Blessure chirurgicale au pancréas de souris par ligature du canal pancréatique tant que modèle de endocrines et exocrines Reprogrammation et prolifération

Summary

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Abstract

L'expansion des cellules bêta du pancréas in vivo ou ex vivo, ou la production de cellules bêta par différenciation d'une cellule souche embryonnaire ou adulte, peut fournir de nouvelles sources expansibles de cellules bêta pour atténuer la rareté des donneurs dans la transplantation d'îlots humains en tant que traitement pour le diabète. Bien que les progrès récents ont été accomplis en vue de cet objectif, les mécanismes qui régulent l'expansion des cellules bêta et la différenciation d'une cellule souches / progénitrices restent à être caractérisé. Ici, nous décrivons un protocole pour un modèle de lésion dans le pancréas de souris adulte qui peut fonctionner comme un outil pour étudier les mécanismes de remodelage tissulaire et une prolifération des cellules bêta et la différenciation. Ligature partielle conduit (PDL) est une lésion induite expérimentalement du pancréas de rongeur impliquant la ligature chirurgicale du canal pancréatique principal qui entraîne une obstruction de drainage de produits exocrines hors de la région de la queue du pancréas. Les dommages infligés induit une atrophie acineuse, infilt des cellules immunitairesration et sévère remodelage tissulaire. Nous avons précédemment rapporté l'activation de Neurogenin (NGN) 3 cellules progénitrices exprimant analogue endogènes et une augmentation de la prolifération des cellules bêta après PDL. Par conséquent, PDL fournit une base pour étudier les signaux impliqués dans la dynamique des cellules bêta et les propriétés d'un progéniteur endocrinien dans le pancréas adulte. Depuis, il reste encore largement incertaine, quels sont les facteurs et les voies contribuent à la néogenèse des cellules bêta et la prolifération dans PDL, un protocole standardisé pour PDL permettre une comparaison entre laboratoires.

Introduction

La prévalence croissante du diabète, qui touche plus de 300 millions de personnes ^1,2 à l'échelle mondiale a stimulé la recherche de nouvelles sources de cellules bêta productrices d'insuline, à la fois in vitro et in vivo, pour reconstituer la masse des cellules bêta déficient. ³ Identification clé des mécanismes et des facteurs qui régulent la prolifération des cellules bêta et bêta néogenèse cellulaire, à savoir, la différenciation des cellules bêta à partir d'une cellule ou de cellules progénitrices non-bêta, peuvent fournir de nouvelles cibles pour le développement de thérapies régénératrices dans le diabète.

Dans le pancréas des rongeurs en développement, l'ensemble des types de cellules du système endocrinien différencient à partir d'une population transitoire de cellules endocrines progénitrices exprimant le facteur de transcription Neurogenin3 (Ngn3) ^4,5. Dans le pancréas de rongeur adulte, dans les conditions physiologiques normales, la masse des cellules bêta est maintenu à un nombre optimal pour répondre aux besoins métaboliques. Les variations de taille des cellules bêta,l'apoptose et la réplication constituent les principaux mécanismes d'expansion des cellules bêta et turn-over. ^8.6 Bien que le potentiel des cellules bêta à proliférer dans des conditions physiologiques normales est homogène dans toute la population, ⁹ leur vitesse de prolifération est faible et re-réplication est restreinte par une période dynamique de repos ou la période réfractaire ^6,7, influencé par l'âge et le métabolisme du glucose. ¹⁰ Comme les cellules endocrines précurseurs ont jusqu'à présent pas été identifiés dans le pancréas adulte normal, néogenèse On pense que pas contribuer à la croissance des cellules bêta adulte normal. ⁸

Par conséquent, l'identification d'une cellule progénitrice facultative endocrine du pancréas adulte qui est extensible et capable de produire de nouvelles cellules bêta pourrait fournir une nouvelle, éventuellement source illimitée de cellules bêta.

