Introduction
혈액에서 얻은 바이오 마커는 유용한 진단, 예측을 제공하고, 심혈관 질환 1, 암 과학 2, 정신 질환 (3)를 포함하여 많은 임상 상황에서 조치를 계층화. 또한 기아, 염증, 또는 응력의 존재도 포함하여, 유기체의 "상태"를 평가하는 기초 연구에 사용될 수있다. 그러한 조치는 또는 샘플이 얻어 일의 시간 및 주제 성별 포함 관심 질문에 중요하지 않을 수도 변수에 의해 영향을받을 수있다. 또한 채혈 절차 자체 동안에 유도 된 응력에 의해 영향을받을 수있다. 스트레스 호르몬과 통증의 지각이 빠르게 혈액의 조성을 변경할 수있다.
설치류가 가장 일반적으로 사용되는 실험용 동물이며, 여러 방법은 채혈을 위해 개발되어왔다. 혈액 샘플링의 이상적인 방법은 최소한의 physiologica이 있어야합니다동물에 L에 미치는 영향은 어떤 마취를 필요로하지, 신속하고 반복 샘플링을 허용하고, 다수의 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 충분한 혈액량을 제공합니다. 이들 기준을 충족하지 않는 경정맥 또는 꼬리 끝의 절단의 카테터로 혈액을 수집하기위한 인기있는 기술.
이 프로토콜의 목적은, 마취가 필요하지 않고, 최소한의 스트레스 래트에서 사용하기위한 혈액 샘플링 기술을 설명하는 단일 주체 내에서 여러 혈액 수집을 허용하고, 다수의 분석이 수행 될 수 있도록 상대적으로 큰 샘플 부피를 제공한다 하나의 샘플에. 이 방법의 목적은 최소 급성 스트레스 반응에 의해 영향을 받는다 혈액 샘플을 획득하는 것이다.
Protocol
모든 실험은 성인 남성 긴 에반스 쥐를 사용하여 수행 하였다. 모든 절차는 실험 동물의 관리 및 사용을위한 건강 (NIH) 가이드의 미국 국립 연구소에 따라했고, 매사 추세 츠 공과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 및 동물 관리 및 사용 검토 사무소에 의해 승인되었다 USAMRMC.
1. 준비
- 바늘을 통해 헤파린 용액 (1000 USP 단위 / ㎖) 500 ㎕를 함유하는 튜브로 헤파린 차폐 바늘을 배치하고 흡입 및 배출하기로 카테터를 주사기 Heparinise.
- 주사기에 나비 카테터를 연결합니다. 손상으로부터 날카로운 팁을 보호하기 위해 카테터의 니들 위에 실드를 유지.
- 수집 될 혈액의 부피보다 약간 큰, 헤파린의 양을 철회. 주사기를 분리하고 공기를 채운다.
- 다시 부착 카테터에 주사기와를 사용공기 과잉 헤파린 솔루션을 추방하기 위해; 단지 양이 튜브, 바늘과 주사기에 남아 추적 확인합니다.
- 멸균 표면에 여전히 부착 된 주사기, 멸균 카테터를 놓습니다.
- 빨리 ...의 앞에와 hindpaws 편안한 위치에 호흡이 제한되지 보장 깨끗한 천에 쥐를 고정합니다.
- 후크 및 루프 테이프로 랩을 고정; 외부 성기가 수축되지 않도록.
- 부드럽게 보조를하고 단단히 꼬리가 카운터의 가장자리에 걸려와 고체 작업 표면에 쥐 (복부와 꼬리의 기반을) 억제.
2. 혈액 샘플링
- 혈관을 팽창하고 종이 타월로 꼬리를 건조 40 ~ 50 초 동안 42 ° C의 물에 꼬리를 담근다. (꼬리를 왜곡 방지하기 위해 꼬리와 몸 전체를 회전) 출혈되는 꼬리 정맥을 찾습니다.
주 : 꼬리의 충분한 온난화는 빠른 collectio 중요하다혈액 샘플의 N. 혈관 수축 한 경우 카테터의 적절한 배치가 어렵고, 혈액의 흐름은 크게 감소된다. 가열 패드 침수에 대한 대안으로 사용될 수있다. - 샘플링 포인트를 확인합니다.
