Introduction
Biomarkører hentet fra blodet gi nyttig diagnostisk, prediktiv, og stratifisering tiltak i mange kliniske sammenhenger, blant annet hjerte- og karsykdommer en kreft fag to, og psykiatrisk sykdom 3. De kan også brukes i grunnforskning for å vurdere "stat" til en organisme, herunder graden av sult, inflammasjon, eller stress tilstede. Slike tiltak kan være påvirket av variabler som kan eller ikke kan være avgjørende for spørsmålet om interesse, inkludert den tiden av dagen at prøven er innhentet og kjønn av fagene. Det kan også være påvirket av den induserte spenning i de blodprøver prosedyrer selv. Stresshormoner og oppfatningen av smerte hurtig kan forandre sammensetningen av blodet.
Gnagere er den mest brukte forsøksdyret, og flere metoder er blitt utviklet for blodprøvetaking. Den ideelle metoden for blodprøvetaking bør ha minimal physiological innvirkning på dyret, krever ingen anestesi, tillate rask og gjentatt sampling, og gi tilstrekkelig blodvolum for en rekke anvendelser nedstrøms. Populære teknikker for å samle blod eksempel kateterisering av halsvenen eller haletipp amputasjon ikke oppfyller disse kriteriene.
Formålet med denne protokollen er å beskrive en blodprøvetakingsteknikk for bruk i rotter som er minimalt stress, krever ikke anestesi, tillater flere blod samlinger innenfor et enkelt emne, og gir et forholdsvis stort prøvevolum slik at multiple analyser kan bli utført på en enkelt prøve. Målet med denne fremgangsmåte er å oppnå blodprøver som er minimalt påvirket av akutt stressrespons.
Protocol
Alle forsøk ble gjort ved hjelp av voksne mannlige Long-Evans rotter. Alle prosedyrer var i samsvar med det amerikanske National Institutes of Health (NIH) Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité Massachusetts Institute of Technology og Animal Care og bruk omtale Riks den USAMRMC.
1. Forberedelse
- Heparinise kateteret og sprøyten ved å plassere det skjermede nål i en 500 mL rør inneholdende heparin (1000 USP-enheter / ml) og deretter aspirering og utstøter heparin-løsning gjennom nålen.
- Fest en sommerfugl kateter til sprøyten. Hold skjold over nålen av kateteret for å beskytte den skarpe spissen fra skade.
- Trekke tilbake et volum av heparin som er litt større enn volumet av blod som skal oppsamles. Løsne sprøyten og fyll den med luft.
- Re-fest sprøyten til kateteret og brukeluft å utvise overflødig heparin løsning; sikre at bare spormengder forblir i produksjonsrøret, nål og sprøyte.
- Plasser sterilt kateter, med sprøyten fremdeles er festet, på en steril overflate.
- Raskt sikre rotte i en ren klut slik at for- og hindpaws er i en komfortabel posisjon og pusting er ubegrenset.
- Fest wrap med borrelåstape; sikre at ytre genitalia ikke er innsnevret.
- Ha en assistent forsiktig og fast holde rotte (abdomen og undersiden av halen) på et solid underlag med halen hengende utenfor kanten av disken.
2. Blood Sampling
- Fordyp halen i 42 ° C vann i 40-50 sekunder for å utvide blodårene og tørke halen med et papirhåndkle. Finn nålevenen å luftes (roter hele kroppen med halen for å hindre vridning halen).
Merk: Tilstrekkelig oppvarming av halen er kritisk for den raske collection av en blodprøve. Dersom vaskulaturen er innsnevret, er riktig plassering av kateteret vanskelig, og blodstrømmen er kraftig redusert. En varmepute kan anvendes som et alternativ til nedsenking i vann. - Identifiser samplingspunkt.
