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Medicine

Blessure chirurgicale au pancréas de souris par ligature du canal pancréatique tant que modèle de endocrines et exocrines Reprogrammation et prolifération

doi: 10.3791/52765 Published: August 7, 2015

Abstract

L'expansion des cellules bêta du pancréas in vivo ou ex vivo, ou la production de cellules bêta par différenciation d'une cellule souche embryonnaire ou adulte, peut fournir de nouvelles sources expansibles de cellules bêta pour atténuer la rareté des donneurs dans la transplantation d'îlots humains en tant que traitement pour le diabète. Bien que les progrès récents ont été accomplis en vue de cet objectif, les mécanismes qui régulent l'expansion des cellules bêta et la différenciation d'une cellule souches / progénitrices restent à être caractérisé. Ici, nous décrivons un protocole pour un modèle de lésion dans le pancréas de souris adulte qui peut fonctionner comme un outil pour étudier les mécanismes de remodelage tissulaire et une prolifération des cellules bêta et la différenciation. Ligature partielle conduit (PDL) est une lésion induite expérimentalement du pancréas de rongeur impliquant la ligature chirurgicale du canal pancréatique principal qui entraîne une obstruction de drainage de produits exocrines hors de la région de la queue du pancréas. Les dommages infligés induit une atrophie acineuse, infilt des cellules immunitairesration et sévère remodelage tissulaire. Nous avons précédemment rapporté l'activation de Neurogenin (NGN) 3 cellules progénitrices exprimant analogue endogènes et une augmentation de la prolifération des cellules bêta après PDL. Par conséquent, PDL fournit une base pour étudier les signaux impliqués dans la dynamique des cellules bêta et les propriétés d'un progéniteur endocrinien dans le pancréas adulte. Depuis, il reste encore largement incertaine, quels sont les facteurs et les voies contribuent à la néogenèse des cellules bêta et la prolifération dans PDL, un protocole standardisé pour PDL permettre une comparaison entre laboratoires.

Introduction

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La prévalence croissante du diabète, qui touche plus de 300 millions de personnes 1,2 à l'échelle mondiale a stimulé la recherche de nouvelles sources de cellules bêta productrices d'insuline, à la fois in vitro et in vivo, pour reconstituer la masse des cellules bêta déficient. 3 Identification clé des mécanismes et des facteurs qui régulent la prolifération des cellules bêta et bêta néogenèse cellulaire, à savoir, la différenciation des cellules bêta à partir d'une cellule ou de cellules progénitrices non-bêta, peuvent fournir de nouvelles cibles pour le développement de thérapies régénératrices dans le diabète.

Dans le pancréas des rongeurs en développement, l'ensemble des types de cellules du système endocrinien différencient à partir d'une population transitoire de cellules endocrines progénitrices exprimant le facteur de transcription Neurogenin3 (Ngn3) 4,5. Dans le pancréas de rongeur adulte, dans les conditions physiologiques normales, la masse des cellules bêta est maintenu à un nombre optimal pour répondre aux besoins métaboliques. Les variations de taille des cellules bêta,l'apoptose et la réplication constituent les principaux mécanismes d'expansion des cellules bêta et turn-over. 8.6 Bien que le potentiel des cellules bêta à proliférer dans des conditions physiologiques normales est homogène dans toute la population, 9 leur vitesse de prolifération est faible et re-réplication est restreinte par une période dynamique de repos ou la période réfractaire 6,7, influencé par l'âge et le métabolisme du glucose. 10 Comme les cellules endocrines précurseurs ont jusqu'à présent pas été identifiés dans le pancréas adulte normal, néogenèse On pense que pas contribuer à la croissance des cellules bêta adulte normal. 8

Par conséquent, l'identification d'une cellule progénitrice facultative endocrine du pancréas adulte qui est extensible et capable de produire de nouvelles cellules bêta pourrait fournir une nouvelle, éventuellement source illimitée de cellules bêta.

