Introduction
المؤشرات الحيوية التي تم الحصول عليها من دم توفر المفيد التشخيص، التنبؤية، وتقسيمها التدابير في سياقات السريرية عديدة، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية 1، علوم السرطان 2، والمرض النفسي 3. أنها يمكن أن تستخدم أيضا في مجال العلوم الأساسية لتقييم "الدولة" للكائن الحي، بما في ذلك درجة من الجوع، والتهاب، أو الإجهاد الحاضر. يمكن أن تتأثر هذه التدابير من قبل المتغيرات التي قد تكون أو لا تكون حاسمة لمسألة الفائدة، بما في ذلك الوقت من اليوم الذي يتم الحصول على العينة ونوع الجنس من الموضوعات. ويمكن أيضا أن تتأثر من قبل الاجهاد الناجم خلال إجراءات أخذ عينات الدم نفسها. يمكن أن هرمونات التوتر والشعور بالألم يغير بسرعة تكوين الدم.
القوارض هي الحيوانات المختبرية الأكثر شيوعا، ولقد تم تطوير أساليب متعددة لجمع الدم. الأسلوب الأمثل لأخذ عينات الدم يجب أن يكون الحد الأدنى الفيزيولوجيتأثير لتر على الحيوان، لا تحتاج إلى تخدير، والسماح أخذ العينات سريعة ومتكررة، وتوفير حجم الدم الكافي للعديد من التطبيقات المصب. تقنيات شعبية لجمع الدم مثل قسطرة للحبل الوريد أو بتر ذيل طرف لا تلبي هذه المعايير.
والهدف من هذا البروتوكول هو لوصف تقنية اخذ عينات من الدم لاستخدامها في الفئران التي هي مرهقة الحد الأدنى، لا تتطلب التخدير، ويسمح لمجموعات الدم متعددة ضمن موضوع واحد، ويوفر حجم عينة كبيرة نسبيا بحيث فحوصات متعددة يمكن أداؤها على عينة واحدة. والهدف من هذه الطريقة هو الحصول على عينات الدم التي تتأثر الحد الأدنى من الاستجابة للضغط النفسي الحاد.
Protocol
وقد أجريت التجارب باستخدام كل الذكور البالغين لونغ إيفانس الفئران. وكانت جميع الإجراءات وفقا لالمعاهد الوطنية الأميركية للصحة (NIH) دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام من معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا ورعاية الحيوان ومكتب مراجعة استخدام وUSAMRMC.
1. إعداد
- Heparinise القسطرة والمحاقن عن طريق وضع إبرة محمية في 500 أنبوب ميكرولتر تحتوي على الهيبارين (USP 1000 وحدة / مل) ثم الشفط وطرد حل الهيبارين عن طريق إبرة.
- إرفاق القسطرة فراشة للحقنة. الحفاظ على الدرع خلال إبرة القسطرة لحماية طرف حاد من التلف.
- سحب وحدة من الهيبارين التي هي أكبر قليلا من حجم الدم التي سيتم جمعها. فصل حقنة وملئه بالهواء.
- إعادة إرفاق المحقنة إلى القسطرة واستخدامالهواء لطرد حل الهيبارين الزائد. ضمان تتبع فقط تبقى المبالغ في الأنابيب، والإبرة، والمحاقن.
- وضع القسطرة العقيمة، مع الحقنة لا تزال تعلق، على سطح معقم.
- تأمين بسرعة الفئران في قطعة قماش نظيفة ضمان fore- وhindpaws هي في وضع مريح وتنفس غير مقيد.
- تأمين التفاف مع هوك وحلقة الشريط. تأكد من أن الأعضاء التناسلية الخارجية لا تتقلص.
- هل لديك مساعد بلطف وكبح جماح بحزم الفئران (البطن وقاعدة الذيل) على سطح العمل الصلبة مع ذيل شنقا قبالة حافة العداد.
أخذ العينات 2. الدم
- تزج الذيل في 42 ° C الماء لمدة 40-50 ثانية لتمدد الأوعية الدموية وتجف الذيل مع منشفة ورقية. تحديد موقع الوريد الذيل إلى أن نزفت (تدوير الجسم كله مع الذيل لمنع التواء الذيل).
ملاحظة: الاحترار كاف من الذيل هو أمر حاسم لcollectio السريعن لعينة الدم. إذا تم مقيدة الأوعية الدموية، تحديد المكان المناسب للقسطرة أمر صعب، ويقل تدفق الدم إلى حد كبير. وسادة التدفئة يمكن أن تستخدم كبديل للمياه الغمر. - تحديد نقطة أخذ العينات.
