דגימת דם מוריד הזנב לרוחב של העכברוש

Introduction

סמנים ביולוגיים המתקבלים מהדם לספק שימושי אבחון, חיזוי, ויצרו רבדי אמצעים בהקשרים רבים קליניים, כולל מחלות לב וכלי דם ^1, מדעי סרטן ^2, ומחלה פסיכיאטרית ^3. גם הם עשויים לשמש במדע בסיסי על מנת להעריך את "המדינה" של האורגניזם, כולל התואר של רעב, דלקת, או בהווה לחץ. יכולים להיות מושפעים בצעדים כאלה על ידי משתנים שעשויות או לא עשוי להיות קריטי לשאלה של עניין, כולל את השעה ביום שהמדגם מתקבל והמגדר של הנושאים. גם זה יכול להיות מושפע מהלחץ המושרה במהלך הליכי דגימת הדם עצמו. הורמוני לחץ ותפיסת כאב יכולים במהירות לשנות את ההרכב של הדם.

מכרסמים הם חיות מעבדה הנפוצה ביותר, ומספר שיטות פותחו לאיסוף דם. השיטה האידיאלית של דגימת דם צריכה physiologica המינימליהשפעת l על בעלי החיים, לא דורשת הרדמה, מאפשרת דגימה מהירה וחזרה, ולספק מספיק נפח דם ליישומים במורד הזרם רבים. טכניקות העממיות לאיסוף דם כגון צנתור של קטיעת קצה וריד או זנב הצוואר אינו עומדים בקריטריונים אלה.

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר טכניקת דגימת דם לשימוש בחולדות שהן מינימאלי מלחיץ, אינו דורשת הרדמה, מאפשרת לאוספים דם מרובים בנושא אחד, ומספקת גדול יחסית מדגם כך שמבחנים מרובים ניתן לבצע נפח על מדגם יחיד. מטרתה של שיטה זו היא להשיג דגימות דם שמושפעות באופן מינימאלי על ידי תגובת לחץ האקוטית.

Protocol

כל הניסויים נעשו שימוש בחולדות הארוך אוונס זכר בוגר. כל הנהלים בהתאם למוסד האמריקאי הלאומי לבריאות (NIH) מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש במכון טכנולוגי של מסצ'וסטס והטיפול בבעלי החיים ולמשרד סקירת שימוש ב USAMRMC.

1. הכנה

1. Heparinise קטטר ומזרק על ידי הצבת המחט מוגנות בהפרין המכיל 500 צינור μl (1,000 יחידות USP / מיליליטר) ולאחר מכן aspirating וגירוש פתרון הפרין דרך המחט.
   1. צרף קטטר פרפר למזרק. שמור את המגן על המחט של קטטר כדי להגן על הקצה החד מנזק.
   2. לסגת נפח של הפרין שהוא מעט גדול יותר מנפח דם שייאסף. לנתק את המזרק ולמלא אותו באוויר.
   3. מחדש לצרף את המזרק לקטטר ולהשתמש באוויר לגרש פתרון הפרין עודף; להבטיח רק כמויות זעירות להישאר בצינור, המחט, והמזרק.
   4. מניחים את צנתר סטרילי, עם המזרק עדיין מחובר, על משטח סטרילי.
2. במהירות לאבטח את העכברוש במטלית נקייה להבטיח כי קדמי וhindpaws נמצאים בעמדה נוחה והנשימה היא בלתי מוגבלת.
   1. Secure לעטוף עם וו ולולאה; להבטיח שאברי מין חיצוניים אינם מכווצים.
   2. יש עוזר בעדינות ובתקיפות לרסן את העכברוש (בטן ובסיס הזנב) על משטח עבודה יציב עם הזנב תלוי מקצה הנגדי.

דגימת דם 2.

