Summary

Endocrine और बहि: Reprogramming और प्रसार के लिए एक मॉडल के रूप में अग्नाशय वाहिनी के ligation के माध्यम से माउस अग्न्याशय के लिए सर्जिकल चोट

Published: August 07, 2015
doi:

Summary

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Abstract

एक भ्रूण या वयस्क स्टेम सेल से भेदभाव से विवो या पूर्व vivo, या बीटा कोशिकाओं की पीढ़ी में अग्नाशय बीटा कोशिकाओं के विस्तार, मधुमेह के लिए चिकित्सा के रूप में मानव आइलेट प्रत्यारोपण में दाता की कमी को दूर करने के लिए बीटा कोशिकाओं का नया विस्तार योग्य स्रोतों प्रदान कर सकते हैं। हाल के अग्रिमों इस उद्देश्य की दिशा में किया गया है, एक स्टेम / पूर्वज सेल से बीटा सेल विस्तार और भेदभाव को विनियमित तंत्र है कि लक्षण वर्णन किया जा रह है। यहाँ, हम ऊतक remodeling और बीटा सेल प्रसार और भेदभाव के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में कार्य कर सकते हैं कि वयस्क माउस अग्न्याशय में एक चोट मॉडल के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है। आंशिक वाहिनी बंधाव (पीडीएल) अग्न्याशय की पूंछ क्षेत्र से बाहर बहि उत्पादों की जल निकासी का एक रुकावट में जिसके परिणामस्वरूप मुख्य अग्नाशय वाहिनी के सर्जिकल बंधाव को शामिल कृंतक अग्न्याशय का एक प्रयोगात्मक प्रेरित चोट है। प्रवृत्त क्षति कोष्ठकी शोष, प्रतिरक्षा सेल infilt लाती हैराशन और गंभीर ऊतक remodeling के। हम पहले अंतर्जात पूर्वज कोशिकाओं की तरह और पीडीएल के बाद बीटा सेल प्रसार में वृद्धि व्यक्त Neurogenin (NGN) 3 की सक्रियता की सूचना दी है। इसलिए, पीडीएल बीटा सेल गतिशीलता में शामिल संकेतों और वयस्क अग्न्याशय में एक अंत: स्रावी पूर्वज के गुणों का अध्ययन करने के लिए एक आधार प्रदान करता है। , यह अभी भी कारक है और रास्ते पीडीएल में बीटा सेल neogenesis और प्रसार के लिए योगदान है, जो काफी हद तक स्पष्ट नहीं हुआ है के बाद से, पीडीएल के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रयोगशालाओं भर में तुलना के लिए अनुमति देगा।

Introduction

300 से अधिक लाख लोगों को दुनिया भर में व्यापक 1,2 को प्रभावित करने वाले मधुमेह के बढ़ते प्रसार की कमी बीटा सेल मास की भरपाई करने के लिए इन विट्रो में और vivo में दोनों, इंसुलिन के उत्पादन बीटा कोशिकाओं के नए स्रोतों की खोज बढ़ाया है। 3 प्रमुख की पहचान बीटा सेल प्रसार और बीटा सेल neogenesis, यानी, एक गैर-बीटा सेल या पूर्वज सेल से बीटा कोशिकाओं के भेदभाव को नियंत्रित करने वाले तंत्र और कारकों, मधुमेह में पुनर्योजी चिकित्सा के विकास के लिए उपन्यास लक्ष्य प्रदान कर सकते हैं।