ملاحظة: الشريان تقع على طول الجانب منتصف الظهري من الذيل. لا تستخدم هذا لأخذ العينات.- استهداف إما أوردة الذيل اليسار واليمين التي تكمن الوحشي للشريان. تصبغ الذيل، والذي يختلف من التوتر ويزيد مع التقدم في السن، قد تخفي بعض الأوعية الدموية. استهداف جزء من الوريد في الجزء السفلي من الذيل.
- مسح المنطقة المستهدفة مع 2٪ الكلورهيكسيدين محلول مطهر.
- خلق ضغط سلبي في حقنة والقسطرة عن طريق سحب الغواص من الصفر إلى ما يقرب من 50 ميكرولتر.
- عقد ذيل بلطف وبحزم بالقرب من الحافة للحفاظ على الذيل مباشرة في جميع أنحاء جمع العينات. ضمان تدفق الدم لا المغطي من قبل قبضة ضيقة للغاية.
- إدراج ببطء قسطرة في الوريد بزاوية حادة حوالي 5 سم من طرف الذيل. عندما يتم اختراق الوريد، وتدفق الدم إلى القسطرة. سحب ببطء المكبس من حقنة لجمع الصوت المطلوب بمعدل ثابت (~ 20 ميكرولتر لكل ثانية).
- التشاور مع الموظفين البيطريين للحصول على معلومات حول حجم الدم الأقصى التي يمكن جمعها. الحد الأقصى لمقدار الدم الذي ينبغي جمع يعتمد على الوزن والحالة الصحية من الفئران. لا تسحب أكثر من 15٪ من إجمالي حجم الدم في فترة 14 يوم.
ملاحظة: الدم هو أكثر بكثير من الصعب جمع من الحيوانات التي جرى التشديد تماما في الدقائق السابقة لجمع العينات لأن هرمونات التوتر انقباض الأوعية الدموية. على سبيل المثال، نقل قفص المنزل فأر إلى غرفة جديدة، مع عدة دقائق للالتفاف الحيوان، أو الإدراج المتكرر لقسطرة في الوريد من المحتمل أن تحدث استجابة للضغوط الحادة جميع. - تسهيل الدم ..تدفق د كتبها 'حلب' الوريد. تشغيل الاصبع على طول الوريد، من القاعدة نحو طرف الذيل، ولكن يبقى أكثر من 2 سم من غيض من إبرة أو القسطرة قد تصبح طردت من الوريد.
- إذا الدم لا يمكن جمعها بنجاح من موقع الأولي من اختراق القسطرة، إعادة ادخال الإبرة في أعلى الوريد. إذا تم جمع الدم في موقع الأولي، وإعادة الضغط على إبرة عن طريق قطع وثم إعادة توصيل القسطرة والمحاقن مسبقة لإعادة الإدراج في الوريد. بشكل عام، وتجنب الاختراقات إضافية.
- كما اختراقات متعددة يمكن أن يسبب انهيار الوريد الذيل، التي يتم فيها قطع وصول الدم الى الذيل قبالة والأنسجة الرخوة ذيل يصبح necrotized، الموت ببطء الفئران إذا كان هناك ذيل انهيار الوريد.
- التشاور مع الموظفين البيطريين للحصول على معلومات حول حجم الدم الأقصى التي يمكن جمعها. الحد الأقصى لمقدار الدم الذي ينبغي جمع يعتمد على الوزن والحالة الصحية من الفئران. لا تسحب أكثر من 15٪ من إجمالي حجم الدم في فترة 14 يوم.
- عندما يتم جمعها حجم العينة المناسب، والإفراج عن الضغط في حقنة عن طريق قطع وإعادة توصيل القسطرة. نضح باستخدام قليلا على المكبس حقنة (~ 50 & #181؛ ل)، وسحب الإبرة من الوريد.
ملاحظة: إذا تم سحب الإبرة دون الإفراج عن أول الضغط في الحقنة، والدم يتقطر من الإبرة. - تطبيق لفترة وجيزة الضغط على الموقع الإدراج لوقف النزيف، ومسح المنطقة بمحلول مطهر. عودة الفئران إلى قفص وطنه.
3. تجهيز عينة من الدم
- نضح الهواء لضمان عدم بقاء أي الدموية داخل إبرة القسطرة، واستخدام المقص لقطع أنابيب القسطرة فوق الإبرة. طرد الدم إلى العقيمة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
ملاحظة: إذا تم دفع الدم من خلال إبرة، قد يسبب قوة القص خلايا الدم الحمراء للتمزق التي يمكن أن تتداخل مع العديد من المقايسات المصب. إزالة الإبرة لتجنب انحلال الدم.- لجمع بلازما الدم، وأنابيب استخدام التي تحتوي على EDTA كمضاد للتجلط (هنا، استخدم 10 ميكرولتر من 0.1 M EDTA عن 200-400 ميكرولتر من الدم؛ وضمان تركيز EDTA المستخدمة لا تتدخل ثإيث فحص المصب) ومكان على الجليد.