Partiel ligature du canal (PDL) est un modèle de lésion des animaux qui a été décrit pour induire neogenesi des cellules bêtas dans le pancréas adulte. 11,12 Dans ce modèle, le canal pancréatique principal drainant la queue du pancréas est ligaturée chirurgicalement. L'obstruction résultant de drainage exocrine induit le remodelage tissulaire importante, accompagnée d'inflammation et acineuses atrophie distale par rapport à la ligature. 12-14 Dans ce contexte inflammatoire, ré-expression du marqueur endocrine progénitrices Ngn3 est induite et le volume des cellules bêta augmente double . Ce doublement de la bêta résultats du volume de la cellule à partir de la génération de nouvelles cellules bêta à partir d'un Ngn3 exprimant de type embryonnaire cellule endocrinien progénitrices et de la prolifération des cellules bêta pré-existantes et nouvellement formés qui sont sujettes à re-duplication sans "période de repos". 11,15

Néogenèse des cellules bêta et la réplication dans les modèles de préjudice, tels que pancréatectomie 6,7,16-19 et l'ablation sélective des cellules bêta 20 ont été largement décrits. Toutefois, le résultat de régénération dans thesmodèles de e est influencée par l'ampleur des dommages infligés et est associé à une version bêta initiale masse cellulaire diminué 21. PDL est un modèle chirurgical dans lequel la masse initiale des cellules bêta ne soit pas affectée et la néogenèse des cellules bêta et à la prolifération sont solidement activé. En effet, dans le pancréas de souris qui ont subi PDL, les cellules exprimant Ngn3 sont identifiés à proximité de l'épithélium du conduit. Ces cellules peuvent être isolées à partir du pancréas de souris transgéniques ligaturés Ngn3-GFP en utilisant tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et sont capables de se différencier vers les cellules bêta fonctionnelles suivant la prise de greffe et en culture ex vivo du pancréas de Ngn3 E12.5 - / - . souris 11 De même, dans Ngn3 CreERT;. souris R26 YFP dans lequel les cellules qui ont activé le gène Ngn3 sont étiquetés de façon permanente après l'injection tamoxifène, les cellules bêta Ngn3 dérivées de cellules étiquette positif est détecté après PDL 15 outre, les cellules bêta nouvellement formées diluer pré -existing cellules bêta et localiser préférentiellement dans les petits îlots dans lequel les cellules bêta présentent un potentiel de prolifération élevé. 15 Ngn3 est important pour l'expansion des cellules bêta après PDL depuis diminution de l'expression Ngn3 en utilisant l'ARN court en épingle à cheveux spécifique d'une cible diminue de manière significative la masse des cellules bêta et à la prolifération des cellules bêta après PDL. 11 En particulier, la fraction des cellules bêta dérivés de cellules Ngn3 et la masse des cellules bêta après PDL dépend essentiellement du niveau de Ngn3 induction 15. Ceci est en accord avec l'observation que de haut niveau d'expression Ngn3 est une étape cruciale pour l'engagement endocrinien à partir de progéniteurs pancréatiques multipotentes pendant le développement pancréatique 22 En outre, l'ablation sélective de Ngn3 cellules exprimant par l'administration diphtérie-toxine Ngn3 CreERT;. Souris R26 IDTR résultats de la teneur en insuline et une diminution réduit la prolifération des cellules bêta, en particulier dans les petits îlots. 15

Ngn3 dans les cellules des canaux après PDL a été confirmée par de nombreux 11,15,16,23,24, expression Ngn3 dans les îlots de cellules 24,25 et des écarts dans l'issue du PDL a mis nos premières observations de l'augmentation de la masse des cellules bêta 26,27, l'allure de Ngn3 endocriniens progéniteurs exprimant de conduits dérivés 24,26,28,29, et l'augmentation de la prolifération des cellules bêta 27 après PDL. 30

