Lesioni chirurgica al pancreas mouse attraverso la legatura del Dotto pancreatico come un modello per Endocrine e Esocrine riprogrammazione e la proliferazione
Summary
This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.
Abstract
L'espansione delle cellule beta pancreatiche in vivo o ex vivo, o la generazione di cellule beta per il differenziamento di una cellula staminale embrionale o adulto, in grado di fornire nuove fonti espandibili di cellule beta per alleviare la scarsità dei donatori nel trapianto di isole umana come terapia per il diabete. Nonostante i recenti progressi sono stati compiuti verso questo obiettivo, i meccanismi che regolano la crescita delle cellule beta e la differenziazione da cellule staminali / progenitrici devono ancora essere caratterizzato. Qui, descriviamo un protocollo per un modello di ferita nel topo pancreas adulto che può funzionare come strumento per studiare i meccanismi di rimodellamento del tessuto e la proliferazione delle cellule beta e la differenziazione. Legatura del dotto parziale (PDL) è una lesione indotta sperimentalmente del pancreas roditore coinvolge legatura chirurgica del dotto pancreatico principale con conseguente ostruzione del drenaggio di prodotti esocrine dalla regione coda del pancreas. Il danno inflitto induce atrofia acinare, infilt cellule immunitarierazione e severo rimodellamento tissutale. Abbiamo già riferito l'attivazione di neurogenina (NGN) 3 esprimono cellule progenitrici simili endogene e un aumento della proliferazione delle cellule beta, dopo Pdl. Pertanto, PDL fornisce una base per studiare segnali coinvolti nella dinamica cellule beta e le proprietà di un progenitore endocrina pancreatica adulta. Dal momento che, resta ancora in gran parte poco chiaro, quali fattori e percorsi contribuiscono alla neogenesi delle cellule beta e la proliferazione in PDL, un protocollo standardizzato per PDL permetterà confronto tra laboratori.
Introduction
La crescente prevalenza del diabete, che colpisce più di 300 milioni di persone in tutto il mondo 1,2 ha favorito la ricerca di nuove fonti di cellule beta produttrici di insulina, sia in vitro che in vivo, per ricostituire la massa di cellule beta carente. 3 Identificazione chiave meccanismi e fattori che regolano la proliferazione delle cellule beta e beta neogenesi delle cellule, cioè, la differenziazione di cellule beta da una cellula cellula o progenitrici non beta, possono fornire nuovi bersagli per lo sviluppo di terapie rigenerative nel diabete.
Nei sviluppo pancreas roditori, tutti i tipi di cellule endocrine differenziare da una popolazione transitoria di cellule progenitrici endocrine, che esprime il fattore di trascrizione Neurogenin3 (Ngn3). 4,5 nel pancreas roditori adulti, in condizioni fisiologiche normali, la massa delle cellule beta è mantenuta ad un numero ottimale per soddisfare esigenze metaboliche. Cambiamenti nella dimensione delle cellule beta,apoptosi e replica costituiscono i principali meccanismi di espansione delle cellule beta e turn-over. 6-8 Mentre il potenziale delle cellule beta di proliferare in condizioni fisiologiche normali è omogenea in tutta la popolazione, 9 il loro tasso di proliferazione è basso e ri-replica è limitato da un periodo di stasi dinamica o periodo refrattario 6,7, influenzato da età e il metabolismo del glucosio. 10 Dato che le cellule progenitrici endocrine non sono finora state identificate nel normale pancreas adulti, neogenesi è pensato di non contribuire alla crescita delle cellule beta adulta normale. 8
Pertanto, l'identificazione di una cellula progenitrice facoltativo endocrine nel pancreas adulto che è espandibile e in grado di produrre nuove cellule beta fornirebbe un romanzo, possibilmente fonte illimitata di cellule beta.
Legatura del dotto parziale (PDL) è un modello di lesione animale che è stato descritto per indurre neogenesi delle cellule betas nel pancreas adulti. 11,12 In questo modello, il dotto pancreatico principale svuotamento della coda pancreatica è chirurgicamente legatura. L'ostruzione conseguente drenaggio esocrina induce rimodellamento tissutale principale, accompagnato da infiammazione e atrofia acinare distale alla legatura. 12-14 All'interno di questo ambiente infiammatorio, ri-espressione del marcatore endocrino progenitore Ngn3 è indotta e il volume delle cellule beta aumenta duplice . Questo raddoppio risultati beta di volume delle cellule dalla generazione di nuove cellule beta da un Ngn3 esprimere embrionale-tipo di cellule endocrine progenitore e dalla proliferazione delle cellule beta preesistenti e di nuova costituzione che tendono a ri-duplicazione senza "periodo di quiescenza". 11,15
Neogenesi delle cellule beta e la replica in modelli di pregiudizio come la pancreatectomia 6,7,16-19 e l'ablazione selettiva delle cellule beta 20 sono stati ampiamente descritti. Tuttavia, il risultato rigenerativa in these modelli è influenzato dalla entità del danno inflitto ed è associata con una diminuzione della beta iniziale massa cellulare 21. PDL è un modello chirurgica in cui la massa di cellule beta iniziale non è interessato e neogenesi e la proliferazione delle cellule beta sono robustamente attivati. Infatti, nel pancreas di topi sottoposti a PDL, cellule che esprimono Ngn3 sono identificati vicino al rivestimento epiteliale del condotto. Queste cellule possono essere isolate dal pancreas legatura di Ngn3-GFP topi transgenici utilizzando la fluorescenza delle cellule attivate (FACS) e sono in grado di differenziare verso le cellule beta funzionali seguente attecchimento in e ex vivo della cultura del pancreas di E12.5 Ngn3 – / – . topi 11 Allo stesso modo, in Ngn3 CreERT;. topi R26 YFP in cui le cellule che attivano il gene Ngn3 sono etichettati in modo permanente dopo l'iniezione tamoxifene, Ngn3 cellule beta cellule derivate label-positivi vengono rilevati dopo Pdl 15 Inoltre, le cellule beta di nuova formazione diluire pre -existing cellule beta e preferenzialmente localizzare in piccoli isolotti entro cui le cellule beta mostrano un alto potenziale di proliferazione. 