- تدور عينات دم كاملة في 2100 x ج في أجهزة الطرد المركزي المبردة (4 درجة مئوية) لمدة 10 دقيقة في غضون 10 دقيقة من جمع. أزل البلازما، وتجنب إزعاج طبقات خلايا الدم الحمراء والبيضاء.
- لجمع عينات من مصل الدم، وعينات من المكان (دون تخثر) في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 30 دقيقة لتمكين التخثر. تدور أنابيب جمع في أجهزة الطرد المركزي المبردة (4 ° C) في 2000 ز س. ويمكن بعد ذلك مزال المصل.
- لجمع بلازما الدم، وأنابيب استخدام التي تحتوي على EDTA كمضاد للتجلط (هنا، استخدم 10 ميكرولتر من 0.1 M EDTA عن 200-400 ميكرولتر من الدم؛ وضمان تركيز EDTA المستخدمة لا تتدخل ثإيث فحص المصب) ومكان على الجليد.
- استخدام العينات على الفور، أو تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة سنة واحدة.
Representative Results
بلازما الدم التي تم جمعها من الوريد الذيل الأفقي كما هو موضح في البروتوكول يعطي عينة البلازما التي كانت شفافة والأصفر الشاحب في المظهر. كما هو مبين في الشكل 1، انحلال الدم في عينة يضفي صبغة حمراء لالبلازما. الاستجابة للضغط النفسي الحاد يمكن أن يغير بسرعة تكوين الدم. على سبيل المثال، يمكن تعميم تركيز الكورتيزون تزيد بشكل ملحوظ في غضون 10 دقيقة من التعرض للإجهاد، كما هو مبين في الشكل (2). المستويات القاعدية المنخفضة للكورتيزون التي تم الحصول عليها مع هذا الأسلوب قبل الضغوطات التعرض تكشف عن أن إجراءات أخذ العينات في حد ذاته ليس مصدرا هاما من مصادر التوتر.
الشكل 1: يظهر مظهر نموذج (A) عينة hemolyzed. بعد الطرد المركزي، البلازما أو مصل طبقة (سطح تدل عليه AR الأسودصف) يبدو مشوبة مع الوردي أو الأحمر. الصبغات الداكنة تشير إلى مستويات أعلى من انحلال الدم. (B) بعد الطرد المركزي، وعينة تم جمعها بشكل صحيح يكون واضحا، والمظهر مصفر إلى الشريط العلوي (السطح الذي يشير إليه السهم الأسود)، والتي تتطابق مع البلازما غير hemolyzed أو مصل. عند إزالة هذه الطبقة، فمن المهم أن لا تخل الدم الكامل الأساسي، إما عن طريق دفع غيض ماصة في طبقة الدم الكامل أو عن طريق الشفط من الدم كله إلى الحافة. يجب التخلص من أي البلازما أو مصل ملوثة بالدم كله.
الشكل 2: مرتفعة كورتيزون البلازما بسرعة بعد تجربة مرهقة تم الحصول على الدم من الوريد الذيل الأفقي من الإناث البالغات الفئران الطويل ايفانز قبل و10 دقيقة بعد التعرض ل4 نغمات (10 ثانية و 2 كيلو هرتز، 85 ديسيبل) المشارك إنهاء. مع فوtshocks (1 ثانية، و 350 أمبير). كان كورتيزون بلازما الدم في الأساس (290.4 ± 138.8 غ / مل) أقل بكثير من احظت مستويات 10 دقيقة بعد عرض الإجهاد footshock (2204.8 ± 454.5 غ / مل، ص = 0.02، ن = 4)، على النحو الذي يحدده ر تقرن -test. *، P <0.05
Discussion
هنا، نحن تصف الإجراء سريع وبسيط للحصول على عينة من الدم من الفئران التي تقدم مزايا هامة على التقنيات الأخرى المستخدمة بشكل شائع. أولا، أنها لا تتطلب التخدير، على النقيض من أخذ العينات من حبل الوريد أو الجيوب الأنفية retroorbital. عندما يتم جمع عينات الدم المحيطة الإجراءات السلوكية، إدارة التخدير غير مرغوب فيها لأنها يمكن أن تتداخل مع التعلم والذاكرة 4،5. ثانيا، لأنه يتيح القدرة على جمع كميات أكبر من الدم تقنيات بزل الوريد أخرى، مثل جمع من الأوردة دواسة الصافن أو الظهرية. باستخدام تقنية الموضحة هنا، ما يصل الى 1.5 مل من الدم يمكن جمعها من الفئران عند نقطة زمنية واحدة، وبلغ حجم التداول الذي يسمح بسهولة فحوصات متعددة ليتم تشغيلها في نفس الوقت. أخيرا، هذا الإجراء يقلل من احتمال حدوث ضرر الأنسجة مقارنة بتر ذيل طرف أو نزيف retroorbital. استخدام هذا الإجراء يسهل الامتثال لW الحيوانقانون elfare ودليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، والتي تتطلب التقليل من الألم والمعاناة التي تنجم عن الإجراءات المخبرية التي أجريت على الحيوانات.
