Introduction
Biomarqueurs obtenus à partir de sang fournissent diagnostic utile, prédictive et stratification des mesures dans de nombreux contextes cliniques, y compris les maladies cardiovasculaires 1, les sciences de cancer 2, et la maladie psychiatrique 3. Ils peuvent également être utilisés dans la science fondamentale pour évaluer «l'état» de l'organisme, y compris le degré de la faim, de l'inflammation, ou le stress présent. De telles mesures peuvent être influencées par les variables qui peuvent ou peuvent ne pas être critique pour la question de l'intérêt, y compris le moment de la journée que l'échantillon est obtenu et le sexe des sujets. Il peut également être influencée par la contrainte induite pendant les procédures d'échantillonnage de sang lui-même. Les hormones du stress et de la perception de la douleur peuvent modifier rapidement la composition du sang.
Les rongeurs sont des animaux de laboratoire le plus couramment utilisé, et plusieurs méthodes ont été développées pour la collecte de sang. La méthode idéale de prélèvement de sang doit avoir un minimum de Physiological impact sur l'animal, ne nécessitent pas d'anesthésie, permet l'échantillonnage rapide et répétée, et de fournir le volume de sang suffisante pour de nombreuses applications en aval. Techniques populaires pour la collecte de sang tels que le cathétérisme de la veine jugulaire ou bout de la queue amputation ne répondent pas à ces critères.
Le but de ce protocole est de décrire une technique de prélèvement de sang destiné à être utilisé chez les rats qui est minimalement stressant, ne nécessite pas d'anesthésie, permet de multiples collectes de sang au sein d'un seul sujet et fournit un volume d'échantillon relativement grand de telle sorte que de multiples dosages peuvent être réalisés sur un seul échantillon. L'objectif de cette méthode est d'obtenir des échantillons de sang qui sont peu influencés par la réponse de stress aigu.
Protocol
Toutes les expériences ont été effectuées en utilisant des rats mâles adultes Long-Evans. Toutes les procédures étaient en conformité avec les US National Institutes of Health (NIH) Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Institut de Technologie du Massachusetts et de la protection des animaux et l'utilisation Bureau d'examen des l'USAMRMC.
1. Préparation
- Heparinise le cathéter et la seringue de l'aiguille en plaçant un blindage contenant de l'héparine dans 500 ul de tube (USP 1000 unités / ml) et ensuite aspirer et expulser la solution d'héparine à travers l'aiguille.
- Fixez un cathéter papillon à la seringue. Gardez le bouclier sur l'aiguille du cathéter pour protéger la pointe acérée de dommages.
- Prélever un volume de l'héparine qui est légèrement supérieur au volume de sang qui seront recueillies. Détachez la seringue et remplissez-le avec de l'air.
- Re-fixer la seringue au cathéter et utiliser leair pour expulser l'excès de solution d'héparine; assurer que des traces restent dans le tube, aiguille et la seringue.
- Placez le cathéter stérile, avec la seringue encore attachée, sur une surface stérile.
- Sécuriser rapidement le rat dans un chiffon propre veiller à ce que antérieurs et pattes arrière sont dans une position confortable et la respiration est sans restriction.
- Fixez l'enveloppe avec crochet et la bande de boucle; veiller à ce que les organes génitaux externes ne sont pas étranglés.
- Avoir un assistant doucement et retenir fermement le rat (abdomen et la base de la queue) sur une surface de travail solide avec la queue pendait au bord du comptoir.
2. L'échantillonnage de sang
- Plonger la queue dans l'eau C 42 ° pour 40-50 sec à dilater les vaisseaux sanguins et sécher la queue avec une serviette en papier. Localisez la veine de la queue d'être saigné (tourner tout le corps avec la queue pour empêcher la torsion de la queue).
Remarque: le réchauffement suffisant de la queue est critique pour la collectio rapiden d'un échantillon de sang. Si le système vasculaire est resserré, le positionnement correct du cathéter est difficile, et la circulation sanguine est nettement réduite. Un coussin chauffant peut être utilisé comme une alternative à l'immersion dans l'eau. - Identifier le point d'échantillonnage.