15 Ngn3 è importante per l'espansione delle cellule beta dopo PDL da ridotta espressione Ngn3 utilizzando RNA breve tornante specifici target diminuisce significativamente la massa delle cellule beta e la proliferazione delle cellule beta dopo PDL. 11 In particolare, la frazione di cellule beta cellule derivate Ngn3 e la massa delle cellule beta dopo PDL dipende criticamente dal livello di Ngn3 induzione 15. Ciò è in accordo con l'osservazione che alto livello di espressione Ngn3 è un passaggio fondamentale per l'impegno endocrino da progenitori pancreatici multipotenti durante lo sviluppo del pancreas 22 Inoltre, ablazione selettiva di Ngn3 cellule che esprimono di amministrazione di tossina difterica per Ngn3 CreERT;. R26 IDTR topi risultati in contenuto di insulina diminuita e ridotta proliferazione delle cellule beta, soprattutto nei piccoli isolotti. 15
<pclass = "jove_content"> Anche se l'induzione dell'espressione Ngn3 in cellule del dotto dopo Pdl è stata confermata da molti 11,15,16,23,24, espressione Ngn3 nelle cellule isolotti 24,25 e discrepanze in esito del Pdl sfidato nostre osservazioni iniziali di una maggiore massa di cellule beta 26,27, comparsa di Ngn3 esprimere condotto di derivazione progenitori endocrini 24,26,28,29, e un aumento della proliferazione delle cellule beta 27 dopo Pdl. 30Questi risultati contrastanti potrebbero, almeno in parte, essere attribuito ad una combinazione di fattori, tra variazioni di punti di tempo post-chirurgiche di analisi, peso corporeo, il sesso e l'età dei topi, condizioni fisiologiche e ambientali post-operative e, soprattutto, differenze di tecnica chirurgica. 30 Nelle nostre mani, la proliferazione delle cellule beta, il contenuto di insulina, il volume delle cellule beta e il numero di piccoli isolotti sono costantemente aumentati dopo Pdl. AncheNgn3 mRNA aumenta costantemente, ma ci sono grandi differenze nell'espressione Ngn3 mRNA tra pancreas coda PDL, per i quali non abbiamo alcuna spiegazione diretta. Abbiamo ipotizzato che il livello di mRNA Ngn3 potrebbe correlare con il grado di neogenesi delle cellule beta da cellule non-beta 15, ma questo necessita di ulteriori fondatezza. Anche se non rimuove tutte le varianti sperimentali, un metodo standard per l'esecuzione di un intervento chirurgico PDL consente una migliore uniformità dei risultati e apre nuove strade per lo studio della proliferazione delle cellule beta e neogenesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In the present study, we describe in detail the methodology behind PDL, a mouse injury model to study beta cell neogenesis and proliferation and transdifferentiation of pancreatic non-beta cells. Ambiguity in data on PDL among labs stimulates the need for a standardized protocol for PDL surgery.
Critical steps in the PDL protocol include the selection of healthy, young mice for surgery. Preferably male mice should be used since unpublished data from our lab suggest that estrogen receptor signa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge all colleagues who made this work possible; Ann Demarré, Veerle Laurysens, Jan De Jonge and Erik Quartier for technical assistance. Financial support was from the VUB Research Council, the Institute for the Promotion of Innovation by Science and Technology in Flanders (IWT), the Beta Cell Biology Consortium (BCBC), the Fund for Scientific Research Flanders (FWO), Diabetes Onderzoek Nederland (DON) and Interuniversity Attraction Pole (IAP).
Materials
| Supplies for preparation area | |||
| Hibiscrub | Regent Medical | 5601IE5F11 | Chlorhexidin diglucon |
| Ketamin | Ceva | BE-V202526 | anesthesia |
| Rompun(2%) (Xylazin) | Bayer | BE-V041815 | anesthesia |
| Duratears | Alcon | 34335-8 | ointment for eyes |
| Razor | |||
| Supplies for surgical area | |||
| Leica Operating microscope | Leica | 10446320 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools (FST) | 18000-45 | |
| autoclaved surgical instruments | Fine Science Tools (FST) | ||
| Recirclulating water heating pad | Gaymar Industries, Inc. | TP702 | |
| Adhesive OP-towel | BARRIER | 706500-07 | |
| OP-tape | BARRIER | 381035-00 | |
| Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) | Lohmann&Rauscher International | 35968 | |
| Mini Plasco 0,9% NaCl solution | B.BRAUN | 3521680 | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 4-0 polyglycol suture | Ethicon | SL-607 | |
| Supplies for recovery area | |||
| Paper bedding (paper towel) | |||
| Vetergesic | ecuPhar | BE-V342955 | |
| Materials for analysis | |||
| Taqman Ngn3 primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.56a.33574796.gs | |
| Taqman CycloA primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.39a.2.gs | |
| anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) | Cell Signaling | 5A1E | |
| anti-mouse/rat Ki67 antibody | eBioscience | 14-5698-82 | |
| monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) | Sigma | 085K4889 | |
| anti-rat Cytokeratin 19 | DSHB | ||
| monoclonal Mouse anti-BrdU | Dako | M0744 | |
| Hoechst | Sigma | 33342 |
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