Ces résultats contradictoires pourraient, au moins partiellement, être attribués à une combinaison de facteurs, y compris les variations dans les points de temps post-chirurgicales de l'analyse, le poids, le sexe et l'âge des souris, les conditions physiologiques et environnementales post-opératoires et, plus important encore, différences dans la technique chirurgicale. 30 Dans nos mains, la prolifération des cellules bêta, le contenu de l'insuline, le volume des cellules bêta et le nombre de petits îlots sont constamment augmenté après PDL. AussiNgn3 ARNm augmente constamment, mais il ya de grandes différences dans l'expression de l'ARNm Ngn3 entre PDL queue pancréas, pour lequel nous avons aucune explication directe. Nous émettons l'hypothèse que le niveau d'ARNm Ngn3 pourrait corréler avec le degré de néogenèse des cellules bêta à partir de cellules non-bêta 15, mais il faut d'autres justifications. Bien qu'il ne supprime pas toutes les variations expérimentales, une méthode standardisée pour effectuer la chirurgie PDL permet une meilleure uniformité dans les résultats et ouvre de nouvelles voies dans l'étude de la prolifération des cellules bêta et néogénèse.

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Protocol

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Toutes les manipulations de suivre les lignes directrices émises par la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d'autres fins scientifiques (STE 123 et et 2010/63 / UE).

1. Préparation de la zone de travail

  1. Fournir une aire de préparation dédié, une zone chirurgicale et une zone de récupération.
  2. Effectuer la procédure chirurgicale entière dans une hotte à flux laminaire afin de minimiser les contaminants environnementaux.
  3. Assemblez les fournitures (comme indiqué dans Matériels et Méthodes) nécessaires sur la zone de préparation, chirurgicale et la récupération, utilisant une technique aseptique appropriée.
  4. Veiller à ce que les outils chirurgicaux sont passés à l'autoclave avant la chirurgie.
  5. Fournir un tampon de chauffage de l'eau de recirculation à une température de 38 ° C pour la stabilisation de la température au cours de la chirurgie. Couvrir le coussin chauffant avec un tampon étanche stérile.
  6. Fournir un microscope opératoire avec un grossissement d'au moins 6,3x.
  7. Utilisez un steri d'instrumentslizer, comme un stérilisateur à billes à chaud, pour stériliser les instruments entre les procédures chirurgicales.
  8. Préparer une zone de récupération composé d'une grande cage, bordée par la literie plat de papier

2. Préparation des animaux destinés à la Chirurgie

  1. Pour PDL et une intervention chirurgicale fictive, utiliser huit semaines vieilles souris mâles, logés dans des cages standard et entretenus sur une / 12 h cycle d'obscurité de 12 heures de lumière et nourris ad libitum un régime standard pour rongeurs.
    Remarque: Ici, nous utilisons des souris BALB / cJrJ mais nous avons également utilisé avec succès d'autres souches et diverses souches transgéniques.
  2. Utilisation en tant que buprénorphine analgésie préventive (0,05 à 0,1 mg / kg) 30 minutes avant l'intervention chirurgicale.
  3. Anesthésier les souris par injection intraperitoneale de 100 mg / kg de kétamine et de 5 à 10 mg / kg de xylazine.
  4. Évaluer anesthésie appropriée en observant la perte progressive du mouvement volontaire et la relaxation musculaire. Testez la perte de réflexes en orteil pincement.
  5. Appliquer une pommade ophtalmique prevent sécheresse des yeux sous anesthésie.

3. Préparation du site opératoire

  1. Désinfecter thorax et l'abdomen avec une solution de chlorhexidine antiseptique.
  2. Rasez une superficie de 2,5 cm x 1,5 cm de l'abdomen.
  3. Désinfectez la zone rasée en utilisant la gaze imbibée de solution de chlorhexidine, puis une solution d'alcool et une application final de la solution de chlorhexidine.
  4. Placer l'animal dans la zone chirurgicale de sorte que le site chirurgical vers le haut est disposé en face du chirurgien.
  5. Drapé de la souris à l'aide d'un drap chirurgical étanche avec une ouverture qui laisse la région abdominale désinfecté exposé tout en recouvrant le reste du corps pour créer un champ de travail stérile. Surveiller la souris avant la procédure pour la profondeur de l'anesthésie.