Remarque: L'artère se trouve le long de l'aspect mi-dorsale de la queue; ne pas utiliser ce pour l'échantillonnage.- Cible soit les veines de la queue de gauche et de droite qui se trouvent latéralement à l'artère. La pigmentation de la queue, qui varie selon la souche et augmente avec l'âge, peut occulter une partie de la vascularisation. Cible une partie de la veine dans la partie inférieure de la queue.
- Essuyez la zone cible avec une solution antiseptique de chlorhexidine 2%.
- Créer une pression négative dans la seringue et le cathéter en retirant le piston de zéro à environ 50 ul.
- Tenez la queue avec douceur et fermeté près de la pointe de garder la queue droite long de la collecte de l'échantillon. Assurez-vous que le flux sanguin est pas fermé par une poignée trop serré.
- Insérez lentement le cathéter dans la veine à un angle faible d'environ 5 cm de la pointe de la queue. Lorsque la veine est pénétré, le sang va couler dans le cathéter. Retirer lentement le piston de la seringue pour recueillir le volume souhaité à un rythme soutenu (~ 20 pi par seconde).
- Consultez le personnel vétérinaire pour des informations sur le volume maximum de sang qui peuvent être recueillis. La quantité maximale de sang qui doit être recueillie dépend de l'état de santé et du poids du rat. Ne pas retirer plus de 15% du volume sanguin total dans une période de 14 jours.
Remarque: Le sang est beaucoup plus difficile de recueillir des animaux qui ont été vivement soulignée dans les minutes avant le prélèvement des échantillons parce que les hormones de stress contractent le système vasculaire. Par exemple, le déménagement de la cage du rat à une nouvelle chambre, en prenant plusieurs minutes pour conclure l'animal, ou l'insertion répétée du cathéter dans une veine sont tous susceptibles de déclencher une réaction de stress aigu. - Faciliter blood écoulement par «traite» la veine. Exécuter un doigt le long de la longueur de la veine, de la base vers l'extrémité de la queue, mais restent plus de 2 cm de la pointe de l'aiguille insérée ou le cathéter peut se détacher de la veine.
- Si le sang ne peut pas être collecté avec succès à partir du site initial de pénétration du cathéter, ré-insérer l'aiguille plus haut dans la veine. Si le sang a été prélevé sur le site initial, re-pressuriser l'aiguille en débranchant puis en rebranchant le cathéter et la seringue avant la ré-insertion dans la veine. En général, éviter les pénétrations supplémentaires.
- Comme pénétrations multiples peuvent provoquer l'effondrement veine de la queue, dans lequel l'approvisionnement en sang à la queue est coupée et le tissu de queue molle devient nécrosée, euthanasier le rat si il ya veine de la queue effondrement.
- Consultez le personnel vétérinaire pour des informations sur le volume maximum de sang qui peuvent être recueillis. La quantité maximale de sang qui doit être recueillie dépend de l'état de santé et du poids du rat. Ne pas retirer plus de 15% du volume sanguin total dans une période de 14 jours.
- Lorsque le volume d'échantillon suffisant est collecté, relâcher la pression dans la seringue en débranchant et en rebranchant le cathéter. Aspirer légèrement à l'aide du piston de la seringue (~ 50 & #181; l), et de retirer l'aiguille de la veine.
Remarque: Si l'aiguille est retirée sans relâcher d'abord la pression dans la seringue, le sang va couler de l'aiguille. - Appliquer brièvement une pression sur le site d'insertion pour arrêter le saignement, et essuyez la zone avec une solution antiseptique. Retour le rat à sa cage.
3. traitement de l'échantillon de sang
- Aspirer l'air pour assurer le sang ne reste à l'intérieur de l'aiguille du cathéter, et utiliser des ciseaux pour couper le tube du cathéter juste au-dessus de l'aiguille. Expulser le sang dans un tube de 1,5 ml à centrifuger stérile.