참고 : 동맥 꼬리의 중간 등의 측면을 따라 자리 잡고 있습니다; 샘플링이 사용하지 마십시오.- 동맥 측면 거짓말을 왼쪽과 오른쪽 꼬리 정맥를 대상입니다. 변형에 따라 다릅니다과 나이에 따라 증가 꼬리의 색소 침착은 혈관의 일부를 가릴 수 있습니다. 꼬리의 하부에 정맥의 부분을 타겟팅.
- 2 % 클로르헥시딘 소독액으로 목표 부위를 닦아주십시오.
- 약 50 μL에 0에서 플런저를 철수하여 주사기와 카테터에 음압을 만듭니다.
- 바로 샘플 수집을 통해 꼬리를 유지하기 위해 팁 근처에 부드럽게 단단히 꼬리를 잡으십시오. 혈액의 흐름이 지나치게 꽉 그립에 의해 폐색되지 않았는지 확인합니다.
- 천천히 약 5cm 꼬리의 끝에서 얕은 각도로 정맥에 카테터를 삽입합니다. 정맥이 관통 될 때, 혈액은 카테터 내로 흐를 것이다. 천천히 (~ 초 당 20 μL)을 일정한 속도로 원하는 양을 수집하기 위해 주사기의 플런저를 철회.
- 수집 할 수있는 최대 혈액량에 대한 자세한 내용은 수의학 직원에게 문의하십시오. 수집해야 혈액의 최대 금액은 쥐의 체중과 건강 상태에 따라 달라집니다. 14 일의 기간에 총 혈액량의 15 % 이상을 인출하지 마십시오.
참고 : 혈액은 급성 스트레스 호르몬은 혈관을 수축하기 때문에 수집을 샘플링하기 전에 분 안에 강조했다 동물로부터 수집하는 것이 훨씬 더 어렵다. 예를 들어, 정맥에 동물, 또는 카테터의 반복 삽입을 포장하는 데 몇 분 정도 복용, 새로운 방에 쥐의 홈 케이지를 이동하는 모든 급성 스트레스 반응을 일으킬 가능성이 있습니다. - (B100)를 촉진'착유'정맥으로 D 흐름. 꼬리의 끝을 향해베이스로부터, 혈관의 길이를 따라 손가락을 실행할 수 있지만 정맥으로부터 빠질 될 수 삽입 바늘 또는 카테터의 선단으로부터 2 cm 이상 남아있다.
- 혈액이 성공적 카테터 침투의 초기 위치로부터 수집 될 수없는 경우, 정맥까지 상기 바늘을 다시 삽입. 혈액 초기 사이트에서 수집 된 경우, 분리 한 다음 정맥에 삽입을 다시하기 전에 카테터와 주사기를 다시 연결하여 바늘을 다시-가압. 일반적으로, 추가 관통을 피하십시오.
- 다수의 관통은 꼬리 혈액 공급을 차단하고 부드러운 꼬리 조직이 괴사로되는 꼬리 정맥 붕괴를 야기 할 수있는 바와 같이 꼬리 정맥 붕괴가있는 경우, 래트를 안락사.
- 수집 할 수있는 최대 혈액량에 대한 자세한 내용은 수의학 직원에게 문의하십시오. 수집해야 혈액의 최대 금액은 쥐의 체중과 건강 상태에 따라 달라집니다. 14 일의 기간에 총 혈액량의 15 % 이상을 인출하지 마십시오.
- 적절한 샘플 볼륨이 수집되면, 분리 및 카테터를 다시 연결하여 주사기에 압력을 놓습니다. 대기음 약간 주사기 플런저를 사용하여 (~ 50 #181; L), 및 정맥 주사 바늘을 철수.
주 : 바늘 주사기 제 내의 압력을 방출하지 않고 회수되는 경우, 혈액이 바늘에서 떨어지지 것이다. - 간단히 지혈 및 살균 용액으로 영역을 닦아 삽입 부위에 압력을 적용합니다. 홈 케이지에 쥐를 돌려줍니다.
3. 혈액 샘플을 처리
- 대기음 공기에는 혈액이 카테터를 바늘 내부에 남아 있지 확인하고 바로 바늘 위의 카테터 튜브를 잘라 가위를 사용합니다. 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 혈액을 추방.