Partiel ligature du canal (PDL) est un modèle de lésion des animaux qui a été décrit pour induire neogenesi des cellules bêtas dans le pancréas adulte. ^11,12 Dans ce modèle, le canal pancréatique principal drainant la queue du pancréas est ligaturée chirurgicalement. L'obstruction résultant de drainage exocrine induit le remodelage tissulaire importante, accompagnée d'inflammation et acineuses atrophie distale par rapport à la ligature. ^12-14 Dans ce contexte inflammatoire, ré-expression du marqueur endocrine progénitrices Ngn3 est induite et le volume des cellules bêta augmente double . Ce doublement de la bêta résultats du volume de la cellule à partir de la génération de nouvelles cellules bêta à partir d'un Ngn3 exprimant de type embryonnaire cellule endocrinien progénitrices et de la prolifération des cellules bêta pré-existantes et nouvellement formés qui sont sujettes à re-duplication sans "période de repos". ^11,15

Néogenèse des cellules bêta et la réplication dans les modèles de préjudice, tels que pancréatectomie ^6,7,16-19 et l'ablation sélective des cellules bêta ²⁰ ont été largement décrits. Toutefois, le résultat de régénération dans thesmodèles de e est influencée par l'ampleur des dommages infligés et est associé à une version bêta initiale masse cellulaire diminué ^21. PDL est un modèle chirurgical dans lequel la masse initiale des cellules bêta ne soit pas affectée et la néogenèse des cellules bêta et à la prolifération sont solidement activé. En effet, dans le pancréas de souris qui ont subi PDL, les cellules exprimant Ngn3 sont identifiés à proximité de l'épithélium du conduit. Ces cellules peuvent être isolées à partir du pancréas de souris transgéniques ligaturés Ngn3-GFP en utilisant tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et sont capables de se différencier vers les cellules bêta fonctionnelles suivant la prise de greffe et en culture ex vivo du pancréas de Ngn3 E12.5 ^{– / –} . souris ¹¹ De même, dans Ngn3 ^CreERT;. souris R26 ^YFP dans lequel les cellules qui ont activé le gène Ngn3 sont étiquetés de façon permanente après l'injection tamoxifène, les cellules bêta Ngn3 dérivées de cellules étiquette positif est détecté après PDL ¹⁵ outre, les cellules bêta nouvellement formées diluer pré -existing cellules bêta et localiser préférentiellement dans les petits îlots dans lequel les cellules bêta présentent un potentiel de prolifération élevé. ¹⁵ Ngn3 est important pour l'expansion des cellules bêta après PDL depuis diminution de l'expression Ngn3 en utilisant l'ARN court en épingle à cheveux spécifique d'une cible diminue de manière significative la masse des cellules bêta et à la prolifération des cellules bêta après PDL. ¹¹ En particulier, la fraction des cellules bêta dérivés de cellules Ngn3 et la masse des cellules bêta après PDL dépend essentiellement du niveau de Ngn3 induction ^15. Ceci est en accord avec l'observation que de haut niveau d'expression Ngn3 est une étape cruciale pour l'engagement endocrinien à partir de progéniteurs pancréatiques multipotentes pendant le développement pancréatique ²² En outre, l'ablation sélective de Ngn3 cellules exprimant par l'administration diphtérie-toxine Ngn3 ^CreERT;. Souris R26 ^IDTR résultats de la teneur en insuline et une diminution réduit la prolifération des cellules bêta, en particulier dans les petits îlots. ¹⁵

<pclass = "jove_content"> Bien que l'induction de l'expression Ngn3 dans les cellules des canaux après PDL a été confirmée par de nombreux ^{11,15,16,23,24,} expression Ngn3 dans les îlots de cellules ^24,25 et des écarts dans l'issue du PDL a mis nos premières observations de l'augmentation de la masse des cellules bêta ^26,27, l'allure de Ngn3 endocriniens progéniteurs exprimant de conduits dérivés ^24,26,28,29, et l'augmentation de la prolifération des cellules bêta ²⁷ après PDL. ³⁰