Remarque: Si le sang est poussé à travers l'aiguille, la force de cisaillement peut entraîner des globules rouges à la rupture qui peut interférer avec de nombreux essais en aval. Retirez l'aiguille pour éviter l'hémolyse.- Pour récupérer le plasma sanguin, les tubes contenant de l'EDTA utilisation comme anticoagulant (ici, en utilisant 10 ul d'EDTA 0,1 M de 200 à 400 pi de sang; assurer la concentration de l'EDTA utilisé ne pas interférer avecvec le dosage en aval) et placer sur la glace.
- Spin échantillons de sang total à 2100 x g dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C) pendant 10 min à moins de 10 min de la collecte. Éluer le plasma, ce qui évite de perturber les couches de globules rouges et blancs.
- Pour collecter le sérum sanguin, placer les échantillons (sans anticoagulant) à la température ambiante pendant 30 min pour permettre la coagulation. Faites tourner les tubes de prélèvement dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C) à 2000 x g. Le sérum peut ensuite être élue.
- Pour récupérer le plasma sanguin, les tubes contenant de l'EDTA utilisation comme anticoagulant (ici, en utilisant 10 ul d'EDTA 0,1 M de 200 à 400 pi de sang; assurer la concentration de l'EDTA utilisé ne pas interférer avecvec le dosage en aval) et placer sur la glace.
- Utiliser des échantillons immédiatement ou conserver à -80 ° C pendant jusqu'à un an.
Representative Results
Le plasma sanguin ont été recueillies à partir de la veine caudale latérale comme décrit dans le protocole donne un échantillon de plasma qui est translucide de couleur jaune pâle et d'aspect. Comme le montre la Figure 1, l'hémolyse dans un échantillon donne une teinte rouge au plasma. La réponse de stress aigu peut modifier rapidement la composition du sang. Par exemple, circulant concentration de corticostérone peut nettement augmenter à moins de 10 min de l'exposition au facteur de stress, comme représenté sur la Figure 2. Les faibles niveaux de base de la corticostérone obtenus avec ce procédé antérieur de facteur de stress exposition révèlent que la procédure d'échantillonnage lui-même constitue pas une source importante de stress.
Figure 1:. Apparence échantillon (A) Un échantillon hémolysé est affiché. Après centrifugation, le plasma ou le sérum couche (indiquée par la surface ar noirrangée) apparaît teintée de rose ou rouge. Teintes sombres indiquent des niveaux plus élevés d'hémolyse. (B) Après centrifugation, un échantillon correctement collecté aura un aspect jaunâtre clair pour la bande supérieure (de surface indiquée par la flèche noire), qui correspond au plasma non-hémolyse ou de sérum. Lors du retrait de cette couche, il est important de ne pas perturber le sang total sous-jacent, soit en poussant la pointe de la pipette dans l'ensemble de la couche de sang ou en aspirant une partie du sang entier dans la pointe. Toute plasma ou le sérum contaminé avec du sang total doivent être jetés.
Figure 2: la corticostérone plasmatique est rapidement élevée suite à une expérience stressante Du sang a été obtenu à partir de la veine caudale latérale de rats femelles adultes Long-Evans avant et 10 min après l'exposition à quatre tons (10 sec, 2 kHz, 85 dB) co-terminaison. avec footshocks (1 sec, 350 uA). corticostérone de plasma sanguin au départ (290,4 ± 138,8 pg / ml) était significativement inférieurs aux niveaux observés 10 min après la présentation de la contrainte de choc électrique (2204,8 ± 454,5 pg / ml, p = 0,02, n = 4), tel que déterminé par t apparié -test. *, P <0,05
Discussion
Ici, nous décrivons un procédé simple et rapide pour l'obtention d'un échantillon de sang d'un rat qui offre des avantages significatifs par rapport à d'autres techniques couramment utilisées. En premier lieu, il ne nécessite pas d'anesthésie, en contraste avec l'échantillonnage à partir de la veine jugulaire ou sinus rétro-orbital. Lorsque les échantillons de sang sont collectés entourant les procédures de comportement, l'administration d'anesthésiques est indésirable car il peut interférer avec l'apprentissage et de la mémoire 4,5. Deuxièmement, il offre la possibilité de collecter des volumes de sang plus importantes que d'autres techniques de ponction veineuse, comme la collecte des veines saphènes de pédale ou dorsales. En utilisant la technique décrite ici, jusqu'à 1,5 ml de sang peut être recueilli à partir d'un rat à un seul point du temps, un volume qui permet facilement de multiples dosages pour être exécutés en parallèle. Enfin, cette procédure minimise le risque d'endommagement du tissu par rapport à bout de la queue amputation ou de saignement rétro-orbital. L'utilisation de cette procédure facilite le respect de l'animal WLoi Bien-être social et le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire, ce qui nécessite de minimiser la douleur et la détresse qui résultent de procédures de laboratoire effectués sur les animaux.