주 : 혈액이 바늘을 통해 밀면 전단력 많은 하류 분석을 방해 할 수있는 파열 적혈구를 일으킬 수있다. 용혈을 방지하기 위해 바늘을 제거합니다.- , 혈장, 여기 항응고제 (EDTA로 포함되어 사용 튜브를 수집 혈액의 200 ~ 400 ㎕의 0.1 M EDTA 10 μl를 사용하려면, 확인 승을 방해하지 않는 사용 EDTA의 농도를얼음에 다운 스트림 분석) 및 장소 i 번째.
- 컬렉션의 10 분 내에서 10 분 동안 냉장 원심 분리기 (4 ° C)에서 2,100 XG에서 전체 혈액 샘플을 스핀. 적색 및 백혈구 층을 방해 회피 플라즈마를 용출.
- 응고 가능하도록 최대 30 분 동안 실온에서 혈청 (항응고제)없이 도시 샘플을 수집한다. 2,000 x g에서 냉장 원심 분리기 (4 ° C)에서 수집 튜브를 스핀. 혈청은 용출 될 수있다.
- , 혈장, 여기 항응고제 (EDTA로 포함되어 사용 튜브를 수집 혈액의 200 ~ 400 ㎕의 0.1 M EDTA 10 μl를 사용하려면, 확인 승을 방해하지 않는 사용 EDTA의 농도를얼음에 다운 스트림 분석) 및 장소 i 번째.
- 사용 즉시 샘플, 또는 저장 최대 1 년까지 -80 ° C에서.
Representative Results
프로토콜에 설명 된대로 측면 꼬리 정맥에서 수집 혈장은 반투명과 모양의 담황색했다 플라즈마 샘플을 제공합니다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 샘플에서의 용혈은 플라즈마에 붉은 색조를 부여한다. 급성 스트레스 반응은 신속하게 혈액의 성분을 변경할 수있다. 도 2에 도시 된 바와 같이 예를 들어, 순환 코르티 코스 테론 농도는 현저하게, 스트레스에 노출 10 분 내에 증가시킬 수있다. 노출 스트레스 전에이 방법으로 얻어진 코르티 코스 테론의 낮은 기저 수준은 샘플링 절차 자체가 응력의 현저한 소스 아니라는 것을 알 수있다.
그림 1. 샘플 외관 (A) 용혈 시료를 나타낸다. 원심 분리 후, 혈장 또는 혈청 층 (표면이 검은 AR로 나타낸행) 분홍색 또는 빨간색으로 물들어 나타납니다. 어두운 색조는 용혈의 높은 수준을 나타냅니다. (B)를 원심 분리 후, 적절하게 수집 된 샘플은 비 용혈 혈장 또는 혈청에 해당하는 상위 대역 (검은 색 화살표로 표시된 표면)에 명확한, 황색 모양을해야합니다. 이 층을 제거 할 때, 어느 전혈 층으로 피펫 팁을 누름으로써 또는 팁에 전체 혈액의 일부를 흡입하여 하부 전혈을 방해하지 않는 것이 중요하다. 전체 혈액에 오염 된 모든 혈장 또는 혈청을 폐기해야합니다.
그림 2 : 플라즈마 코르티 코스 테론이 빠르게 스트레스를 경험 다음 상승 혈액 전에 성인 여성의 긴 에반스 쥐의 측면 꼬리 정맥에서 얻은 10 분 4 톤 (10 초, 2 kHz에서 85 dB)로 노출 다음 공동 종료되었다. foo에와tshocks (1 초, 350 μA). 기준선 (290.4 ± 138.8 PG / ㎖)에서 혈장 코르티는 레벨 footshock 응력 프레젠테이션 다음 10 분간 관찰보다 훨씬 적었다 (2204.8 ± 454.5 PG / ㎖, p = 0.02, N = 4), 한 쌍의 t에 의해 결정 -test. * P <0.05
Discussion
여기, 우리가 일반적으로 사용되는 다른 기술에 비해 상당한 장점을 제공하는 쥐에서 혈액 샘플을 얻기위한 빠르고 간단한 절차를 설명합니다. 첫째, 경정맥 또는 안와 부비동에서 샘플링과는 대조적으로, 마취를 필요로하지 않는다. 혈액 샘플은 행동 절차를 둘러싸 수집 때 학습 및 기억 4,5- 방해 할 수 있기 때문에, 마취제 투여는 바람직하지 않다. 둘째, 이러한 복재 또는 등쪽 페달 정맥에서 정맥 천자 컬렉션과 같은 다른 기술에 비해 더 큰 부피의 혈액을 수집하는 능력을 제공한다. 혈액 1.5ml의 최대, 여기에 설명 된 기술을 사용하는 것은 하나의 시점에 쥐로부터 수집 될 수 있고, 용이하게 복수의 분석이 병렬로 실행될 수 있도록 볼륨. 마지막으로,이 절차는 꼬리 끝 절단 또는 안와 후 출혈에 비해 조직 손상에 대한 가능성을 최소화한다. 이 절차의 사용은 동물 W 준수를 용이elfare 법 및 동물 실험 수행 절차의 결과 통증과 고통을 최소화 할 필요가 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 안내서.