Merk: arterie ligger langs midten av dorsal aspekt av halen; bruker ikke dette for prøvetaking.- Målrette enten venstre og høyre hale årer som ligger lateralt for arterien. Pigmentering av halen, som varierer avhengig av belastning og øker med alderen, kan tilsløre noe av blodkar. Målrette en del av venen i den nedre del av halen.
- Tørk målområdet med 2% klorheksidin antiseptisk løsning.
- Skape undertrykk i sprøyten og kateter ved å trekke stempelet fra null til omkring 50 pl.
- Hold halen forsiktig og fast nær spissen for å holde halen rett gjennom prøvetaking. Sørg for at blodstrømmen ikke er blokkert av en altfor stramt grep.
- Langsomt inn kateteret inn i venen i en spiss vinkel omtrent 5 cm fra halespissen. Når venen er gjennomtrengt, vil blod strømme inn i kateteret. Sakte trekke tilbake stempelet i sprøyten for å samle den ønskede volum i en jevn hastighet (~ 20 mL per sekund).
- Konsultere veterinær ansatte for informasjon om den maksimale blodvolumet som kan samles. Den maksimale mengden blod som skal samles avhenger av vekt og helsetilstand av rotte. Ikke ut mer enn 15% av det totale blodvolum i en 14 dagers periode.
Merk: Blood er mye vanskeligere å samle inn fra dyr som ble akutt stresset i minuttene før prøvetaking fordi stresshormoner constrict blodkar. For eksempel, beveger rotte hjemmeburet til en ny plass, tar flere minutter å vikle dyret, eller gjentatt innføring av kateteret inn i en vene alle er sannsynlig å utløse en akutt stressrespons. - Tilrettelegge blood flyt av "melking" venen. Kjør en finger langs lengden av venen, fra bunnen mot spissen av halen, men forblir mer enn 2 cm fra spissen av den innførte nålen eller kateteret kan komme ut av stilling fra venen.
- Hvis blodet ikke kan med hell hentet fra den opprinnelige området av kateter penetrasjon, sett inn nålen lenger opp venen. Hvis blod ble samlet ved første området, re-pressurize nålen ved å koble fra og deretter koble kateteret og sprøyten før ny innsetting i venen. Generelt unngå ekstra gjennomføringer.
- Som flere gjennomføringer kan føre halevenen kollaps, hvor blodtilførselen til halen blir avskåret og mykt vev halen blir necrotized, avlive rotte hvis det er halevenen kollaps.
- Konsultere veterinær ansatte for informasjon om den maksimale blodvolumet som kan samles. Den maksimale mengden blod som skal samles avhenger av vekt og helsetilstand av rotte. Ikke ut mer enn 15% av det totale blodvolum i en 14 dagers periode.
- Når tilstrekkelig prøvevolum er samlet inn, slipper trykket i sprøyten ved å koble fra og til kateteret. Aspirer litt hjelp av sprøytestemplet (~ 50 & #181; l), og ta ut nålen fra blodåre.
Merk: Når nålen trekkes tilbake uten først å frigjøre trykket i sprøyten, vil blodet dryppe fra nålen. - I korthet legg press på innstikkstedet for å stoppe blødning, og tørk området med antiseptisk løsning. Returner rotte til sitt hjem buret.
3. Behandler blodprøven
- Aspirer luft for å sikre at ingen blod forblir inne i kateteret nål, og bruke saks til å klippe kateteret slangen like over nålen. Drive ut blod inn i et sterilt 1,5 ml mikrosentrifugerør.
Merk: Hvis blod er presset gjennom nålen, kan skjærkraften forårsake røde blodlegemer til å sprekke som kan interferere med mange nedstrøms analyser. Fjern nålen for å unngå hemolyse.- Å samle blodplasma, bruk rør som inneholder EDTA som antikoagulant (her, bruker 10 ul 0,1 M EDTA for 200-400 mL av blod, sikre at konsentrasjonen av EDTA brukes ikke forstyrrer with nedstrøms analyse) og legg på is.
