Summary

Kirurgisk Skade på Mouse Pancreas gjennom Ligering av bukspyttkjertelen duct som en modell for Endocrine og Exocrine Omprogrammering og spredning

Published: August 07, 2015
doi:

Summary

This protocol describes an injury model involving the surgical ligation of the pancreatic duct in the adult mouse pancreas, resulting in severe injury that establishes an environment that allows beta cell neogenesis and proliferation. This model can be used as a tool to study mechanisms involved in beta cell formation.

Abstract

Utvidelse av pankreas beta-celler in vivo eller ex vivo, eller produksjon av beta-cellene ved differensiering av en embryonisk eller voksen stamcelle, kan gi nye utvidbare kilder for beta-celler for å avhjelpe mangelen på human donor øy-transplantasjon som terapi for diabetes. Selv om de siste fremskritt har blitt gjort mot dette målet, mekanismer som regulerer beta celle ekspansjon og differensiering fra en stamme / stamcelle fortsatt å være preget. Her beskriver vi en protokoll for en skade modell i den voksne mus bukspyttkjertelen som kan fungere som et verktøy for å studere mekanismer vev ombygging og beta celleproliferasjon og differensiering. Delvis kanal ligering (PDL) er en eksperimentelt indusert skade av gnager bukspyttkjertelen involverer kirurgisk ligering av hovedbukspyttkjertelkanalen hvilket resulterer i en hindring for bortledning av eksokrine produkter ut av haleområdet av bukspyttkjertelen. Den påført skader induserer acinar atrofi, immunceller infiltrasjon og alvorlig vev ombygging. Vi har tidligere rapportert aktivering av Neurogenin (NGN) 3 uttrykker endogene stamceller lignende celler og en økning i beta celledeling etter PDL. Derfor gir PDL en basis for å studere signalene som er involvert i celle beta dynamikk og egenskapene til en endokrin progenitor i voksen bukspyttkjertelen. Siden, det er fremdeles i stor grad uklart, hvilke faktorer og stier bidra til beta -celleregenerering og spredning i PDL, vil en standardisert protokoll for PDL tillate for sammenligning på tvers av laboratorier.

Introduction

Den økende utbredelsen av diabetes, som berører mer enn 300 millioner mennesker verden over 1,2 har styrket letingen etter nye kilder til insulinproduserende betaceller, både in vitro og in vivo, å etterfylle mangelbetacellemasse. 3 Identifisere nøkkelen mekanismer og faktorer som regulerer beta celleproliferasjon og beta -celleregenerering, dvs. differensieringen av beta-celler fra et ikke-beta-celle eller stamceller, kan tilveiebringe nye mål for utvikling av regenerativ behandling i diabetes.

I den utviklende gnager bukspyttkjertelen, alle de endokrine celletyper skille fra en transient populasjon av endokrine progenitorceller, som uttrykker transkripsjonsfaktoren Neurogenin3 (Ngn3). 4,5 i voksen gnager bukspyttkjertelen, under normale fysiologiske betingelser, er beta cellemassen opprettholdes på et optimalt antall for å dekke metabolske krav. Endringer i betacellestørrelse,apoptose og replikering utgjør de viktigste mekanismene for beta celle ekspansjon og turn-over. 6-8 Mens potensialet i beta-cellene til å spre seg under normale fysiologiske forhold er homogen i hele befolkningen, er lav 9 deres spredning rate og re-replikering er begrenset av en dynamisk quiescence periode eller refraktærtid 6,7, påvirket av alder og glukosemetabolisme. 10 Etter endokrin stamceller har hittil ikke blitt identifisert i normale voksne bukspyttkjertelen, er -celleregenerering antatt å ikke bidra til normal voksen betacellevekst. 8

Derfor er identifiseringen av en fakultativ endokrine stamceller i voksen bukspyttkjertelen som er utvidbart og istand til å gi nye beta-celler ville tilveiebringe et nytt, eventuelt ubegrenset kilde av beta-celler.