4. pancréatique ligature du canal

  1. Laparotomie
    1. Faire une incision médiane supérieure dans la peau étendant à partir de la pointe du sternum à l'ombilic en utilisant un stérilelame chirurgicale. Séparer la ligne blanche sous-jacente et le péritoine aide de ciseaux stériles afin d'exposer le quadrant supérieure de l'abdomen.
    2. Éviter le dessèchement des organes internes par aspersion régulière avec du chlorure de sodium stérile à 0,9%.
    3. En utilisant des pinces stériles ou écouvillon, rentrer le ventre en haut, exposant la rate et le lobe splénique (la région de la queue) du pancréas.
    4. Rétracter doucement le duodénum et du jéjunum partie supérieure dans le quadrant supérieur droit abdominale pour exposer la tête, du cou et de la région du corps du pancréas couverts par le péritoine viscéral.
  2. Ligature
    1. Localiser la position anatomique de la conduite principale du pancréas dans la région du cou du pancréas.
    2. Inciser le péritoine viscéral et le ligament gastro-colique, accorder l'accès à la rétropéritoine, l'exposition de la région de corps et la queue du pancréas. Afin d'exposer la région du cou, effectuer une manœuvre de Kocher. Soulevez le duodénum et la tête dele pancréas large de la rétropéritoine les élevant à partir de la veine cave inférieure et de l'aorte ci-dessous.
    3. Placez délicatement la spatule sous la région du cou. Ligaturer le canal pancréatique avec 6-0 fil Prolene sur le côté gauche de la veine porte qui sépare les lobes gastro-duodénaux et de la rate.
    4. Effectuer une deuxième ligature à proximité immédiate de la première ligation pour assurer que les lobes soient suffisamment séparés.
    5. Ligaturer très soigneusement afin de ne pas endommager les vaisseaux sanguins sous-jacents, à savoir l'artère pancréaticoduodénale supérieure, l'artère pancréaticoduodénale inférieure et la partie du pancréas de l'artère splénique.
    6. Placez les organes dans la cavité abdominale.
    7. Fermer l'incision en utilisant 4-0 polyglycol fil filamenteux dans un modèle de suture continue pour le muscle / couche péritonéale et dans un modèle de suture discontinue pour la peau.

5. Chirurgie Sham

  1. Effectuez toutes les étapes que dedécrit dans les étapes 1 à 4.1.4. Alors que le pancréas est exposé, ne pas effectuer la ligature du canal pancréatique.
  2. À la fin de l'étape 4.1.4, placer les organes internes dans la cavité abdominale.
  3. Fermer l'incision comme décrit dans 4.2.7.

6. Soins post-opérationnelle et surveillance

  1. Après l'intervention chirurgicale est terminée, placer la souris dans la zone de récupération. Cela consiste en une cage placée sur un coussin chauffant et bordée plat literie de papier afin de maintenir la température normale du corps.
  2. Fournir un soutien nutritionnel pour éviter l'hypoglycémie post-opératoire par la nourriture humide placé sur le fond de la cage. A cet effet, utilisez des pastilles de régime standard pour rongeurs trempées dans l'eau jusqu'à ce qu'ils ramollissent.
  3. Fournir un soutien fluide par la nourriture humide et de fournir de l'eau ad libitum.
  4. Utilisez buprénorphine analgésie (0,05 à 0,1 mg / kg) deux fois par jour pendant 2 jours post-chirurgie. Pendant toute la durée expérimentale, suivi, observe la souris pour apparition de signes possibles d'infection, y compris la sécrétion de liquide ou de pus de la plaie ou de la détérioration physique caractérisé par une réduction dans le comportement et le niveau d'activité de toilettage, faible appétit et la perte de poids corporel.

