This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.
התרחבות של תאים בטא בלבלב in vivo או vivo לשעבר, או דור של תאי הבטא בבידול מתאי גזע עובריים או מבוגר, יכולה לספק מקורות להרחבה חדשים של תאי הבטא כדי להקל על המחסור בתורמי השתלת איון אדם כטיפול בסוכרת. למרות התקדמות שחלה באחרונה נעשתה לקראת מטרה זו, מנגנונים המווסתים את ההרחבה בטא תא והתמיינות של תאי גזע מ/ אב יישארו להתאפיין. כאן, אנו מתארים פרוטוקול למודל פציעה בלבלב העכבר הבוגר שיכול לתפקד ככלי ללימוד מנגנונים של שיפוץ רקמות והתפשטות תאי הבטא ובידול. קשירת צינור חלקית (PDL) היא פגיעה הנגרמת בניסוי של לבלב המכרסמים הכרוך בקשירה כירורגית של צינור הלבלב הראשי וכתוצאה מכך חסימה של ניקוז של מוצרים אקסוקרינית מהאזור הזנב של הלבלב. הנזקים הנגרמים גורם ניוון acinar, infilt תא החיסוןמנה ושיפוץ רקמות קשה. יש לנו שדווחו בעבר ההפעלה של Neurogenin (NGN) 3 לבטא בתאים כמו אב-אנדוגני ועלייה בהתפשטות תאים בטא לאחר PDL. לכן, PDL מספק בסיס ללמוד אותות מעורבים בדינמיקה של תאי הבטא ואת המאפיינים של אב האנדוקרינית בלבלב מבוגר. מאז, הוא עדיין נשאר במידה רבה לא ברור, שגורמים ומסלולים לתרום לNeoGenesis תאי הבטא ושגשוג בPDL, פרוטוקול סטנדרטי לPDL יאפשר להשוואה בכל מעבדות.
השכיחות הגוברת של סוכרת, המשפיעה על יותר מ -300 מיליון בני אדם ברחבי העולם 1,2 יש להגדיל את החיפוש אחר המקורות חדשים של תאי הבטא המייצר אינסולין, הן במבחנה in vivo, כדי לחדש את מסת התאים בטא הלקויה. 3 זיהוי מפתח מנגנונים וגורמים המווסתים את ההתפשטות בטא תא והתא NeoGenesis בטא, כלומר, ההתמיינות של תאי הבטא מתא סלולארי או אב שאינו בטא, יכולים לספק מטרות רומן לפיתוח טיפולי משובי בסוכרת.
בלבלב המכרסמים הפיתוח, כל סוגי התאים האנדוקרינית להבדיל מאוכלוסייה חולפת של תאים האנדוקרינית, המבטאת את גורם השעתוק Neurogenin3 (Ngn3). 4,5 בלבלב המכרסמים המבוגרים, בתנאים פיסיולוגיים נורמלים, מסת התאים בטא היא שמרו על מספר אופטימלי כדי לעמוד בדרישות מטבולים. שינויים בגודל תא בטא,אפופטוזיס והשכפול מהווים מנגנונים העיקריים להתרחבות של תאי הבטא ולהפוך-על. 6-8 בעוד שהפוטנציאל של תאי הבטא להתרבות בתנאים פיסיולוגיים נורמלים הוא הומוגני בכל האוכלוסייה, 9 שיעור הריבוי שלהם הוא נמוך ומחדש שכפול מוגבל על ידי תקופה דינמית קפאון או תקופה עקשן 6,7, הושפעה גיל וחילוף חומרים של הגלוקוז. 10 מאז ותאים האנדוקרינית עד כה לא זוהו בלבלב המבוגר הנורמלי, הוא חשב NeoGenesis לא לתרום לצמיחה של תאי הבטא מבוגרים נורמלים. 8
לכן, זיהוי של תא אב האנדוקרינית פקולטטיביים בלבלב המבוגר שניתן להרחבה ומסוגלת מניב תאי הבטא חדשים יספק רומן, אולי מקור בלתי מוגבל של תאי הבטא.