Delvis duct ligation (PDL) er et dyr skademodell som har blitt beskrevet å indusere betacelle neogenesis i den voksne bukspyttkjertelen. 11,12 I denne modellen er den viktigste bukspyttkjertelen duct drenering av bukspyttkjertelen halen kirurgisk ligert. Den resulterende obstruksjon av eksokrint drenering induserer store vev-omforming, ledsaget av betennelse og acinar atrofi distalt for ligering. 12-14 Innenfor dette inflammatorisk miljø, re-ekspresjon av det endokrine progenitor markør Ngn3 er indusert og betacellevolumet øker todelt . Dette dobling i betacellevolum resultater fra generasjon av nye betaceller fra en Ngn3 uttrykker embryonale-type endokrine stamceller og fra spredning av pre-eksisterende og nydannede betaceller som er utsatt for re-duplisering uten "quiescence periode". 11,15

Beta -celleregenerering og replikering i skademodeller, for eksempel pancreatectomy 6,7,16-19 og selektiv ablasjon av betaceller 20 har blitt grundig beskrevet. Men den regenerative utfallet i these modeller er påvirket av graden av påført skade og er forbundet med en redusert første betacellemasse 21. PDL er en kirurgisk modell der den første betacellemassen ikke blir påvirket og beta -celleregenerering og spredning er robust aktivert. Faktisk, i bukspyttkjertelen hos mus som gjennomgikk PDL er Ngn3 uttrykkende celler identifisert nær epitelbelegg av kanalen. Disse cellene kan bli isolert fra de ligerte pankreas av Ngn3 GFP-transgene mus ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og er i stand til å differensiere til funksjonelle beta-celler etter innpoding i og ex vivo kultur av bukspyttkjertelen av E12.5 Ngn3 – / – . mus 11 Tilsvarende i Ngn3 CreERT;. R26 YFP mus der celler som aktiverte den Ngn3 genet er permanent merket etter tamoxifen injeksjon, er label-positive Ngn3 celle-stammer betaceller oppdaget etter PDL 15 Videre nydannede betaceller fortynne pre -existing betaceller og fortrinnsvis finne i små holmer innen hvilke betaceller viser høy spredning potensial. 15 Ngn3 er viktig for beta celle ekspansjon etter PDL siden redusert Ngn3 uttrykk ved hjelp av target-spesifikke kort hårnål RNA betydelig reduserer betacellemasse og beta celleproliferasjon etter PDL. 11 Spesielt, brøkdel av Ngn3 celle-stammer betaceller og betacellemassen etter PDL kritisk avhenger av graden av induksjon Ngn3 15. Dette er i samsvar med den observasjon at høyt nivå av Ngn3 uttrykk er et viktig skritt for endocrine engasjement fra multipotente bukspyttkjertelen stamfedre under bukspyttkjertelen utvikling 22 I tillegg, selektiv ablasjon av Ngn3 uttrykke celler ved difteri-toksin administrasjon til Ngn3 CreERT;. R26 IDTR mus resulterer i redusert insulininnhold og redusert beta celleproliferasjon, særlig i små øyer. 15

<pclass = "jove_content"> Selv om induksjon av Ngn3 uttrykk i kanal celler etter PDL har blitt bekreftet av mange 11,15,16,23,24, Ngn3 uttrykk i holmer cellene 24,25 og avvik i utfallet av PDL utfordret våre første observasjoner av økt beta cellemasse 26,27, utseende Ngn3 uttrykke duct-avledet endokrine stamfedre 24,26,28,29 og økt beta celledeling 27 etter PDL. 30

Disse motstridende resultatene kan, i hvert fall delvis, tilskrives en kombinasjon av faktorer, inkludert variasjoner i post-kirurgiske tidspunkter for analyse, kroppsvekt, kjønn og alder på mus, postoperative fysiologiske og miljømessige forhold og, viktigst, forskjeller i kirurgisk teknikk. 30 i våre hender, beta celle spredning, insulin innhold, beta celle volum og antall små holmer er konsekvent økt etter PDL. OgsåNgn3 mRNA konsekvent øker, men det er store forskjeller i Ngn3 mRNA uttrykket mellom PDL hale pancreases, som vi ikke har noen direkte forklaring. Vi antok at nivået av Ngn3 mRNA kan korrelere med graden av beta -celleregenerering fra ikke-beta-celler 15, men dette krever ytterligere substansen. Selv om det ikke fjerner alle eksperimentelle varianter, en standardisert metode for å utføre PDL kirurgi gir bedre ensartethet i resultater og åpner nye veier i å studere beta celleproliferasjon og -celleregenerering.