- Spin helblodprøver ved 2100 x g i en avkjølt sentrifuge (4 ° C) i 10 min i løpet av 10 min etter prøvetaking. Eluer plasma, unngå å forstyrre den røde og hvite blodlegemer lag.
- Å samle blodserum, sted prøver (uten antikoagulant) ved romtemperatur i opptil 30 minutter for å aktivere clotting. Spinn samling rør i et avkjølt sentrifuge (4 ° C) ved 2000 x g. Serumet kan deretter elueres.
- Å samle blodplasma, bruk rør som inneholder EDTA som antikoagulant (her, bruker 10 ul 0,1 M EDTA for 200-400 mL av blod, sikre at konsentrasjonen av EDTA brukes ikke forstyrrer with nedstrøms analyse) og legg på is.
- Bruk prøver umiddelbart eller butikken ved -80 ° C i inntil ett år.
Representative Results
Blodplasma oppsamlet fra den laterale halevenen som beskrevet i protokollen gir en plasmaprøve som var gjennomskinnelig og svakt gul av utseende. Som vist i figur 1, hemolyse i en prøve som gir en rød fargetone til plasmaet. Akutt stressrespons hurtig kan forandre sammensetningen av blodet. For eksempel kan sirkulasjons kortikosteron konsentrasjon markert økning i løpet av 10 min av stresseksponering, som vist i figur 2. De lave basalnivåer av kortikosteron oppnådd med denne metoden før stressor eksponering avsløre at prøvetakingsprosedyre i seg selv ikke er en betydelig kilde til stress.
Fig. 1: Prøve Utseende (A) En hemolysert prøve er vist. Etter sentrifugering av plasma eller serum lag (overflate indikert ved det sorte arrad) vises skjær av rosa eller rødt. Mørkere fargetoner indikerer større grad av hemolyse. (B) etter sentrifugering, vil en riktig samlet prøve har en klar, gulaktig utseende til det øvre bånd (flate angitt med sorte pil), som tilsvarer den ikke-hemolysert plasma eller serum. Ved fjerning av dette laget, er det viktig å ikke forstyrre den underliggende fullblod, enten ved å skyve pipettespissen inn i helblod lag eller ved å suge noe av helblod inn i tuppen. Enhver plasma eller serum forurenset med fullblod skal kastes.
Figur 2: Plasma kortikosteron raskt hevet etter en stressende opplevelse Blod ble oppnådd fra den laterale halevenen til voksne kvinnelige Long-Evans rotter før og 10 minutter etter administrering av fire toner (10 sek, 2 kHz, 85 dB) co-terminerende. med footshocks (1 sek, 350 uA). Blodplasma kortikosteron i utgangspunktet (290,4 ± 138,8 pg / ml) var betydelig mindre enn det som observeres 10 minutter etter fremstilling av fotsjokk spenning (2204,8 ± 454,5 pg / ml, p = 0,02, n = 4), som bestemmes av paret t -test. * P <0,05
Discussion
Her beskriver vi en rask og enkel fremgangsmåte for å oppnå en blodprøve fra en rotte som gir betydelige fordeler i forhold til andre vanlig brukte teknikker. Først krever det ikke bedøvelse, i kontrast med sampling fra halsvenen eller retroorbital sinus. Når blodprøver samles rundt atferds prosedyrer, er administrering av bedøvelse uønsket fordi den kan forstyrre læring og hukommelse 4,5. For det andre, det gir muligheten til å samle større blodvolum enn andre venepunksjon teknikker, for eksempel samling fra saphenous eller ryggpedal årer. Ved å bruke den teknikk som er beskrevet her, opp til 1,5 ml blod kan bli samlet inn fra en rotte på ett tidspunkt, et volum som lett tillater flere analyser for å bli kjørt i parallell. Endelig, denne fremgangsmåten minimerer faren for vevskade i forhold til halespissen amputasjon eller retroorbital blødning. Bruken av denne fremgangsmåten forenkler samsvar med dyret Welfare loven og Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, noe som krever minimere smerte og ubehag som følge av laboratorie prosedyrer utført på dyr.