7. L'évaluation réussie de PDL et de récolte des PDL Tail et Sham queue du pancréas

  1. Euthanasier les souris par dislocation cervicale.
  2. Re-raser la région abdominale pour éviter report de la fourrure.
  3. Ouvrez la couche de la peau et des muscles abdominaux et supprimer une grande surface de la peau et des muscles pour obtenir un bon accès au pancréas.
  4. En utilisant des pinces stériles ou coton-tige, l'estomac est rétracté supérieurement, l'exposition de la rate et le lobe splénique (la région de la queue) du pancréas.
  5. Tirez doucement sur le duodénum et du jéjunum partie supérieure pour exposer le lobe de gastro-duodénale (région de la tête) du pancréas.
    Remarque: La partie ligaturé du pancréas PDL a maintenant réduit en taille et en est devenu presquetranslucide de telle sorte que les îlots sont visibles sous forme de petits points blancs. La partie de tête du pancréas est rose opaque et exocrine distincte lobules peut être observée.
  6. Avec des ciseaux stériles, séparer la partie arrière ligaturé du pancréas de la rate, en coupant le long de la rate. Couper le tissu conjonctif lâche reliant la région de la queue du pancréas à des organes internes.
  7. Couper la région de la queue PDL juste en face de la ligature, à l'exclusion de la ligature et le tissu immédiatement adjacent à elle à partir du tissu récolté.
  8. Pour isoler le tissu de queue imposture, suivez les étapes 7.1 à 7.5. L'aide de ciseaux stériles séparent la région de la queue du pancréas simulacre de la rate en coupant le long de la rate. Isoler la zone de queue en coupant dans la région du cou du pancréas et coupe le tissu conjonctif lâche reliant la queue du pancréas aux organes internes
    Remarque: Les deux la queue et la région de la tête du pancréas fictives sont rose opaque, pour isoler les deux parties séparément,couper le pancréas dans la région du cou.

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Representative Results

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PDL induit une atrophie acineuse et l'inflammation, mais ne modifie pas le poids corporel et la glycémie

Dans l'ancienne souris mâles BALB / c de 8 semaines, le conduit de drainage les enzymes exocrines de la queue du pancréas est ligaturé tandis que la tête de l'organe, situé à côté de l'estomac et du duodénum, ​​reste inchangée. Âge, sexe et souris mâles BALB / c de poids appariés subissent une intervention chirurgicale fictive récapitulant toutes les étapes de la chirurgie conduit de ligature partielle, sauf la ligature du canal pancréatique. tissus du pancréas a été récolté 3, 7, 14, 30 jours post-chirurgie.

Lorsque PDL est effectuée correctement, les souris semblent en bonne santé et ne montrent pas de différence significative du poids corporel (figure 1A) ou la glycémie (figure 1B) par rapport à des souris opérés de manière fictive. Tissu exocrine acineuses est perdue progressivement après la chirurgie PDL (Figure 2A-F), ce qui entraîne une réduction de la taille et du poids de la partie P de la ligaturé DL pancréas (Figure 3), à partir de maintenant appelé queue PDL. Trois jours après la PDL, la morphologie du tissu acinaire est perturbé et les cellules acineuses subir l'apoptose (Figure 4) et sont susceptibles englouti par infiltration CD45 + cellules immunitaires (Figure 5). Au jour 7 après la PDL, de nombreux lobules acineuses sont remplacés par fibrotique (figure 6) et le tissu adipeux (Figure 2C-E) tandis que les cellules acineuses restantes subissent acineuses-à-canalaire métaplasie. Au jour 14 après PDL, presque tous acinaire lobules sont dépourvus de cellules acineuses (Figure 2A-E) Réalisation de la queue du pancréas PDL apparaissent translucides sorte que îlots deviennent visibles à l'œil nu (Figure 3). En même temps que l'initiation de l'apoptose des cellules acineuses, on observe une augmentation de l'activité du cycle cellulaire de l'épithélium canalaire (Figure 7).