또한이 방법으로 연구자들이 새로운 실험 동물을 억제되는 시간을 최소화하기 위해 구속 꼬리 출혈 기술을 실행하는 것이 권장된다. 구속의 개시에서보다 3 분에서 수집 된 혈액은 최적의 결과를 제공합니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 주 당 1 내지 4 회 샘플링에 사용되지 않지만 하루 두번보다 더 될 수있다. 반복 된 혈액 수집이 수행 될 수 있지만, 꼬리의베이스로부터 위쪽으로 움직이는 다른 샘플링 위치가 사용되어야하며, 좌우 꼬리 정맥을 샘플링 위치로 교대한다. 설치류의 총 혈액량은 체중 6-7 %로하고, 전체 혈액의 부피 기준 15 % 이상이 2 주 기간 내에 수집 될 수 없습니다. 혈청또는 플라즈마는 수집 된 샘플 부피의 약 40 % -60 %를 포함한다.
몇몇 사소한 변형으로 여기 기술 된 바와 같이 측면 꼬리 정맥을 통해 혈액 샘플링은 또한 마우스에서 수행 될 수있다. 우선, 단지 작은 게이지 (27 G) 카테터를 사용할 수있다. 둘째로, 그것은 마우스 고정화 오히려 랩보다 튜브 제한 수단을 사용하는 것이 권장된다. 턱밑 관다발 (200-500 μL)을 사용하여 정맥 천자의 마우스로부터 수득 될 수있다 혈액의 부피는 안전하게 꼬리 정맥 (200 μL 최대)에서 수집 될 수있는 것보다 더 크다. 턱밑 관다발에서 혈액을 샘플링하는 것은 최소한의 구속을 필요로하고 더 많은 혈액을 얻을 수 있기 때문에,이 마우스에서 샘플링 선호하는 노선이다.
이 절차는 그 최소 침습 자연과 함께 수행 될 수있는 신속성은 또한 급성 스트레스 반응 (6)에 의해 혈액 계 조치 섭동 가능성을 최소화한다.급성 스트레스 반응은 인터루킨과 다른 면역 활성 인자 (7), 시상 하부 - 뇌하수체 - 부신 축 (8)의 호르몬, 교감 신경계 9 호르몬, 그렐린 (10), 내인성 오피오이드 (11), 도파민 등 많은 분자의 순환 수준을 변경, 수 세로토닌 (12). 이러한 분자들에 의해 조절이 분자 또는 다른 휴식 순환 대책이 요구되는 경우, 스트레스 노광 개시 분만큼 작은 내에 트리거 스트레스 반응을 최소화하는 것이 중요하다.
스트레스 반응은 혈액의 성분을 변경할뿐만 아니라 교감 신경계를 통해 드라이브 증가 때문에 혈관의 수축의 혈액 샘플링을위한 기술적 장애물을 나타내지. 이것은 급성 스트레스 반응 장착되어 정상 래트에서 혈류를 증가 얻는 것이 곤란해진다. 따라서, 동물의 고통은 미님해야합니다급속하게 관심 생리 상태를 반영 샘플들을 획득하기 위해화된.
Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원을 버지니아 도허티와 Junmei 야오 감사합니다. 이 연구는 NIMH (R01 MH084966), 미국 육군 연구 사무실 및 방위 고등 연구 기관에 의해 투자되었다 KAG에 (W911NF-10-1-0059을 부여).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin (1,000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor rinse-chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1 cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500 ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, 0.75 in width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
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