विकासशील कृंतक अग्न्याशय में, अंत: स्रावी प्रकार की कोशिकाओं के सभी प्रतिलेखन कारक Neurogenin3 (Ngn3) को व्यक्त करने, अंत: स्रावी पूर्वज कोशिकाओं का एक क्षणिक आबादी से अलग। 4,5 वयस्क कृंतक अग्न्याशय में, सामान्य शारीरिक शर्तों के तहत, बीटा सेल मास है एक इष्टतम संख्या पर बनाए रखा चयापचय की मांग को पूरा करने के लिए। बीटा सेल आकार में परिवर्तन,बीटा कोशिकाओं की क्षमता सामान्य शारीरिक शर्तों के तहत पैदा करने के लिए एक ओर जहां एपोप्टोसिस और नकल आबादी भर में समरूप है बीटा सेल विस्तार और मोड़ पर। 6-8 के लिए प्रमुख तंत्र का गठन, 9 उनके प्रसार की दर कम है और फिर से प्रतिकृति के द्वारा प्रतिबंधित है उम्र और ग्लूकोज चयापचय से प्रभावित एक गतिशील निष्क्रियता की अवधि या दु: साध्य अवधि 6,7,। 10 अंत: स्रावी मूल कोशिकाओं में अब तक सामान्य वयस्क अग्न्याशय में पहचान नहीं की गई है, neogenesis नहीं सामान्य वयस्क बीटा सेल के विकास में योगदान करने के लिए सोचा है। 8

इसलिए, विस्तार और एक उपन्यास, बीटा कोशिकाओं की संभवतः असीमित स्रोत प्रदान करेगा नया बीटा कोशिकाओं से बेदखल करने में सक्षम है कि वयस्क अग्न्याशय में एक ऐच्छिक अंत: स्रावी पूर्वज सेल की पहचान।

आंशिक वाहिनी बंधाव (पीडीएल) बीटा सेल neogenesi प्रेरित करने के लिए वर्णित किया गया है कि एक जानवर चोट मॉडल हैवयस्क अग्न्याशय में है। इस मॉडल में 11,12, अग्नाशय पूंछ draining मुख्य अग्नाशय वाहिनी शल्य चिकित्सा द्वारा ligated है। बहि: जल निकासी के परिणामस्वरूप रुकावट इस भड़काऊ वातावरण के भीतर सूजन और बंधाव के लिए बाहर का कोष्ठकी शोष। 12-14 के साथ प्रमुख ऊतक remodeling, लाती है, Ngn3 प्रेरित है अंत: स्रावी पूर्वज मार्कर और बीटा सेल की मात्रा का फिर से अभिव्यक्ति दो गुना बढ़ जाती है । भ्रूण-प्रकार अंत: स्रावी पूर्वज सेल और "निष्क्रियता की अवधि" बिना दोहराव फिर से होने का खतरा है कि पूर्व मौजूदा और नवगठित बीटा कोशिकाओं के प्रसार से व्यक्त एक Ngn3 से नया बीटा कोशिकाओं की पीढ़ी से बीटा सेल की मात्रा परिणामों में इस दोहरीकरण। 11,15