Det anbefales at etterforskerne nye til denne metoden øve holde og hale blødnings teknikker for å minimere tiden som forsøksdyr er tilbakeholdne. Blod samles i mindre enn 3 minutter fra igangsettingen av beherskelse gir optimale resultater.
Protokollen er beskrevet her kan anvendes for å sample 1 til 4 ganger pr uke, men ikke mer enn to ganger per dag. Selv gjentatte blodsamlinger kan utføres, må forskjellige prøvetakingssteder beveger seg oppover fra bunnen av halen skal brukes, og de venstre og høyre halevenene bør varieres i prøvetakingssteder. Det totale volumet av gnagere blod er 6-7% av deres kroppsvekt, og ikke mer enn 15% av det totale blodvolum bør samles i en 2 ukers periode. Serumeller plasma utgjør omkring 40-60% av den oppsamlede prøvevolum.
Blodprøvetaking via den laterale halevenene kan også bli utført i mus, som beskrevet her med noen mindre modifikasjoner. For det første kan bare liten måler (27 G) katetere brukes. For det andre er det anbefalt å bruke en tube rainer, snarere enn en wrap, å immobilisere musene. Volumet av blod som kan oppnås fra musen ved hjelp av venepunkteringen av kjeve vaskulære bunt (200-500 pl) er større enn det som kan trygt oppsamlet fra halevenen (200 ul maksimum). Fordi prøvetaking blod fra submandibular vaskulære bundle krever minimalt med tilbakeholdenhet, og kan gi mer blod, dette er den foretrukne ruten for prøvetaking i musen.
Den hurtighet med hvilken denne fremgangsmåte kan utføres, sammen med sin minimal invasiv karakter, reduserer også den potensielle forstyrrelse av blodbaserte tiltak ved akutt stressrespons 6. Denakutt stressrespons kan endre sirkulerende nivåer av mange molekyler, inkludert interleukiner og andre immunaktive faktorer 7, hormoner av hypothalamus-hypofyse-binyre-aksen 8, hormoner i det sympatiske nervesystemet 9, ghrelin 10, endogene opioider 11, dopamin, og serotonin 12. Hvis hvile sirkulerende målinger av disse molekyler eller andre, som reguleres av disse molekylene er ønsket, er det viktig å redusere stressrespons som utløses i løpet av så lite som et minutt etter oppstart av stresseksponering.
Stressrespons ikke bare forandre sammensetningen av blodet, men representerer også et teknisk hindring for blodprøvetaking på grunn av innsnevringen av vaskulaturen via økte driv fra det sympatiske nervesystemet. Det blir stadig vanskeligere å få jevn blodstrømmen fra en rotte som er montering en akutt stressrespons. Derfor må dyrets nød være minimsert for å raskt få tak i prøver som gjenspeiler den fysiologiske tilstand av interesse.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Virginia Doherty og Junmei Yao for teknisk assistanse. Denne forskningen ble finansiert av NIMH (R01 MH084966) og US Army Research Office og Defense Advanced Research Projects Agency (gi W911NF-10-1-0059) til KAG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin (1,000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor rinse-chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1 cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500 ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, 0.75 in width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
- Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction. Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).
- Shah, R., et al. Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).
- Chan, M. K., et al. Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders. Prog Neurobiol. , (2014).
- Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents. PLoS One. 7 (12), e51431 (2012).
- Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats. Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).
- Vahl, T. P., et al. Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).
- Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress. Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).
- McEwen, B. S. Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators. Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).
- Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress. Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).
- Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear. Mol Psychiatry. , (2013).
- Knoll, A. T., Carlezon, W. A. Dynorphin, stress, and depression. Brain Res. 1314 (56-73), (2010).
- Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder. Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).