קשירת צינור חלקית (PDL) היא מודל פציעת חיה שתואר לגרום neogenesi תא בטאים בלבלב המבוגר. 11,12 במודל זה, צינור הלבלב הראשי ניקוז זנב הלבלב הוא ligated בניתוח. החסימה של ניקוז אקסוקרינית וכתוצאה מכך גורמת לשיפוץ רקמות גדול, מלווה בדלקת וניוון דיסטלי לקשירת acinar. 12-14 בסביבה דלקתית זה, מחדש ביטוי של סמן האב האנדוקרינית Ngn3 מושרה ותאי הבטא הנפח מגדיל כפול . הכפלה זו בתוצאות נפח התא בטא מהדור של תאי הבטא חדשים מNgn3 להביע תא אב האנדוקרינית עוברי-סוג ומהתפשטות של תאי הבטא קיימים מראש ויצרו זה עתה שנוטים מחדש שכפול ללא "תקופת קפאון". 11,15
NeoGenesis Beta תא ושכפול בדגמי פציעה, כגון לבלב 6,7,16-19 ואבלציה סלקטיבית של תאי הבטא 20 תוארו בהרחבה. עם זאת, תוצאת משובי בthesמודלים דואר מושפעים מהיקף הנזקים הנגרמים והיא קשורה עם מסת תאים בטא ראשוני ירדה 21. PDL הוא מודל ניתוחי שבי מסת התאים בטא הראשונית אינה מושפעת וNeoGenesis תאי הבטא והתפשטות מופעלים חסונה. ואכן, בלבלב של עכברים שעברו PDL, תאים לבטא Ngn3 מזוהים ליד בטנת אפיתל של הצינור. יכולים להיות מבודדים תאים אלה מלבלב ligated של עכברים הטרנסגניים Ngn3-GFP באמצעות תא הקרינה מיון מופעל (FACS) והם מסוגלים להבחין כלפי תאים בטא פונקציונליים הבא engraftment ולתרבות לשעבר vivo של הלבלב של E12.5 Ngn3 – / – . עכברים 11 באופן דומה, בNgn3 CreERT;. עכברי R26 YFP שבו תאים שהפעילו את גן Ngn3 מסומנים באופן קבוע לאחר הזרקת טמוקסיפן, תאי הביתא תווית חיובית Ngn3 תאים שמקורם מזוהים לאחר PDL 15 יתר על כן, תאי הבטא חדש שנוצרו לדלל מראש -existing תאי הבטא ומעדיף לאתר באיים קטנים שבתוכו תאים בטא להראות פוטנציאל התפשטות גבוה. 15 Ngn3 חשוב לתאי הבטא התרחבות לאחר PDL מאז ירד ביטוי Ngn3 באמצעות היעד ספציפי RNA קצר-הסיכה יורד מסת תאים בטא והתפשטות תאים בטא לאחר באופן משמעותי PDL. 11 יש לציין, את החלק היחסי של תאי הבטא תאים שמקורם Ngn3 ומסת התאים בטא לאחר PDL ביקורתי תלויים ברמה של האינדוקציה Ngn3 15. זה בהתאם לתצפית שרמה הגבוהה של ביטוי Ngn3 היא שלב קריטי למחויבות האנדוקרינית מאבות לבלב multipotent במהלך פיתוח לבלב 22 בנוסף, אבלציה סלקטיבית של Ngn3 לבטא בתאים על ידי ממשל דיפטריה-רעל לNgn3 CreERT;. עכברי R26 iDTR תוצאות בתוכן ירד אינסולין והתפשטות תאי הבטא מופחת, במיוחד באיים קטנים. 15
<pclass = "jove_content"> למרות האינדוקציה של ביטוי Ngn3 בתאי צינור לאחר PDL אושרה על ידי רבים 11,15,16,23,24, ביטוי Ngn3 בתאי איים 24,25 ופערים בתוצאה של PDL תיגר התצפיות הראשוניות שלנו מסה של תאי הבטא גדל 26,27, מראה של Ngn3 להביע אבות-נגזר צינור האנדוקרינית 24,26,28,29, וחלוקה של תאי הבטא עלה 27 לאחר PDL. 30תוצאות הסותרות אלה יכולים, לפחות באופן חלקי, יש לייחס לשילוב של גורמים, כוללים שינויים בנקודות הזמן לאחר הניתוח של ניתוח, משקל גוף, מין וגיל של העכברים, תנאים פיסיולוגיים וסביבתיים שלאחר ניתוח, והכי חשוב, הבדלים בטכניקה ניתוחית. 30 בידיים שלנו, התפשטות בטא תא, תוכן אינסולין, בטא נפח תא ומספר האיים קטנים גדלו באופן עקבי אחרי PDL. כמו כןNgn3 mRNA מגדיל באופן עקבי, אבל יש הבדלים גדולים בביטוי Ngn3 mRNA בין לבלב זנב PDL, שאין לנו הסבר ישיר. חוקרים שערנו כי רמת Ngn3 mRNA עשויה לתאם עם התואר של NeoGenesis תאי הבטא מהתאים שאינם בטא 15, אבל זה צריך הוכחה נוספת. למרות שזה לא להסיר את כל וריאציות הניסיוניות, שיטה סטנדרטית לביצוע ניתוחי PDL מאפשרת לאחידות טובה יותר בתוצאות ופותחת אפיקים חדשים בלימוד התפשטות תאי הבטא וNeoGenesis.