1. לטבול את הזנב במי 42 מעלות צלזיוס במשך 40-50 שניות להרחבת כלי דם ולייבש את הזנב עם מגבת נייר. אתר את וריד הזנב לדמם (לסובב את כל הגוף עם הזנב למנוע מסובב את הזנב).
   הערה: התחממות מספיקה של הזנב היא קריטית עבור collectio המהירn של דגימת דם. אם כלי הדם הוא מכווץ, מיקום נכון של הצנתר הוא קשה, וזרימת דם מופחתת בהרבה. כרית חימום יכולה לשמש כתחליף לטבילה במים.
2. זהה את נקודת הדגימה.
   הערה: העורק נמצא לאורך היבט אמצע הגב-הזנב; אל תשתמשו בזה לדגימה.
   1. מקד או ורידי זנב שמאלה וימינה ששוכבים לרוחב לעורק. פיגמנטציה של הזנב, שמשתנה לפי זן ועולה עם גיל, עלולה לטשטש חלק מכלי הדם. מקד את חלק של הווריד בחלק התחתון של הזנב.
   2. נגב את אזור היעד עם תמיסת חיטוי chlorhexidine 2%.
3. ליצור לחץ שלילי במזרק וקטטר על ידי משיכת בוכנת מאפס עד כ -50 μl.
4. החזק את הזנב בעדינות ובתקיפות ליד הקצה כדי לשמור על הזנב ישר לאורך אוסף מדגם. ודא שזרימת דם לא האפילה על ידי אחיזה הדוקה מדי.
5. לאט לאט להכניס את הצנתר לווריד בזווית רדודה כ 5 סנטימטר מקצה הזנב. כאשר הווריד חדר, דם יזרום לקטטר. לאט לאט למשוך את הבוכנה של המזרק כדי לאסוף את הנפח הרצוי בקצב קבוע (~ 20 μl לשניות).
   1. התייעץ עם צוות הוטרינרים לקבלת מידע על מרבי הדם שניתן לאסוף נפח. הסכום המרבי של דם שצריך להיות שנאסף תלוי במצב המשקל ובריאות של החולדה. אל תיסוג יותר מ -15% מכלל נפח דם בתקופה של 14 יום.
      הערה: הדם הוא הרבה יותר קשה לגבות מבעלי החיים שהדגישו בחריפות בדקות לפני לטעום אוסף בגלל הורמוני לחץ להצר כלי הדם. לדוגמא, העברת כלוב בבית של החולדה לחדר רומן, לוקח כמה דקות כדי לעטוף את החיה, או החדרה חוזרת ונשנית של הצנתר לוריד כל סיכוי לעורר תגובת לחץ אקוטית.
   2. להקל blooזרימת ד על ידי 'חליבה' הווריד. הפעל את האצבע לאורכו של הווריד, מהבסיס לכיוון קצה הזנב, אבל להישאר יותר מ 2 סנטימטר מקצה המחט המוחדרת הצנתר או עשוי להיות שנעקר מהווריד.
   3. אם דם לא יכול להיות שנאסף בהצלחה מהאתר הראשוני של חדירת צנתר, מחדש להכניס את המחט במעלה הווריד. אם הדם נאסף באתר הראשוני, מחדש חצים על המחט על ידי ניתוק וחיבור מחדש אז קטטר והמזרק לפני מחדש הכנסה בווריד. באופן כללי, למנוע חדירות נוספות.
   4. כחדירות מרובות יכולות לגרום לקריסת וריד זנב, שבו אספקת הדם לזנב מנותקת והרקמות הרכות הזנב הופכת necrotized, להרדים את העכברוש אם יש קריסת וריד זנב.
6. כאשר נאות נפח דגימה שנאסף, לשחרר לחץ במזרק על ידי ניתוק וחיבור מחדש את הקטטר. לשאוב מעט באמצעות בוכנת המזרק (~ 50 & #181; יב), ולמשוך את המחט מהווריד.
   הערה: אם המחט נסוגה מבלי לשחרר את הלחץ הראשון במזרק, דם לטפטף מהמחט.
7. בקצרה להפעיל לחץ לאתר ההכנסה כדי לעצור את הדימום, ולנגב את האזור עם תמיסת חיטוי. להחזיר את החולדה לכלוב בבית שלה.

