Kirurgisk Skade på Mouse Pancreas gjennom Ligering av bukspyttkjertelen duct som en modell for Endocrine og Exocrine Omprogrammering og spredning

Summary

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Abstract

Utvidelse av pankreas beta-celler in vivo eller ex vivo, eller produksjon av beta-cellene ved differensiering av en embryonisk eller voksen stamcelle, kan gi nye utvidbare kilder for beta-celler for å avhjelpe mangelen på human donor øy-transplantasjon som terapi for diabetes. Selv om de siste fremskritt har blitt gjort mot dette målet, mekanismer som regulerer beta celle ekspansjon og differensiering fra en stamme / stamcelle fortsatt å være preget. Her beskriver vi en protokoll for en skade modell i den voksne mus bukspyttkjertelen som kan fungere som et verktøy for å studere mekanismer vev ombygging og beta celleproliferasjon og differensiering. Delvis kanal ligering (PDL) er en eksperimentelt indusert skade av gnager bukspyttkjertelen involverer kirurgisk ligering av hovedbukspyttkjertelkanalen hvilket resulterer i en hindring for bortledning av eksokrine produkter ut av haleområdet av bukspyttkjertelen. Den påført skader induserer acinar atrofi, immunceller infiltrasjon og alvorlig vev ombygging. Vi har tidligere rapportert aktivering av Neurogenin (NGN) 3 uttrykker endogene stamceller lignende celler og en økning i beta celledeling etter PDL. Derfor gir PDL en basis for å studere signalene som er involvert i celle beta dynamikk og egenskapene til en endokrin progenitor i voksen bukspyttkjertelen. Siden, det er fremdeles i stor grad uklart, hvilke faktorer og stier bidra til beta -celleregenerering og spredning i PDL, vil en standardisert protokoll for PDL tillate for sammenligning på tvers av laboratorier.

Introduction

Den økende utbredelsen av diabetes, som berører mer enn 300 millioner mennesker verden over ^1,2 har styrket letingen etter nye kilder til insulinproduserende betaceller, både in vitro og in vivo, å etterfylle mangelbetacellemasse. ³ Identifisere nøkkelen mekanismer og faktorer som regulerer beta celleproliferasjon og beta -celleregenerering, dvs. differensieringen av beta-celler fra et ikke-beta-celle eller stamceller, kan tilveiebringe nye mål for utvikling av regenerativ behandling i diabetes.

I den utviklende gnager bukspyttkjertelen, alle de endokrine celletyper skille fra en transient populasjon av endokrine progenitorceller, som uttrykker transkripsjonsfaktoren Neurogenin3 (Ngn3). ^4,5 i voksen gnager bukspyttkjertelen, under normale fysiologiske betingelser, er beta cellemassen opprettholdes på et optimalt antall for å dekke metabolske krav. Endringer i betacellestørrelse,apoptose og replikering utgjør de viktigste mekanismene for beta celle ekspansjon og turn-over. ^6-8 Mens potensialet i beta-cellene til å spre seg under normale fysiologiske forhold er homogen i hele befolkningen, er lav ⁹ deres spredning rate og re-replikering er begrenset av en dynamisk quiescence periode eller refraktærtid ^6,7, påvirket av alder og glukosemetabolisme. ¹⁰ Etter endokrin stamceller har hittil ikke blitt identifisert i normale voksne bukspyttkjertelen, er -celleregenerering antatt å ikke bidra til normal voksen betacellevekst. ⁸

Derfor er identifiseringen av en fakultativ endokrine stamceller i voksen bukspyttkjertelen som er utvidbart og istand til å gi nye beta-celler ville tilveiebringe et nytt, eventuelt ubegrenset kilde av beta-celler.

Delvis duct ligation (PDL) er et dyr skademodell som har blitt beskrevet å indusere betacelle neogenesis i den voksne bukspyttkjertelen. ^11,12 I denne modellen er den viktigste bukspyttkjertelen duct drenering av bukspyttkjertelen halen kirurgisk ligert. Den resulterende obstruksjon av eksokrint drenering induserer store vev-omforming, ledsaget av betennelse og acinar atrofi distalt for ligering. ^12-14 Innenfor dette inflammatorisk miljø, re-ekspresjon av det endokrine progenitor markør Ngn3 er indusert og betacellevolumet øker todelt . Dette dobling i betacellevolum resultater fra generasjon av nye betaceller fra en Ngn3 uttrykker embryonale-type endokrine stamceller og fra spredning av pre-eksisterende og nydannede betaceller som er utsatt for re-duplisering uten "quiescence periode". ^11,15

Beta -celleregenerering og replikering i skademodeller, for eksempel pancreatectomy ^6,7,16-19 og selektiv ablasjon av betaceller ²⁰ har blitt grundig beskrevet. Men den regenerative utfallet i these modeller er påvirket av graden av påført skade og er forbundet med en redusert første betacellemasse ^21. PDL er en kirurgisk modell der den første betacellemassen ikke blir påvirket og beta -celleregenerering og spredning er robust aktivert. Faktisk, i bukspyttkjertelen hos mus som gjennomgikk PDL er Ngn3 uttrykkende celler identifisert nær epitelbelegg av kanalen. Disse cellene kan bli isolert fra de ligerte pankreas av Ngn3 GFP-transgene mus ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og er i stand til å differensiere til funksjonelle beta-celler etter innpoding i og ex vivo kultur av bukspyttkjertelen av E12.5 Ngn3 ^{– / –} . mus ¹¹ Tilsvarende i Ngn3 ^CreERT;. R26 ^YFP mus der celler som aktiverte den Ngn3 genet er permanent merket etter tamoxifen injeksjon, er label-positive Ngn3 celle-stammer betaceller oppdaget etter PDL ¹⁵ Videre nydannede betaceller fortynne pre -existing betaceller og fortrinnsvis finne i små holmer innen hvilke betaceller viser høy spredning potensial. ¹⁵ Ngn3 er viktig for beta celle ekspansjon etter PDL siden redusert Ngn3 uttrykk ved hjelp av target-spesifikke kort hårnål RNA betydelig reduserer betacellemasse og beta celleproliferasjon etter PDL. ¹¹ Spesielt, brøkdel av Ngn3 celle-stammer betaceller og betacellemassen etter PDL kritisk avhenger av graden av induksjon Ngn3 ^15. Dette er i samsvar med den observasjon at høyt nivå av Ngn3 uttrykk er et viktig skritt for endocrine engasjement fra multipotente bukspyttkjertelen stamfedre under bukspyttkjertelen utvikling ²² I tillegg, selektiv ablasjon av Ngn3 uttrykke celler ved difteri-toksin administrasjon til Ngn3 ^CreERT;. R26 ^IDTR mus resulterer i redusert insulininnhold og redusert beta celleproliferasjon, særlig i små øyer. ¹⁵