PDL induit une augmentation de l'insuline + volume de la cellule bêta

ontenu "> Deux semaines après PDL du volume total des cellules bêta dans PDL queue a doublé par rapport aux non-ligaturé queue de Sham. volume des cellules bêta est quantifiée en mesurant la zone INS + en quatre sections um, 36 um à part couvrant l'ensemble du tissu représente 10% du volume du pancréas totale. PDL induit une augmentation de la teneur en insuline de deux semaines après la chirurgie par rapport au pancréas non ligaturé comme pouvant être représenté par tomographie automatisée ensemble -Tissu optique (OPT). 15 Étant donné que la taille des cellules bêta n'a pas changé après PDL l'augmentation du volume des cellules bêta est le résultat d'une augmentation du nombre des cellules bêta.

PDL induit une augmentation de la prolifération des cellules bêta et l'activation de l'expression Ngn3

La prolifération des cellules bêta est analysée par immunohistochimie (IHC) coloration en pancréas récolté 7 jours et 14 jours après la chirurgie Sham ou PDL. Le pourcentage de cellules positives pour les bêta marqueur de prolifération Ki-67 est quantifiée par eninspection de cellules individuelles d'une manière non automatisée. A 7 et 14 jours après la chirurgie PDL, la prolifération des cellules bêta dans PDL queue est considérablement augmenté par rapport à pancréas non-ligaturé.

Dans les 3 jours après PDL l'expression du marqueur embryonnaire îlot progénitrices Ngn3 est significativement augmentée dans PDL queue par rapport au pancréas non ligaturé. Les niveaux maximaux de transcription Ngn3 ont été atteints dans 1 semaine et ensuite diminué lentement. On mesure habituellement l'activation du gène Ngn3 en exprimant le niveau de Ngn3 ARNm codant PDL dans le pancréas par rapport au niveau Ngn3 stable dans le duodénum. Nous avons récemment suggéré que l'étendue de la néogenèse dans PDL pourrait dépendre du niveau d'activation de gène Ngn3. 15,30

Figure 1
Figure 1. PDL n'a aucune incidence sur le poids corporel ou la glycémie. Poids corporel (g) (A) et la glycémie (mg/ DL) (B) (barres blanches opérés de manière fictive) et PDL souris (barres noires) a été mesurée à des moments différents (jour 0, 7, 14 et 30) après la chirurgie et ne montrent pas de différence significative entre imposture et PDL souris exploités à tout point dans le temps. Figure initialement publié par Xu et al., 2008. 11. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. PDL conduit à une perte progressive des cellules acineuses. Changement morphologique du PDL queue du pancréas révélées par hématoxyline-éosine au jour 3 (B), 7 (C), 14 (D) et 30 (E) après la chirurgie, par rapport à opération fictive queue du pancréas (A). A 3 jours après ligature, seulement une perturbation subtile du tissu acineux peut être observed (B). 7 jours après la ligature, tissu acineux est fortement perturbé et complexes canalaires ont formé (C). 14 jours après la ligature, quelques cellules acineuses demeurent et acinaire lobules sont remplacés par des structures canalaires, un réseau et adipocytes fibreuse (indiqués par un astérisque (*) dans le panneau C et E). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .

Figure 3
Figure 3. PDL queue à la récolte. De queue Sham (A) et PDL queue (B) récolté à 14 jours post-chirurgie. PDL queue est considérablement réduite en taille par rapport à la queue Sham. Photo (C) montre PDL queue à la chirurgie jour 14 post in situ. En raison de la perte des cellules acineuses, la queue PDLapparaît translucide, le canal pancréatique principal est clairement visible (indiqué par la flèche noire) et les îlots sont visibles sous forme de petits points blancs (indiqué par la flèche blanche). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4. PDL induit l'apoptose des cellules acineuses. Immunocoloration pour clivée-caspase 3 dans PDL queue à 3, 7 et 14 jours post-chirurgie révèle corps apoptotiques dans le compartiment acinaire au jour 3 et le jour 7 après la chirurgie, tandis que les cellules acineuses sont presque absents de PDL queue au jour 14. barres de grossissement sont 25 um. Figure initialement publié par Xu et al., 2008. 11. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5. PDL induit l'infiltration de cellules immunitaires. Immunocoloration pour le CD45 de marqueur de leucocytes, montrant la présence d'un nombre élevé de cellules immunitaires dans PDL queue 7 jours après la chirurgie par rapport à pancréas imposture. barres de grossissement sont 50 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. PDL induit une fibrose. Immunocoloration pour l'actine alpha de muscle lisse montre la présence d'un réseau fibreux dans PDL queue 14 jours après la chirurgie par rapport à pancréas imposture. barres de grossissement sont 50 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 7. PDL induit une augmentation de la prolifération des cellules de la gaine. Double immunocoloration pour le marqueur de cellules de canal cytokératine 19 (CK19) et de la BrdU marqueur de prolifération montre une augmentation de l'activité du cycle cellulaire des cellules des canaux. barres d'agrandissement sont de 25 um. Figure initialement publié par Xu et al., 2008. 11. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies for preparation area 
Hibiscrub  Regent Medical 5601IE5F11 Chlorhexidin diglucon
Ketamin Ceva BE-V202526 anesthesia
Rompun(2%) (Xylazin) Bayer BE-V041815 anesthesia
Duratears Alcon 34335-8 ointment for eyes
Razor
Supplies for surgical area 
Leica Operating microscope Leica 10446320
Hot bead sterilizer Fine Science Tools (FST) 18000-45
autoclaved surgical instruments Fine Science Tools (FST)
Recirclulating water heating pad Gaymar Industries, Inc. TP702
Adhesive OP-towel BARRIER 706500-07
OP-tape BARRIER 381035-00
Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) Lohmann&Rauscher International 35968
Mini Plasco 0.9% NaCl solution B.BRAUN 3521680
6-0 prolene suture Ethicon 8706H
4-0 polyglycol suture Ethicon SL-607
Supplies for recovery area
Paper bedding (paper towel)
Vetergesic ecuPhar BE-V342955
Materials for analysis
Taqman Ngn3 primer Integrated DNA technologies Mm.PT.56a.33574796.gs
Taqman CycloA primer Integrated DNA technologies Mm.PT.39a.2.gs
anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) Cell Signaling 5A1E
anti-mouse/rat Ki-67 antibody eBioscience 14-5698-82
monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) Sigma 085K4889
anti-rat Cytokeratin 19  DSHB
monoclonal Mouse anti-BrdU Dako M0744
Hoechst Sigma 33342