فمن المستحسن أن المحققين جديد إلى هذا الأسلوب ممارسة أساليب ضبط النفس والذيل النزيف من أجل تقليل الوقت الذي يتم تقييد حيوانات التجارب. الدم التي تم جمعها في أقل من 3 دقائق من بدء ضبط النفس ويوفر أفضل النتائج.
بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لأخذ عينات 1-4 مرات في الأسبوع، ولكن ليس أكثر من مرتين في اليوم الواحد. بينما مجموعات الدم المتكرر يمكن القيام بها، ومواقع أخذ العينات المختلفة تتحرك صعودا من قاعدة الذيل يجب استخدام، ويجب أن يكون بالتناوب الأوردة ذيل اليسار واليمين كمواقع أخذ العينات. حجم الدم الكلي من القوارض 6-7٪ من وزن الجسم، ويجب أن تجمع ما لا يزيد عن 15٪ من حجم الدم الكلي خلال فترة أسبوع 2. مصل الدمأو يضم البلازما حوالي 40-60٪ من حجم العينة التي تم جمعها.
اخذ عينات من الدم عبر الأوردة الذيل الأفقي ويمكن أيضا أن يؤديها في الماوس كما هو موضح هنا مع بعض التعديلات الطفيفة. أولا، يمكن استخدام مقياس صغير فقط (27 G) القسطرة. الثانية، فمن المستحسن استخدام رادع أنبوب، بدلا من التفاف، لشل حركة الفئران. حجم الدم التي يمكن الحصول عليها من الماوس باستخدام بزل الوريد من حزمة الأوعية الدموية تحت الفك السفلي (200-500 ميكرولتر) أكبر مما يمكن جمعها بأمان من الوريد ذيل (200 ميكرولتر كحد أقصى). لأن أخذ عينات الدم من الحزمة الوعائية تحت الفك السفلي يتطلب الحد الأدنى من ضبط النفس وربما تسفر عن المزيد من الدم، وهذا هو الطريق المفضل لأخذ العينات في الماوس.
والسرعة التي قد يتم تنفيذ هذا الإجراء، جنبا إلى جنب مع طبيعته الغازية الحد الأدنى، كما يقلل من الاضطراب المحتملة للتدابير القائمة على الدم عن طريق الاستجابة للضغط النفسي الحاد 6. الالاستجابة للضغط النفسي الحاد يمكن أن يغير مستويات تداول العديد من الجزيئات، بما في ذلك المحفزة وغيرها من عوامل المناعة النشطة 7، الهرمونات من محور الغدة النخامية، الغدة الكظرية 8، الهرمونات في الجهاز العصبي الودي 9، جريلين 10، الأفيونيات الذاتية 11، الدوبامين، و السيروتونين 12. وإذا رغبت يستريح تعميم تدابير من هذه الجزيئات أو غيرها التي تنظمها هذه الجزيئات، فمن المهم للحد من الاستجابة للضغط النفسي، والتي يتم تشغيلها ضمن اقل من دقيقة من بداية التعرض للإجهاد.
استجابات التوتر لا يغير فقط في تكوين الدم، ولكن أيضا تمثل عقبة فنية لأخذ عينات الدم بسبب انقباض الأوعية الدموية عن طريق زيادة الدافع من الجهاز العصبي الودي. يصبح من الصعب الحصول على زيادة تدفق الدم ثابتا من الفئران التي شن الاستجابة للضغط النفسي الحاد. لذلك، يجب أن تكون الشدة الحيوان قطرةأوتوماتيكية من أجل الحصول بسرعة العينات التي تعكس الحالة الفسيولوجية للاهتمام.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر فرجينيا دوهرتي وJunmei ياو لتقديم المساعدة التقنية. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل NIMH (R01 MH084966)، ومكتب أبحاث الجيش الأمريكي وكالة مشاريع أبحاث الدفاع المتقدمة (منح W911NF-10-1-0059) إلى KAG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin (1,000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor rinse-chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1 cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500 ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, 0.75 in width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
- Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction. Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).
- Shah, R., et al. Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).
- Chan, M. K., et al. Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders. Prog Neurobiol. , (2014).
- Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents. PLoS One. 7 (12), e51431 (2012).
- Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats. Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).
- Vahl, T. P., et al. Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).
- Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress. Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).
- McEwen, B. S. Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators. Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).
- Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress. Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).
- Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear. Mol Psychiatry. , (2013).
- Knoll, A. T., Carlezon, W. A. Dynorphin, stress, and depression. Brain Res. 1314 (56-73), (2010).
- Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder. Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).
