Introduction
Biomarkers verkregen uit bloed bieden nuttige diagnostische, voorspellende en stratificatie maatregelen in vele klinische context, met inbegrip van hart-en vaatziekten 1, kanker wetenschappen 2, en psychiatrische ziekte 3. Zij kunnen ook worden gebruikt met het fundamenteel onderzoek naar de "toestand" van een organisme te bepalen, inclusief de mate van honger, ontsteking of spanning aanwezig. Dergelijke maatregelen kunnen worden beïnvloed door variabelen die al dan niet kritisch voor de kwestie van belang, zoals de tijd dat het monster wordt verkregen en het geslacht van de patiënten te zijn. Het kan ook worden beïnvloed door stress geïnduceerd tijdens de procedures bloedafname zelf. Hormonen en de pijnperceptie kan snel veranderen de samenstelling van het bloed.
Knaagdieren zijn de meest gebruikte proefdier en meerdere methoden ontwikkeld voor bloedafname. De ideale methode van bloedafname moet minimaal Physiologica hebbenl invloed op het dier, vereisen geen verdoving, laat een snelle en herhaalde bemonstering en voldoende bloedvolume voor tal van downstream-toepassingen. Populaire technieken voor het verzamelen van bloed, zoals catheterisatie van de halsader of staartpunt amputatie niet aan deze criteria.
Het doel van dit protocol is een bloedafname techniek gebruiken concentratie bij ratten die minimaal stress, ofwel verdoving vereist, maakt meerdere bloedafnames op één onderwerp, en verschaft een relatief groot monstervolume, zodat meerdere assays kunnen worden uitgevoerd op een enkel monster. Het doel van deze methode is om bloedmonsters die minimaal worden beïnvloed door de acute stressreactie verkrijgen.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd met volwassen mannelijke Long-Evans ratten. Alle procedures waren in overeenstemming met de Amerikaanse National Institutes of Health (NIH) Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Massachusetts Institute of Technology en de Animal Care en gebruik Beoordeling Office of de USAMRMC.
1. Voorbereiding
- Heparinise de catheter en spuit door het plaatsen van de beschermde naald in een 500 pl buis met heparine (1000 USP eenheden / ml) en vervolgens opzuigen en uitstoten heparineoplossing door de naald.
- Bevestig een vlinder katheter aan de spuit. Houd het schild over de naald van de katheter aan de scherpe punt te beschermen tegen schade.
- Intrekken hoeveelheid heparine die iets groter is dan het volume van bloed dat wordt opgevangen. Maak de spuit en vul deze met lucht.
- Re-bevestig de spuit aan de catheter en gebruik delucht om overtollig heparine oplossing te verdrijven; garanderen dat alleen sporen achterblijven in de buis, naald en spuit.
- Plaats de steriele katheter, met de spuit nog steeds verbonden, op een steriel oppervlak.
- Snel zet de rat in een schone doek ervoor te zorgen dat de voor- en achterpoten zijn in een comfortabele positie en de ademhaling is onbeperkt.
- Zet de wrap met klittenband; ervoor te zorgen dat de uitwendige geslachtsorganen niet worden vernauwd.
- Laat een helper voorzichtig en stevig beteugelen van de rat (buik en de basis van de staart) op een solide werk oppervlak met de staart opknoping van de rand van de teller.
2. Blood Sampling
- Dompel de staart in 42 ° C water gedurende 40-50 sec aan de bloedvaten verwijden en droog de staart met een papieren handdoek. Zoek de staart ader te worden ontlucht (draai het hele lichaam met de staart om te voorkomen dat het verdraaien van de staart).
Opmerking: Voldoende opwarming van de staart is van cruciaal belang voor de snelle Collection van een bloedmonster. Als de vasculatuur wordt vernauwd, juiste plaatsing van de katheter is lastig, en de bloedstroom wordt sterk verminderd. Een verwarmingselement kan worden gebruikt als alternatief voor onderdompeling in water. - Identificeer het bemonsteringspunt.