Il est recommandé que les enquêteurs nouvelles à cette méthode en pratique les techniques de contention et la queue saignement afin de minimiser le temps que les animaux expérimentaux sont retenus. Le sang prélevé en moins de 3 min à partir du début de la retenue fournit des résultats optimaux.
Le protocole décrit ici peut être utilisé pour l'échantillonnage de 1 à 4 fois par semaine, mais pas plus de deux fois par jour. Si les collections sanguines répétées peuvent être réalisées, différents sites d'échantillonnage en mouvement vers le haut à partir de la base de la queue doivent être utilisés, et les veines de la queue gauche et droite doivent être alternés comme sites d'échantillonnage. Le volume total de sang de rongeurs est 6-7% de leur poids corporel, et pas plus de 15% du volume total de sang doit être collecté sur une période de deux semaines. Sérumou plasma comprend environ 40-60% du volume d'échantillon prélevé.
Prise de sang à travers les veines de queue latérales peut également être réalisée chez la souris, comme décrit ici, avec quelques modifications mineures. Tout d'abord, seul petit calibre (27 G) Les cathéters peuvent être utilisés. Deuxièmement, il est recommandé d'utiliser un dispositif de retenue du tube, plutôt que d'une enveloppe, pour immobiliser les souris. Le volume de sang qui peut être obtenu à partir de la souris à l'aide de la ponction veineuse faisceau vasculaire sous-maxillaire (200-500 ul) est plus grande que ce qui peut être collecté en toute sécurité à partir de la veine de la queue (200 ul maximum). Parce que l'échantillonnage du sang du faisceau vasculaire sous-maxillaire nécessite confinement minimal et peut produire plus de sang, ceci est la voie préférée pour le prélèvement chez la souris.
La rapidité avec laquelle cette procédure peut être effectuée, avec sa nature peu invasive, minimise également la perturbation potentielle de mesures à base de sang par la réponse de stress aigu 6. Leréponse de stress aigu peut modifier les taux circulants de nombreuses molécules, y compris les interleukines et d'autres facteurs immunitaires actif 7, les hormones de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien 8, hormones dans le système nerveux sympathique 9, la ghréline 10, les opioïdes endogènes 11, la dopamine, et sérotonine 12. Si repos circulant mesures de ces molécules ou d'autres réglementés par ces molécules sont souhaitées, il est important de minimiser la réponse au stress, qui est déclenché dans aussi peu que d'une minute du début de l'exposition de stress.
réponses de stress non seulement modifient la composition du sang, mais représentent également un obstacle technique pour l'échantillonnage de sang à cause de la constriction des vaisseaux via augmenté dur du système nerveux sympathique. Il devient de plus en plus difficile d'obtenir le flux sanguin régulier d'un rat qui est le montage d'un état de stress aigu. Par conséquent, la détresse de l'animal doit être minimeized afin d'obtenir rapidement des échantillons qui reflètent l'état physiologique d'intérêt.
Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Virginia Doherty et Junmei Yao pour l'assistance technique. Cette recherche a été financée par NIMH (R01 MH084966), et le Bureau de recherche de l'armée américaine et l'Agence Defense Advanced Research Projects (accorder W911NF-10-1-0059) à KAG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin (1,000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor rinse-chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1 cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500 ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, 0.75 in width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
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