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References

  1. Shaw, J. E., Sicree, R. A. Global estimates of the prevalence of diabetes for. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
  2. Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2·7 million participants. Lancet. 378, 31-40 (2011).
  3. Borowiak, M., Melton, D. A. How to make beta cells. Current opinion in Cell Biology. 21, 727-732 (2009).
  4. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 1607-1611 (2000).
  5. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, 2447-2457 (2002).
  6. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429, 41-46 (2004).
  7. Teta, M., Rankin, M. M., Long, S. Y., Stein, G. M., Kushner, J. A. Growth and regeneration of adult beta cells does not involve specialized progenitors. Dev Cell. 12, 817-826 (2007).
  8. Bonner-Weir, S. Perspective: Postnatal pancreatic beta cell growth. Endocrinology. 141, 1926-1929 (2000).
  9. Brennand, K., Huangfu, D., Melton, D. All beta cells contribute equally to islet growth and maintenance. PLoS Biol. 5, e163 (2007).
  10. Salpeter, S. J., Klein, A. M., Huangfu, D., Grimsby, J., Dor, Y. Glucose and aging control the quiescence period that follows pancreatic beta cell replication. Development. 137, 3205-3213 (2010).
  11. Xu, X., et al. Beta cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse pancreas. Cell. 132, 197-207 (2008).
  12. Wang, R. N., Kloppel, G., Bouwens, L. Duct- to islet-cell differentiation and islet growth in the pancreas of duct-ligated adult rats. Diabetologia. 38, 1405-1411 (1995).
  13. Yasuda, H., et al. Cytokine expression and induction of acinar cell apoptosis after pancreatic duct ligation in mice. Journal of interferon, & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 19, 637-644 (1999).
  14. Van Gassen, N., et al. Macrophage dynamics are regulated by local macrophage proliferation and monocyte recruitment in injured pancreas. European journal of immunology. (2015).
  15. Van de Casteele, M., et al. Neurogenin 3+ cells contribute to beta-cell neogenesis and proliferation in injured adult mouse pancreas. Cell Death Dis. 4, e523 (2013).
  16. Xiao, X., et al. No evidence for beta cell neogenesis in murine adult pancreas. The Journal of clinical investigation. 123, 2207-2217 (2013).
  17. Ackermann Misfeldt, A., Costa, R. H., Gannon, M. Beta-cell proliferation, but not neogenesis, following 60% partial pancreatectomy is impaired in the absence of FoxM1. Diabetes. 57, 3069-3077 (2008).
  18. Lee, C. S., De Leon, D. D., Kaestner, K. H., Stoffers, D. A. Regeneration of pancreatic islets after partial pancreatectomy in mice does not involve the reactivation of neurogenin-3. Diabetes. 55, 269-272 (2006).
  19. Bonner-Weir, S., Sharma, A. Pancreatic stem cells. The Journal of pathology. 197, 519-526 (2002).
  20. Nir, T., Melton, D. A., Dor, Y. Recovery from diabetes in mice by beta cell regeneration. The Journal of clinical investigation. 117, 2553-2561 (2007).
  21. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85, 1255-1270 (2005).
  22. Wang, S., et al. Neurog3 gene dosage regulates allocation of endocrine and exocrine cell fates in the developing mouse pancreas. Developmental biology. 339, 26-37 (2010).
  23. Pan, F. C., et al. Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration. Development. 140, 751-764 (2013).
  24. Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
  25. Wang, S., et al. Sustained Neurog3 expression in hormone-expressing islet cells is required for endocrine maturation and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9715-9720 (2009).
  26. Kopinke, D., et al. Lineage tracing reveals the dynamic contribution of Hes1+ cells to the developing and adult pancreas. Development. 138, 431-441 (2011).
  27. Rankin, M. M., et al. beta-Cells are not generated in pancreatic duct ligation-induced injury in adult mice. Diabetes. 62, 1634-1645 (2013).
  28. Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
  29. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43, 34-41 (2011).
  30. Van de Casteele, M., et al. Partial duct ligation: beta-cell proliferation and beyond. Diabetes. 63, 2567-2577 (2014).
  31. Zhang, J., Rouse, R. L. Histopathology and pathogenesis of caerulein-, duct ligation-, and arginine-induced acute pancreatitis in Sprague-Dawley rats and C57BL6 mice. Histology and histopathology. 29, 1135-1152 (2014).
  32. Martinez-Romero, C., et al. The epigenetic regulators Bmi1 and Ring1B are differentially regulated in pancreatitis and pancreatic ductal adenocarcinoma. The Journal of pathology. 219, 205-213 (2009).
  33. Prevot, P. P., et al. Role of the ductal transcription factors HNF6 and Sox9 in pancreatic acinar-to-ductal metaplasia. Gut. 61, 1723-1732 (2012).
Blessure chirurgicale au pancréas de souris par ligature du canal pancréatique tant que modèle de endocrines et exocrines Reprogrammation et prolifération
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De Groef, S., Leuckx, G., Van Gassen, N., Staels, W., Cai, Y., Yuchi, Y., Coppens, V., De Leu, N., Heremans, Y., Baeyens, L., Van de Casteele, M., Heimberg, H. Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation. J. Vis. Exp. (102), e52765, doi:10.3791/52765 (2015).More

De Groef, S., Leuckx, G., Van Gassen, N., Staels, W., Cai, Y., Yuchi, Y., Coppens, V., De Leu, N., Heremans, Y., Baeyens, L., Van de Casteele, M., Heimberg, H. Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation. J. Vis. Exp. (102), e52765, doi:10.3791/52765 (2015).

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