Opmerking: De slagader ligt langs de mid-dorsale aspect van de staart; Gebruik dit niet voor bemonstering.- Richt de linker en rechter staartaders die lateraal van de slagader liggen. Pigmentatie van de staart, die verschilt per stam en stijgt met de leeftijd, kunnen obscure deel van het vaatstelsel. Target een gedeelte van de ader in het onderste gedeelte van de staart.
- Veeg het doelgebied met 2% chloorhexidine antiseptische oplossing.
- Maak onderdruk in de spuit en catheter door terugtrekken van de zuiger van nul tot ongeveer 50 pl.
- Houd de staart zacht en stevig in de buurt van de tip om de staart recht gehele monstername houden. Zorg ervoor dat de bloedstroom niet wordt afgesloten door een te strakke grip.
- Langzaam steek de katheter in de ader onder een kleine hoek van ongeveer 5 cm vanaf de punt van de staart. Als de ader is doorgedrongen, zal bloed vloeien in de katheter. Trekken langzaam de zuiger van de spuit om het gewenste volume bij een constante snelheid te verzamelen (~ 20 ul per sec).
- Raadpleeg de veterinaire personeel voor informatie over de maximale bloed volume dat kan worden verzameld. De maximale hoeveelheid bloed die moeten worden verzameld is afhankelijk van het gewicht en de gezondheidstoestand van de rat. Niet trekken meer dan 15% van het totale volume bloed in een periode van 14 dagen.
Opmerking: Bloed is veel moeilijker te verzamelen van dieren die acuut werden benadrukt in de minuten voorafgaand aan de collectie proeven omdat stresshormonen vernauwen de bloedvaten. Bijvoorbeeld: door de rat kooi op een nieuwe kamer, waarbij een aantal minuten aan het dier of herhaalde insertie van de catheter verpakken in een ader zijn waarschijnlijk een acute stressreactie veroorzaken. - Vergemakkelijken blood stroom door 'melken' de ader. Voer een vinger langs de lengte van de ader van de basis naar de punt van de staart, maar nog meer dan 2 cm vanaf de punt van de ingebrachte naald of de katheter kan losraken van de ader worden.
- Als het bloed niet met succes kan worden verzameld uit de eerste plaats van de katheter penetratie, opnieuw steek de naald verder de ader. Als er bloed werd verzameld op de eerste plaats, opnieuw onder druk van de naald door het loskoppelen en vervolgens weer aansluiten van de katheter en de injectiespuit voorafgaand aan de re-integratie in de ader. In het algemeen, vermijd extra penetraties.
- Zoals meerdere penetraties staartader instorting, waarbij de bloedtoevoer naar de staart wordt afgesneden en het zachte staart weefsel raakt necrotized kan veroorzaken, euthanaseren de rat als er staartader instorten.
- Raadpleeg de veterinaire personeel voor informatie over de maximale bloed volume dat kan worden verzameld. De maximale hoeveelheid bloed die moeten worden verzameld is afhankelijk van het gewicht en de gezondheidstoestand van de rat. Niet trekken meer dan 15% van het totale volume bloed in een periode van 14 dagen.
- Wanneer adequaat monster volume wordt verzameld, laat de druk in de spuit door het loskoppelen en opnieuw aansluiten van de katheter. Zuig licht via de zuigerstang (~ 50 & #181; l), en de naald uit de ader te trekken.
Let op: Als de naald wordt ingetrokken zonder eerst de druk vrijgeven in de spuit, zal bloed druppelen van de naald. - Kort druk uitoefenen op de plaats van inbrengen om het bloeden te stoppen, en veeg het gebied met antiseptische oplossing. Zet de rat aan zijn kooi.
3. Verwerking Het bloedmonster
- Zuig lucht om ervoor te zorgen geen bloed blijft in de katheter naald, en gebruik een schaar om de katheter buis te snijden net boven de naald. Verdrijf het bloed in een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis.
Opmerking: Als er bloed wordt geduwd door de naald, kan de afschuifkracht rode bloedcellen veroorzaken scheuren die kunnen interfereren met vele downstream assays. Verwijder de naald om hemolyse te vermijden.- Verzamelen bloedplasma, gebruik buizen die EDTA bevatten als antistollingsmiddel (hier gebruikt 10 pl 0,1 M EDTA 200-400 gl bloed, waarborgen de concentratie van EDTA die niet interfereert wet de downstream-test) en plaats op ijs.
