3, 7 e 14 giorni dopo l'intervento chirurgico rivela corpi apoptotici nel vano acinoso in day surgery 3 e il 7 ° giorno dopo, mentre le cellule acinari sono quasi assenti da PDL coda al giorno 14. bar ingrandimento sono 25 micron. Figura originariamente pubblicato da Xu et al., 2008. 11. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
= "Figura 5" src = "/ files / ftp_upload / 52765 / 52765fig5.jpg" />
Figura 5. PDL induce infiltrazione di cellule immunitarie. Immunocolorazione per il CD45 marcatore leucociti, mostra la presenza di un elevato numero di cellule immunitarie in PDL coda 7 giorni dopo l'intervento chirurgico rispetto al pancreas sham. Bar ingrandenti sono 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. PDL induce fibrosi. Immunocolorazione per actina alfa del muscolo liscio mostra la presenza di una rete fibrosa in PDL coda 14 giorni dopo l'intervento chirurgico rispetto al pancreas sham. Bar ingrandenti sono 50 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
"Figura 7" src = "/ files / ftp_upload / 52765 / 52765fig7.jpg" />
Figura 7. PDL induce un aumento della proliferazione delle cellule del condotto. Doppio immunostaining per il marcatore delle cellule del condotto citocheratina 19 (CK19) e per la BrdU marker di proliferazione mostra un aumento dell'attività del ciclo cellulare delle cellule del dotto. Bar ingrandenti sono 25 micron. Figura originariamente pubblicato da Xu et al., 2008. 11. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for preparation area | |||
| Hibiscrub | Regent Medical | 5601IE5F11 | Chlorhexidin diglucon |
| Ketamin | Ceva | BE-V202526 | anesthesia |
| Rompun(2%) (Xylazin) | Bayer | BE-V041815 | anesthesia |
| Duratears | Alcon | 34335-8 | ointment for eyes |
| Razor | |||
| Supplies for surgical area | |||
| Leica Operating microscope | Leica | 10446320 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools (FST) | 18000-45 | |
| autoclaved surgical instruments | Fine Science Tools (FST) | ||
| Recirclulating water heating pad | Gaymar Industries, Inc. | TP702 | |
| Adhesive OP-towel | BARRIER | 706500-07 | |
| OP-tape | BARRIER | 381035-00 | |
| Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) | Lohmann&Rauscher International | 35968 | |
| Mini Plasco 0.9% NaCl solution | B.BRAUN | 3521680 | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 4-0 polyglycol suture | Ethicon | SL-607 | |
| Supplies for recovery area | |||
| Paper bedding (paper towel) | |||
| Vetergesic | ecuPhar | BE-V342955 | |
| Materials for analysis | |||
| Taqman Ngn3 primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.56a.33574796.gs | |
| Taqman CycloA primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.39a.2.gs | |
| anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) | Cell Signaling | 5A1E | |
| anti-mouse/rat Ki-67 antibody | eBioscience | 14-5698-82 | |
| monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) | Sigma | 085K4889 | |
| anti-rat Cytokeratin 19 | DSHB | ||
| monoclonal Mouse anti-BrdU | Dako | M0744 | |
| Hoechst | Sigma | 33342 |
References
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