Protocol

Alle manipulasjoner følge retningslinjene gitt av Den europeiske konvensjon om beskyttelse av virveldyr som brukes til eksperimenter og andre vitenskapelige formål (ETS 123 og og 2010/63 / EU). 1. Utarbeidelse av arbeidsplassen Gi en dedikert forberedelse område, en kirurgisk område og et recovery-området. Gjennomføre hele kirurgiske prosedyren i en laminær strømning kabinett for å minimere miljøforurensninger. Monter forsyninger (som er oppført i ma…

Representative Results

PDL induserer acinar atrofi og betennelse, men påvirker ikke kroppsvekt og glycemia Etter 8 uker gamle BALB / c-mus er kanalen drenering eksokrine enzymer fra halen i bukspyttkjertelen ligert mens organ hode, som ligger ved siden av magesekken og tolvfingertarm, forblir upåvirket. Alder, kjønn og vekt tilpassede BALB / c-mus gjennomgå en falsk operasjon recapitulating alle trinn av delvis kanal ligation kirurgi, bortsett fra ligering av bukspyttkjertelkanalen. Pancreas v…

Discussion

In the present study, we describe in detail the methodology behind PDL, a mouse injury model to study beta cell neogenesis and proliferation and transdifferentiation of pancreatic non-beta cells. Ambiguity in data on PDL among labs stimulates the need for a standardized protocol for PDL surgery.

Critical steps in the PDL protocol include the selection of healthy, young mice for surgery. Preferably male mice should be used since unpublished data from our lab suggest that estrogen receptor signa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors acknowledge all colleagues who made this work possible; Ann Demarré, Veerle Laurysens, Jan De Jonge and Erik Quartier for technical assistance. Financial support was from the VUB Research Council, the Institute for the Promotion of Innovation by Science and Technology in Flanders (IWT), the Beta Cell Biology Consortium (BCBC), the Fund for Scientific Research Flanders (FWO), Diabetes Onderzoek Nederland (DON) and Interuniversity Attraction Pole (IAP).

Materials

Supplies for preparation area 
Hibiscrub  Regent Medical 5601IE5F11 Chlorhexidin diglucon
Ketamin Ceva BE-V202526 anesthesia
Rompun(2%) (Xylazin) Bayer BE-V041815 anesthesia
Duratears Alcon 34335-8 ointment for eyes
Razor
Supplies for surgical area 
Leica Operating microscope Leica 10446320
Hot bead sterilizer Fine Science Tools (FST) 18000-45
autoclaved surgical instruments Fine Science Tools (FST)
Recirclulating water heating pad Gaymar Industries, Inc. TP702
Adhesive OP-towel BARRIER 706500-07
OP-tape BARRIER 381035-00
Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) Lohmann&Rauscher International 35968
Mini Plasco 0,9% NaCl solution B.BRAUN 3521680
6-0 prolene suture Ethicon 8706H
4-0 polyglycol suture Ethicon SL-607
Supplies for recovery area
Paper bedding (paper towel)
Vetergesic ecuPhar BE-V342955
Materials for analysis
Taqman Ngn3 primer Integrated DNA technologies Mm.PT.56a.33574796.gs
Taqman CycloA primer Integrated DNA technologies Mm.PT.39a.2.gs
anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) Cell Signaling 5A1E
anti-mouse/rat Ki67 antibody eBioscience 14-5698-82
monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) Sigma 085K4889
anti-rat Cytokeratin 19  DSHB
monoclonal Mouse anti-BrdU Dako M0744
Hoechst Sigma 33342