- Spin volbloedmonsters bij 2100 xg in een gekoelde centrifuge (4 ° C) gedurende 10 min op 10 min verzameld. Elueer het plasma, het vermijden van verstoring van de rode en witte bloedcellen lagen.
- Om bloedserum, plaats monsters (zonder antistollingsmiddel) bij kamertemperatuur verzamelen tot 30 minuten om stolling te schakelen. Draai de verzamelbuizen in een gekoelde centrifuge (4 ° C) bij 2000 x g. Het serum kan vervolgens worden geëlueerd.
- Verzamelen bloedplasma, gebruik buizen die EDTA bevatten als antistollingsmiddel (hier gebruikt 10 pl 0,1 M EDTA 200-400 gl bloed, waarborgen de concentratie van EDTA die niet interfereert wet de downstream-test) en plaats op ijs.
- Gebruik monsters direct, of op te slaan bij -80 ° C gedurende maximaal een jaar.
Representative Results
Bloedplasma vanuit het laterale staartader zoals beschreven in het protocol geeft een plasmamonster dat doorzichtig en lichtgeel uiterlijk was. Zoals getoond in figuur 1, hemolyse in een monster verleent een rode tint aan het plasma. De acute stress respons kan snel veranderen van de samenstelling van het bloed. Bijvoorbeeld kan circuleren corticosteron concentratie duidelijke verhoging op 10 min van blootstelling stressor, zie figuur 2. De lage basale niveaus van corticosteron met deze werkwijze verkregen vóór blootstelling stressor onthullen dat de bemonsteringsprocedure zelf geen belangrijke bron van stress.
Figuur 1:. Monster uiterlijk (A) Een gehemolyseerd monster weergegeven. Na centrifugeren, het plasma of serum layer (oppervlak aangegeven met de zwarte arrij) verschijnt getint met roze of rood. Donkere tinten geven een grotere mate van hemolyse. (B) Na centrifugeren wordt een correct verzamelde monster een heldere, gelige uiterlijk aan de bovenste band (vlak aangegeven met de zwarte pijl), dat overeenkomt met de niet gehemolyseerde plasma of serum heeft. Bij het verwijderen van deze laag is het belangrijk om de onderliggende volbloed niet verstoren, ofwel door op de pipetpunt in het geheel bloed laag of door opzuigen enkele volbloed in de punt. Elke plasma of serum verontreinigd met volbloed moet worden weggegooid.
Figuur 2: plasma corticosteron wordt snel verhoogd na een stressvolle ervaring Bloed werd verkregen van de laterale staartader van volwassen vrouwelijke Long-Evans ratten voor en 10 minuten na blootstelling aan 4 tonen (10 sec, 2 kHz, 85 dB) co-eindigend. met footshocks (1 sec, 350 uA). Bloedplasma corticosterone bij aanvang (290,4 ± 138,8 pg / ml) was significant lager dan de niveaus waargenomen 10 minuten na de indiening van de voetschok stress (2204,8 ± 454,5 pg / ml, p = 0,02, n = 4), zoals vastgesteld door gepaarde t -test. *, P <0,05
Discussion
We beschrijven hier een snelle en eenvoudige werkwijze voor het verkrijgen van een bloedmonster uit een rat die aanzienlijke voordelen boven andere gebruikelijke technieken biedt. Ten eerste is het niet verdoving, in tegenstelling bemonstering van jugulaire ader of retro-orbitale sinus. Toediening van anesthetica wanneer bloedmonsters worden verzameld rond gedragsproblemen procedures is ongewenst omdat het kan interfereren met leren en geheugen 4,5. In de tweede plaats biedt de mogelijkheid om grotere volumes bloed dan andere venapunctie technieken, zoals het verzamelen van de vena of dorsale pedaal aders verzamelen. Met behulp van de hier beschreven techniek tot 1,5 ml bloed kan worden verzameld bij een rat op één tijdstip, een volume dat gemakkelijk kunnen meerdere assays parallel worden uitgevoerd. Tot slot, deze procedure minimaliseert de kans op weefselschade in vergelijking met staartpunt amputatie of retro-orbitale bloeden. Het gebruik van deze procedure vergemakkelijkt naleving van de Animal Welfare Act en de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren, die vereist het minimaliseren van de pijn en het leed dat het gevolg zijn van het laboratorium procedures uitgevoerd op dieren.