ऐसे अग्न्याशय 6,7,16-19 और बीटा कोशिकाओं 20 के चुनिंदा पृथक रूप में चोट मॉडल में बीटा सेल neogenesis और नकल बड़े पैमाने पर वर्णित किया गया है। Thes में हालांकि, पुनर्जन्म का परिणामई मॉडल प्रवृत्त क्षति की सीमा से प्रभावित है और एक कम प्रारंभिक बीटा सेल मास 21 के साथ जुड़ा हुआ है। पीडीएल प्रारंभिक बीटा सेल जन प्रभावित नहीं है और बीटा सेल neogenesis और प्रसार मजबूती के साथ सक्रिय कर रहे हैं, जिसमें एक शल्य चिकित्सा मॉडल है। दरअसल, पीडीएल कराना पड़ा कि चूहों के अग्न्याशय में, Ngn3 व्यक्त कोशिकाओं वाहिनी की उपकला अस्तर के पास पहचान कर रहे हैं। इन कोशिकाओं को छँटाई प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल (FACS) का उपयोग Ngn3-GFP ट्रांसजेनिक चूहों के ligated अग्न्याशय से अलग और E12.5 Ngn3 के अग्न्याशय की और पूर्व vivo संस्कृति में engraftment निम्नलिखित कार्यात्मक बीटा कोशिकाओं की दिशा में अंतर करने में सक्षम हैं किया जा सकता है – / – । चूहों 11 इसी तरह, Ngn3 CreERT में;। Ngn3 जीन सक्रिय कोशिकाओं है कि स्थायी रूप से tamoxifen के इंजेक्शन, लेबल पॉजिटिव Ngn3 सेल व्युत्पन्न बीटा कोशिकाओं पीडीएल के बाद पता चला रहे हैं के बाद चिह्नित कर रहे हैं, जिसमें R26 YFP चूहों 15 इसके अलावा, नवगठित बीटा कोशिकाओं पूर्व पतला -existलक्ष्य-विशिष्ट छोटी-बाल के लिये कांटा शाही सेना काफी बीटा सेल द्रव्यमान और बीटा सेल प्रसार के बाद कम हो जाती है का उपयोग कर Ngn3 अभिव्यक्ति में कमी आई के बाद से बीटा कोशिकाओं आईएनजी और अधिमान्यतया बीटा कोशिकाओं उच्च प्रसार क्षमता दिखाने के भीतर जो छोटे टापू में खोजें। 15 Ngn3 पीडीएल के बाद बीटा सेल के विस्तार के लिए महत्वपूर्ण है पीडीएल। 11 विशेष रूप से, पीडीएल के बाद Ngn3 सेल व्युत्पन्न बीटा कोशिकाओं के अंश और बीटा सेल जन समीक्षकों Ngn3 प्रेरण 15 के स्तर पर निर्भर करता है। R26 आई डी टी आर चूहों;। यह Ngn3 Ngn3 CreERT को डिप्थीरिया विष प्रशासन द्वारा कोशिकाओं को व्यक्त करने का चयनात्मक पृथक Ngn3 अभिव्यक्ति के उच्च स्तर पर अग्नाशय के विकास के दौरान multipotent अग्नाशय के पूर्वज से अंत: स्रावी प्रतिबद्धता के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है कि अवलोकन के अनुसार है इसके अलावा 22 विशेष रूप से छोटे टापू में कमी आई इंसुलिन सामग्री और कम बीटा सेल प्रसार, में परिणाम है। 15

<pपीडीएल के बाद वाहिनी कोशिकाओं में Ngn3 अभिव्यक्ति की प्रेरण कई 11,15,16,23,24 द्वारा पुष्टि की गई है हालांकि वर्ग = "jove_content">, पीडीएल के परिणाम में टापू कोशिकाओं 24,25 और विसंगतियों में Ngn3 अभिव्यक्ति हमारी प्रारंभिक टिप्पणियों को चुनौती दी बढ़ी हुई बीटा सेल जन 26,27 की, Ngn3 की उपस्थिति पीडीएल के बाद वाहिनी व्युत्पन्न अंत: स्रावी पूर्वज 24,26,28,29, और वृद्धि की बीटा सेल प्रसार 27 व्यक्त। 30

इन परस्पर विरोधी परिणाम है, कम से कम आंशिक रूप से, सबसे महत्वपूर्ण बात, चूहों, पोस्ट ऑपरेटिव शारीरिक और पर्यावरण की स्थिति और, विश्लेषण, वजन, लिंग और उम्र की शल्य चिकित्सा के बाद समय बिंदुओं में बदलाव सहित कारकों के संयोजन के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है सर्जिकल तकनीक में मतभेद। हमारे हाथ में 30, बीटा सेल प्रसार, इंसुलिन सामग्री, बीटा सेल की मात्रा और छोटे टापू की संख्या लगातार पीडीएल के बाद बढ़ रहे हैं। भीNgn3 mRNA के लगातार बढ़ जाती है, लेकिन हम कोई सीधा विवरण है, जिसके लिए पीडीएल पूंछ pancreases के बीच Ngn3 mRNA अभिव्यक्ति में बड़े मतभेद हैं। हम Ngn3 mRNA की स्तर गैर बीटा कोशिकाओं 15 से बीटा सेल neogenesis की डिग्री के साथ सहसंबंधी सकता धारणा है कि है, लेकिन यह आगे सिद्धि की जरूरत है। यह सब प्रयोगात्मक विविधताओं को दूर नहीं करता है, पीडीएल सर्जरी प्रदर्शन के लिए एक मानकीकृत विधि परिणामों में बेहतर एकरूपता के लिए अनुमति देता है और बीटा सेल प्रसार और neogenesis अध्ययन में नए रास्ते खोलता है।