3. עיבוד דגימת הדם

1. אוויר לשאוב כדי להבטיח שאין דם נשאר בתוך מחט קטטר, ולהשתמש במספריים לחתוך את צינור הצנתר בדיוק מעל המחט. לגרש את הדם לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר סטרילי.
   הערה: אם הדם נדחף דרך המחט, כוח הגז עלול לגרום לתאי דם אדומים להתפקע שיכול להפריע לרבי מבחני במורד הזרם. הסר את המחט, כדי למנוע המוליזה.
   1. לאסוף פלזמה דם, צינורות שימוש המכילים EDTA כנוגד קרישה (כאן, להשתמש 10 μl של 0.1 מ 'EDTA ל200-400 μl דם; להבטיח הריכוז של EDTA המשמש לא מפריע wה- i assay במורד הזרם) ומניחים על קרח.
      1. ספין דגימות דם כל ב2,100 XG בצנטריפוגה בקירור (4 מעלות צלזיוס) במשך 10 דקות בתוך 10 דקות של אוסף. Elute הפלזמה, הימנעות מפריע שכבות תאי דם האדומות ולבנה.
   2. כדי לאסוף סרום דם, דגימות מקום (ללא נוגד קרישה) בטמפרטורת חדר למשך עד 30 דקות כדי לאפשר קרישה. ספין צינורות האיסוף בצנטריפוגה בקירור (4 מעלות צלזיוס) ב2,000 x גרם. הסרום עשוי אז להיות eluted.
2. דגימות שימוש באופן מיידי, או בחנות ב -80 ° C עד שנה אחת.

Representative Results

פלזמה דם שנאסף מוריד הזנב לרוחב כפי שתוארו בפרוטוקול נותנת מדגם פלזמה שהיה שקוף וצהוב חיוור בהופעה. כפי שניתן לראות באיור 1, המוליזה במדגם מקנה גוון אדום לפלזמה. תגובת הלחץ האקוטית יכולה במהירות לשנות את ההרכב של דם. לדוגמא, ריכוז corticosterone במחזור יכול להגדיל במידה ניכרת תוך 10 דקות של חשיפת לחץ, כפי שמוצג באיור 2. הרמות בסיסיות הנמוכה של corticosterone מתקבלות בשיטה זו לפני לחץ חשיפה עולות כי הליך הדגימה עצמו אינו מקור משמעותי של מתח.

איור 1:. מדגם מראה לדוגמא () hemolyzed מוצג. לאחר צנטריפוגה, פלזמה או שכבת סרום (המשטח שצוין על ידי ar השחורשורה) מופיעה עם גוון ורוד או אדום. גוונים כהים יותר מצביעים על רמות גבוהות יותר של המוליזה. (ב) לאחר צנטריפוגה, מדגם שנאסף כראוי יהיה מראה ברור, צהבהב לרצועה העליונה (המשטח המסומן בחץ השחור), אשר תואמת את הפלזמה או בסרום-hemolyzed שאינו. בעת הסרת שכבה זו, חשוב לא להפריע את כל הדם הבסיסי, או על ידי לחיצה על קצה פיפטה לכל שכבת הדם או על ידי aspirating חלק מכל הדם לתוך הקצה. כל פלזמה או בסרום מזוהם עם כל דם צריכה להיות מושלכת.

איור 2: corticosterone פלזמה הוא גבוה במהירות הבאה חוויה מלחיצה הדם התקבל מוריד הזנב לרוחב של חולדות ארוך אוונס נקבה בוגרות לפני 10 דקות ולאחר חשיפה ל4 גוונים (10 שניות, 2 kHz, 85 dB) שיתוף מסתיים. עם footshocks (1 שניות, 350 מיקרו-אמפר). corticosterone הפלזמה דם בתחילת המחקר (290.4 ± 138.8 pg / ml) היה פחות משמעותי מהרמות שנצפו 10 דקות לאחר הצגה של מתח footshock (2,204.8 ± 454.5 pg / ml, p = 0.02, n = 4), כפי שנקבע על ידי לא לזווג -test. * P <0.05

Discussion

כאן אנו מתארים הליך מהיר ופשוט לקבלת דגימת דם מעכברוש המציע יתרונות משמעותיים על פני טכניקות נפוצות אחרות. ראשית, היא אינה דורשת הרדמה, בניגוד לדגימה מוריד הצוואר או בסינוסים retroorbital. כאשר דגימות דם נאספות סביב נהלי התנהגות, ממשל של הרדמה הוא לא רצוי, כי זה יכול להפריע ללמידה וזכרון ^4,5. שנית, היא מציעה את היכולת לאסוף כמויות דם גדולות יותר מאשר טכניקות venipuncture אחרות, כגון גבייה מורידי דוושת saphenous או גב. באמצעות עד 1.5 מיליליטר של דם הטכניקה המתוארת כאן, ניתן לגבות מחולדה בנקודת זמן אחת, נפח שמאפשר בקלות מבחני מרובים כדי להפעיל במקביל. לבסוף, הליך זה מקטין את הפוטנציאל לנזק לרקמות בהשוואה לקטיעת קצה זנב או דימום retroorbital. השימוש בהליך זה מאפשר תאימות עם W בעלי החייםelfare חוק והמדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה, אשר דורש מזעור הכאב והמצוקה שנובע מהנהלים מעבדה שבוצעו על בעלי חיים.