Ces résultats contradictoires pourraient, au moins partiellement, être attribués à une combinaison de facteurs, y compris les variations dans les points de temps post-chirurgicales de l'analyse, le poids, le sexe et l'âge des souris, les conditions physiologiques et environnementales post-opératoires et, plus important encore, différences dans la technique chirurgicale. ³⁰ Dans nos mains, la prolifération des cellules bêta, le contenu de l'insuline, le volume des cellules bêta et le nombre de petits îlots sont constamment augmenté après PDL. AussiNgn3 ARNm augmente constamment, mais il ya de grandes différences dans l'expression de l'ARNm Ngn3 entre PDL queue pancréas, pour lequel nous avons aucune explication directe. Nous émettons l'hypothèse que le niveau d'ARNm Ngn3 pourrait corréler avec le degré de néogenèse des cellules bêta à partir de cellules non-bêta ^15, mais il faut d'autres justifications. Bien qu'il ne supprime pas toutes les variations expérimentales, une méthode standardisée pour effectuer la chirurgie PDL permet une meilleure uniformité dans les résultats et ouvre de nouvelles voies dans l'étude de la prolifération des cellules bêta et néogénèse.

Protocol

Toutes les manipulations de suivre les lignes directrices émises par la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d'autres fins scientifiques (STE 123 et et 2010/63 / UE). 1. Préparation de la zone de travail Fournir une aire de préparation dédié, une zone chirurgicale et une zone de récupération. Effectuer la procédure chirurgicale entière dans une hotte à flux laminaire afin de minimiser …

Representative Results

PDL induit une atrophie acineuse et l'inflammation, mais ne modifie pas le poids corporel et la glycémie Dans l'ancienne souris mâles BALB / c de 8 semaines, le conduit de drainage les enzymes exocrines de la queue du pancréas est ligaturé tandis que la tête de l'organe, situé à côté de l'estomac et du duodénum, ​​reste inchangée. Âge, sexe et souris mâles BALB / c de poids appariés subissent une intervention chirurgicale fictive récapitula…

Discussion

In the present study, we describe in detail the methodology behind PDL, a mouse injury model to study beta cell neogenesis and proliferation and transdifferentiation of pancreatic non-beta cells. Ambiguity in data on PDL among labs stimulates the need for a standardized protocol for PDL surgery.

Critical steps in the PDL protocol include the selection of healthy, young mice for surgery. Preferably male mice should be used since unpublished data from our lab suggest that estrogen receptor signa…

Materials

Supplies for preparation area
Hibiscrub	Regent Medical	5601IE5F11	Chlorhexidin diglucon
Ketamin	Ceva	BE-V202526	anesthesia
Rompun(2%) (Xylazin)	Bayer	BE-V041815	anesthesia
Duratears	Alcon	34335-8	ointment for eyes
Razor
Supplies for surgical area
Leica Operating microscope	Leica	10446320
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools (FST)	18000-45
autoclaved surgical instruments	Fine Science Tools (FST)
Recirclulating water heating pad	Gaymar Industries, Inc.	TP702
Adhesive OP-towel	BARRIER	706500-07
OP-tape	BARRIER	381035-00
Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile)	Lohmann&Rauscher International	35968
Mini Plasco 0,9% NaCl solution	B.BRAUN	3521680
6-0 prolene suture	Ethicon	8706H
4-0 polyglycol suture	Ethicon	SL-607
Supplies for recovery area
Paper bedding (paper towel)
Vetergesic	ecuPhar	BE-V342955
Materials for analysis
Taqman Ngn3 primer	Integrated DNA technologies	Mm.PT.56a.33574796.gs
Taqman CycloA primer	Integrated DNA technologies	Mm.PT.39a.2.gs
anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175)	Cell Signaling	5A1E
anti-mouse/rat Ki67 antibody	eBioscience	14-5698-82
monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse)	Sigma	085K4889
anti-rat Cytokeratin 19	DSHB
monoclonal Mouse anti-BrdU	Dako	M0744
Hoechst	Sigma	33342