In the present study, we describe in detail the methodology behind PDL, a mouse injury model to study beta cell neogenesis and proliferation and transdifferentiation of pancreatic non-beta cells. Ambiguity in data on PDL among labs stimulates the need for a standardized protocol for PDL surgery.
Critical steps in the PDL protocol include the selection of healthy, young mice for surgery. Preferably male mice should be used since unpublished data from our lab suggest that estrogen receptor signa…
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge all colleagues who made this work possible; Ann Demarré, Veerle Laurysens, Jan De Jonge and Erik Quartier for technical assistance. Financial support was from the VUB Research Council, the Institute for the Promotion of Innovation by Science and Technology in Flanders (IWT), the Beta Cell Biology Consortium (BCBC), the Fund for Scientific Research Flanders (FWO), Diabetes Onderzoek Nederland (DON) and Interuniversity Attraction Pole (IAP).
Supplies for preparation area | |||
Hibiscrub | Regent Medical | 5601IE5F11 | Chlorhexidin diglucon |
Ketamin | Ceva | BE-V202526 | anesthesia |
Rompun(2%) (Xylazin) | Bayer | BE-V041815 | anesthesia |
Duratears | Alcon | 34335-8 | ointment for eyes |
Razor | |||
Supplies for surgical area | |||
Leica Operating microscope | Leica | 10446320 | |
Hot bead sterilizer | Fine Science Tools (FST) | 18000-45 | |
autoclaved surgical instruments | Fine Science Tools (FST) | ||
Recirclulating water heating pad | Gaymar Industries, Inc. | TP702 | |
Adhesive OP-towel | BARRIER | 706500-07 | |
OP-tape | BARRIER | 381035-00 | |
Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) | Lohmann&Rauscher International | 35968 | |
Mini Plasco 0,9% NaCl solution | B.BRAUN | 3521680 | |
6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
4-0 polyglycol suture | Ethicon | SL-607 | |
Supplies for recovery area | |||
Paper bedding (paper towel) | |||
Vetergesic | ecuPhar | BE-V342955 | |
Materials for analysis | |||
Taqman Ngn3 primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.56a.33574796.gs | |
Taqman CycloA primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.39a.2.gs | |
anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) | Cell Signaling | 5A1E | |
anti-mouse/rat Ki67 antibody | eBioscience | 14-5698-82 | |
monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) | Sigma | 085K4889 | |
anti-rat Cytokeratin 19 | DSHB | ||
monoclonal Mouse anti-BrdU | Dako | M0744 | |
Hoechst | Sigma | 33342 |