Het wordt aanbevolen dat de onderzoekers nieuwe aan deze methode de praktijk van de terughoudendheid en de staart bloeden technieken om de tijd die proefdieren zijn terughoudend te minimaliseren. Bloed in minder dan 3 min verzameld uit de inleiding van terughoudendheid zorgt voor optimale resultaten.
De hier beschreven protocol kan worden gebruikt voor het bemonsteren van 1-4 maal per week, maar niet meer dan twee keer per dag. Terwijl herhaalde bloed collecties kan worden uitgevoerd, moet de verschillende bemonsteringsplaatsen naar boven beweegt vanaf de basis van de staart worden gebruikt, en de linker en rechter staart aderen moet worden afgewisseld als sampling sites. De totale bloedvolume van knaagdieren is 6-7% van hun lichaamsgewicht, en maximaal 15% van het totale bloedvolume te innen binnen 2 weken. Serumof plasma omvat circa 40-60% van het verzamelde monster volume.
Bloedafname via de laterale staartaders kunnen ook in de muis worden uitgevoerd zoals hier beschreven, met enkele kleine modificaties. Ten eerste mag slechts kleine gauge (27 G) katheters worden gebruikt. Ten tweede, is het aanbevolen om een buis restrainer, in plaats van een wikkel, om de muizen te immobiliseren. De hoeveelheid bloed die kunnen worden verkregen uit de muizen met behulp van de venapunctie submandibular vaatbundels (200-500 ul) groter is dan veilig kan worden verzameld uit de staartader (200 pi maximum). Omdat bemonstering bloed uit de submandibulaire vaatbundel vereist minimale beperking en kunnen meer bloed geven, dit is de aangewezen route voor bemonstering in de muis.
De snelheid waarmee deze procedure kan worden uitgevoerd, dat ook een minimaal invasieve aard, minimaliseert tevens het potentieel verstoring van bloedtests maatregelen door de acute stressreactie 6. Deacute stressreactie kan veranderen circulerende niveaus van vele moleculen, waaronder interleukinen en andere immuun-actieve elementen 7, hormonen van de hypothalamus-hypofyse-bijnier-as 8, hormonen in het sympathische zenuwstelsel 9, ghreline 10 endogene Opioiden 11, dopamine, en serotonine 12. Als rustende circulerende acties van deze moleculen of andere geregeld door deze moleculen gewenst, is het belangrijk om de stressrespons, die in werking treedt op slechts een minuut na het begin van stressor blootstelling te minimaliseren.
Stressresponsen niet alleen invloed op de samenstelling van het bloed, maar vertegenwoordigen ook een technische belemmering voor bloedafname door de vernauwing van bloedvaten door een grotere rijafstand van het sympathische zenuwstelsel. Het wordt toenemend moeilijk om constante bloedstroom van een rat die de montage van een acute stress respons te verkrijgen. Daarom moet leed het dier minim zijnseerd om monsters die de fysiologische toestand van belang weerspiegelen snel te verkrijgen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Virginia Doherty en Junmei Yao voor technische ondersteuning. Dit onderzoek werd gefinancierd door NiMH (R01 MH084966), en het Amerikaanse leger Bureau Onderzoek en de Defense Advanced Research Projects Agency (verlenen W911NF-10-1-0059) naar KAG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin (1,000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor rinse-chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1 cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500 ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, 0.75 in width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
- Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction. Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).
- Shah, R., et al. Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).
- Chan, M. K., et al. Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders. Prog Neurobiol. , (2014).
- Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents. PLoS One. 7 (12), e51431 (2012).
- Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats. Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).
- Vahl, T. P., et al. Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).
- Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress. Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).
- McEwen, B. S. Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators. Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).
- Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress. Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).
- Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear. Mol Psychiatry. , (2013).
- Knoll, A. T., Carlezon, W. A. Dynorphin, stress, and depression. Brain Res. 1314 (56-73), (2010).
- Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder. Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).