References

  1. Shaw, J. E., Sicree, R. A. Global estimates of the prevalence of diabetes for. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
  2. Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2·7 million participants. Lancet. 378, 31-40 (2011).
  3. Borowiak, M., Melton, D. A. How to make beta cells. Current opinion in Cell Biology. 21, 727-732 (2009).
  4. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 1607-1611 (2000).
  5. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, 2447-2457 (2002).
  6. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429, 41-46 (2004).
  7. Teta, M., Rankin, M. M., Long, S. Y., Stein, G. M., Kushner, J. A. Growth and regeneration of adult beta cells does not involve specialized progenitors. Dev Cell. 12, 817-826 (2007).
  8. Bonner-Weir, S. Perspective: Postnatal pancreatic beta cell growth. Endocrinology. 141, 1926-1929 (2000).
  9. Brennand, K., Huangfu, D., Melton, D. All beta cells contribute equally to islet growth and maintenance. PLoS Biol. 5, e163 (2007).
  10. Salpeter, S. J., Klein, A. M., Huangfu, D., Grimsby, J., Dor, Y. Glucose and aging control the quiescence period that follows pancreatic beta cell replication. Development. 137, 3205-3213 (2010).
  11. Xu, X., et al. Beta cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse pancreas. Cell. 132, 197-207 (2008).
  12. Wang, R. N., Kloppel, G., Bouwens, L. Duct- to islet-cell differentiation and islet growth in the pancreas of duct-ligated adult rats. Diabetologia. 38, 1405-1411 (1995).
  13. Yasuda, H., et al. Cytokine expression and induction of acinar cell apoptosis after pancreatic duct ligation in mice. Journal of interferon, & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 19, 637-644 (1999).
  14. Van Gassen, N., et al. Macrophage dynamics are regulated by local macrophage proliferation and monocyte recruitment in injured pancreas. European journal of immunology. , (2015).
  15. Van de Casteele, M., et al. Neurogenin 3+ cells contribute to beta-cell neogenesis and proliferation in injured adult mouse pancreas. Cell Death Dis. 4, e523 (2013).
  16. Xiao, X., et al. No evidence for beta cell neogenesis in murine adult pancreas. The Journal of clinical investigation. 123, 2207-2217 (2013).
  17. Ackermann Misfeldt, A., Costa, R. H., Gannon, M. Beta-cell proliferation, but not neogenesis, following 60% partial pancreatectomy is impaired in the absence of FoxM1. Diabetes. 57, 3069-3077 (2008).
  18. Lee, C. S., De Leon, D. D., Kaestner, K. H., Stoffers, D. A. Regeneration of pancreatic islets after partial pancreatectomy in mice does not involve the reactivation of neurogenin-3. Diabetes. 55, 269-272 (2006).
  19. Bonner-Weir, S., Sharma, A. Pancreatic stem cells. The Journal of pathology. 197, 519-526 (2002).
  20. Nir, T., Melton, D. A., Dor, Y. Recovery from diabetes in mice by beta cell regeneration. The Journal of clinical investigation. 117, 2553-2561 (2007).
  21. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85, 1255-1270 (2005).
  22. Wang, S., et al. Neurog3 gene dosage regulates allocation of endocrine and exocrine cell fates in the developing mouse pancreas. Developmental biology. 339, 26-37 (2010).
  23. Pan, F. C., et al. Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration. Development. 140, 751-764 (2013).
  24. Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
  25. Wang, S., et al. Sustained Neurog3 expression in hormone-expressing islet cells is required for endocrine maturation and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9715-9720 (2009).
  26. Kopinke, D., et al. Lineage tracing reveals the dynamic contribution of Hes1+ cells to the developing and adult pancreas. Development. 138, 431-441 (2011).
  27. Rankin, M. M., et al. beta-Cells are not generated in pancreatic duct ligation-induced injury in adult mice. Diabetes. 62, 1634-1645 (2013).
  28. Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
  29. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43, 34-41 (2011).
  30. Van de Casteele, M., et al. Partial duct ligation: beta-cell proliferation and beyond. Diabetes. 63, 2567-2577 (2014).
  31. Zhang, J., Rouse, R. L. Histopathology and pathogenesis of caerulein-, duct ligation-, and arginine-induced acute pancreatitis in Sprague-Dawley rats and C57BL6 mice. Histology and histopathology. 29, 1135-1152 (2014).
  32. Martinez-Romero, C., et al. The epigenetic regulators Bmi1 and Ring1B are differentially regulated in pancreatitis and pancreatic ductal adenocarcinoma. The Journal of pathology. 219, 205-213 (2009).
  33. Prevot, P. P., et al. Role of the ductal transcription factors HNF6 and Sox9 in pancreatic acinar-to-ductal metaplasia. Gut. 61, 1723-1732 (2012).

Play Video

Cite This Article
De Groef, S., Leuckx, G., Van Gassen, N., Staels, W., Cai, Y., Yuchi, Y., Coppens, V., De Leu, N., Heremans, Y., Baeyens, L., Van de Casteele, M., Heimberg, H. Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation. J. Vis. Exp. (102), e52765, doi:10.3791/52765 (2015).

View Video