מומלץ כי חוקרים חדשים לשיטה זו לתרגל טכניקות איפוק ודימום זנב כדי למזער את הזמן שחיות ניסוי מרוסנות. דם שנאסף בפחות מ 3 דקות מפתיחת האיפוק מספק תוצאות אופטימליות.

הפרוטוקול המתואר כאן עשוי לשמש לדגימת 1 עד 4 פעמים בשבוע, אך לא יותר מפעמיים ביום. בעוד אוספי דם חוזרים ונשנים עשויות להתבצע, יש להשתמש באתרי דגימה שונים נעו כלפי מעלה מבסיס הזנב, והוורידים זנב שמאלה וימינה צריכים להיות לסירוגין כאתרי דגימה. סך נפח הדם של מכרסמים הוא 6-7% ממשקל גופם, ולא יותר מ -15% מכלל נפח הדם צריכים להיות שנאספו בתקופה 2 בשבוע. סרוםאו פלזמה מהווה כ 40-60% מנפח הדגימה שנאסף.

דגימת דם דרך ורידי זנב לרוחב עשויה גם להתבצע בעכבר כפי שמתוארת כאן עם כמה שינויים קלים. ראשית, ניתן להשתמש בצנתרים רק מד קטן (27 G). שנית, זה מומלץ להשתמש עוצר צינור, ולא לעטוף, כדי לשתק את העכברים. נפח דם שניתן לקבל מהעכבר באמצעות venipuncture של חבילת כלי דם submandibular (200-500 μl) הוא גדול יותר מאשר ניתן לאסוף בבטחה מוריד הזנב (200 מרבי μl). בגלל דגימת דם מכלי הדם הצרור submandibular דורשת איפוק מינימאלי ועשויה להניב יותר דם, זה המסלול המועדף לדגימה בעכבר.

המהירות שבה הליך זה עשויה להתבצע, יחד עם הטבע פולשנית שלה, גם ממזערת את ההפרעה הפוטנציאלית של אמצעים המבוסס על דם על ידי תגובת הלחץ האקוטית ^6.תגובת לחץ אקוטית יכולה לשנות את הרמות במחזור של מולקולות רבות, כוללים אינטרלויקינים וגורמי חיסון פעילים אחרים ^7, הורמונים של ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-יותרת הכליה ^8, הורמונים במערכת העצבים הסימפתטית ^9, גרלין ^10, אופיואידים אנדוגני ^11, דופמין, ו סרוטונין ^12. אם צעדי מנוחה במחזור של מולקולות או אחרים אלה מוסדרים על ידי מולקולות אלה רצויים, חשוב למזער את תגובת הלחץ, אשר מופעלת בתוך מעט ככל דקות של תחילת חשיפת לחץ.

תגובות דחק לא רק לשנות את ההרכב של הדם, אלא גם מהוות מכשול טכני לדגימה בגלל ההתכווצות של כלי דם דם באמצעות כונן מוגבר ממערכת העצבים הסימפתטית. הוא הופך להיות קשה להשיג הגדלת זרימת דם יציבה מעכברוש שגובר תגובת לחץ אקוטית. לכן, המצוקה של בעלי החיים חייבת להיות מיניםized כדי להשיג במהירות דגימות המשקפות את המצב הפיזיולוגי של עניין.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium heparin (1,000 USP units/ml)	Patternson Veterinary Supply	25021040010
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	JT Taylor	JT2020-01
Dermachlor rinse-chlorhexadine	Butler Schein	6356	Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate
SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters	VWR Scientific	TESV25BLK
BD Tuberculin 1 cc syringes	VWR Scientific	BD309659
1.5 ml microcentrifuge tubes	VWR Scientific	89202-682
500 μl microcentrifuge tubes	VWR Scientific	21150-330
Scissors, stainless steel, 5"	VWR Scientific	82027-586
500 ml plastic beaker	VWR Scientific	414004-149
Clean cloth wrap	Butler Schein	2993
Velcro tape, 0.75 in width	Monoprice	B004AF9II6	Hook and loop tape
Timer	VWR Scientific	62344-641