Protocol

सभी जोड़तोड़ प्रायोगिक और अन्य वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल हड्डीवाला जानवरों के संरक्षण के लिए यूरोपीय कन्वेंशन द्वारा जारी किए गए दिशा निर्देशों का पालन (टिकट 123 और और 2010/63 / ईयू)। क?…

Representative Results

पीडीएल कोष्ठकी शोष और सूजन को प्रेरित करता है, लेकिन वजन और glycemia को प्रभावित नहीं करता पेट और ग्रहणी के निकट स्थित अंग के सिर, अप्रभावित रहता है, जबकि 8 सप्ताह पुराने पुरुष BALB / ग चूहों में, ?…

Discussion

In the present study, we describe in detail the methodology behind PDL, a mouse injury model to study beta cell neogenesis and proliferation and transdifferentiation of pancreatic non-beta cells. Ambiguity in data on PDL among labs stimulates the need for a standardized protocol for PDL surgery.

Critical steps in the PDL protocol include the selection of healthy, young mice for surgery. Preferably male mice should be used since unpublished data from our lab suggest that estrogen receptor signa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors acknowledge all colleagues who made this work possible; Ann Demarré, Veerle Laurysens, Jan De Jonge and Erik Quartier for technical assistance. Financial support was from the VUB Research Council, the Institute for the Promotion of Innovation by Science and Technology in Flanders (IWT), the Beta Cell Biology Consortium (BCBC), the Fund for Scientific Research Flanders (FWO), Diabetes Onderzoek Nederland (DON) and Interuniversity Attraction Pole (IAP).

Materials

Supplies for preparation area 
Hibiscrub  Regent Medical 5601IE5F11 Chlorhexidin diglucon
Ketamin Ceva BE-V202526 anesthesia
Rompun(2%) (Xylazin) Bayer BE-V041815 anesthesia
Duratears Alcon 34335-8 ointment for eyes
Razor
Supplies for surgical area 
Leica Operating microscope Leica 10446320
Hot bead sterilizer Fine Science Tools (FST) 18000-45
autoclaved surgical instruments Fine Science Tools (FST)
Recirclulating water heating pad Gaymar Industries, Inc. TP702
Adhesive OP-towel BARRIER 706500-07
OP-tape BARRIER 381035-00
Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) Lohmann&Rauscher International 35968
Mini Plasco 0,9% NaCl solution B.BRAUN 3521680
6-0 prolene suture Ethicon 8706H
4-0 polyglycol suture Ethicon SL-607
Supplies for recovery area
Paper bedding (paper towel)
Vetergesic ecuPhar BE-V342955
Materials for analysis
Taqman Ngn3 primer Integrated DNA technologies Mm.PT.56a.33574796.gs
Taqman CycloA primer Integrated DNA technologies Mm.PT.39a.2.gs
anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) Cell Signaling 5A1E
anti-mouse/rat Ki67 antibody eBioscience 14-5698-82
monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) Sigma 085K4889
anti-rat Cytokeratin 19  DSHB
monoclonal Mouse anti-BrdU Dako M0744
Hoechst Sigma 33342

References

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De Groef, S., Leuckx, G., Van Gassen, N., Staels, W., Cai, Y., Yuchi, Y., Coppens, V., De Leu, N., Heremans, Y., Baeyens, L., Van de Casteele, M., Heimberg, H. Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation. J. Vis. Exp. (102), e52765, doi:10.3791/52765 (2015).

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