<pclass = "jove_content"> Selv om induksjon av Ngn3 uttrykk i kanal celler etter PDL har blitt bekreftet av mange ^{11,15,16,23,24,} Ngn3 uttrykk i holmer cellene ^24,25 og avvik i utfallet av PDL utfordret våre første observasjoner av økt beta cellemasse ^26,27, utseende Ngn3 uttrykke duct-avledet endokrine stamfedre ^24,26,28,29 og økt beta celledeling ²⁷ etter PDL. ³⁰

Disse motstridende resultatene kan, i hvert fall delvis, tilskrives en kombinasjon av faktorer, inkludert variasjoner i post-kirurgiske tidspunkter for analyse, kroppsvekt, kjønn og alder på mus, postoperative fysiologiske og miljømessige forhold og, viktigst, forskjeller i kirurgisk teknikk. ³⁰ i våre hender, beta celle spredning, insulin innhold, beta celle volum og antall små holmer er konsekvent økt etter PDL. OgsåNgn3 mRNA konsekvent øker, men det er store forskjeller i Ngn3 mRNA uttrykket mellom PDL hale pancreases, som vi ikke har noen direkte forklaring. Vi antok at nivået av Ngn3 mRNA kan korrelere med graden av beta -celleregenerering fra ikke-beta-celler ^15, men dette krever ytterligere substansen. Selv om det ikke fjerner alle eksperimentelle varianter, en standardisert metode for å utføre PDL kirurgi gir bedre ensartethet i resultater og åpner nye veier i å studere beta celleproliferasjon og -celleregenerering.

Protocol

Alle manipulasjoner følge retningslinjene gitt av Den europeiske konvensjon om beskyttelse av virveldyr som brukes til eksperimenter og andre vitenskapelige formål (ETS 123 og og 2010/63 / EU). 1. Utarbeidelse av arbeidsplassen Gi en dedikert forberedelse område, en kirurgisk område og et recovery-området. Gjennomføre hele kirurgiske prosedyren i en laminær strømning kabinett for å minimere miljøforurensninger. Monter forsyninger (som er oppført i ma…

Representative Results

PDL induserer acinar atrofi og betennelse, men påvirker ikke kroppsvekt og glycemia Etter 8 uker gamle BALB / c-mus er kanalen drenering eksokrine enzymer fra halen i bukspyttkjertelen ligert mens organ hode, som ligger ved siden av magesekken og tolvfingertarm, forblir upåvirket. Alder, kjønn og vekt tilpassede BALB / c-mus gjennomgå en falsk operasjon recapitulating alle trinn av delvis kanal ligation kirurgi, bortsett fra ligering av bukspyttkjertelkanalen. Pancreas v…

Discussion

In the present study, we describe in detail the methodology behind PDL, a mouse injury model to study beta cell neogenesis and proliferation and transdifferentiation of pancreatic non-beta cells. Ambiguity in data on PDL among labs stimulates the need for a standardized protocol for PDL surgery.

Critical steps in the PDL protocol include the selection of healthy, young mice for surgery. Preferably male mice should be used since unpublished data from our lab suggest that estrogen receptor signa…

Materials

Supplies for preparation area
Hibiscrub	Regent Medical	5601IE5F11	Chlorhexidin diglucon
Ketamin	Ceva	BE-V202526	anesthesia
Rompun(2%) (Xylazin)	Bayer	BE-V041815	anesthesia
Duratears	Alcon	34335-8	ointment for eyes
Razor
Supplies for surgical area
Leica Operating microscope	Leica	10446320
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools (FST)	18000-45
autoclaved surgical instruments	Fine Science Tools (FST)
Recirclulating water heating pad	Gaymar Industries, Inc.	TP702
Adhesive OP-towel	BARRIER	706500-07
OP-tape	BARRIER	381035-00
Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile)	Lohmann&Rauscher International	35968
Mini Plasco 0,9% NaCl solution	B.BRAUN	3521680
6-0 prolene suture	Ethicon	8706H
4-0 polyglycol suture	Ethicon	SL-607
Supplies for recovery area
Paper bedding (paper towel)
Vetergesic	ecuPhar	BE-V342955
Materials for analysis
Taqman Ngn3 primer	Integrated DNA technologies	Mm.PT.56a.33574796.gs
Taqman CycloA primer	Integrated DNA technologies	Mm.PT.39a.2.gs
anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175)	Cell Signaling	5A1E
anti-mouse/rat Ki67 antibody	eBioscience	14-5698-82
monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse)	Sigma	085K4889
anti-rat Cytokeratin 19	DSHB
monoclonal Mouse anti-BrdU	Dako	M0744
Hoechst	Sigma	33342