Introduction
Биомаркеров, полученные из крови предоставить полезную диагностическую, можно предсказать, и стратификации меры во многих клинических ситуациях, в том числе сердечно-сосудистых заболеваний, рака 1 2 наук и психиатрической болезни 3. Они также могут быть использованы в фундаментальной науке, чтобы оценить «состояние» организма, в том числе от степени голода, воспаления, или стресс настоящее время. Такие меры могут быть под влиянием переменных, которые могут или не могут иметь решающее значение для вопроса о процентах, в том числе от времени суток, что получается образец и пола испытуемых. Он также может быть под влиянием стресса, вызванного во время процедур отбора проб крови сам. Гормоны стресса и восприятие боли может быстро изменить состав крови.
Грызуны являются наиболее широко используемым лабораторным животным, а несколько методов были разработаны для сбора крови. Идеальный метод отбора проб крови должны иметь минимальную physiologicaл воздействие на животных, не требуют анестезии, позволяют быстро и повторный отбор, и обеспечить достаточный объем крови для многочисленных последующих применений. Популярные методы для сбора крови, таких как катетеризации яремной вены или кончика хвоста ампутации не отвечают этим критериям.
Целью данного протокола является описание методики отбора проб крови для использования у крыс, которые минимально стресс, не требует анестезии, позволяет несколько сборников крови в течение одного субъекта, и обеспечивает относительно большой объем пробы таким образом, что несколько анализы могут быть выполнены на одном образце. Цель этого метода является получение образцов крови, которые минимально влиянием острой реакции на стресс.
Protocol
Все эксперименты проводились с использованием взрослых мужчин Лонг-Эванс крыс. Все процедуры проводились в соответствии с Национальными Институтами (NIH) Руководство здравоохранения для ухода и использования лабораторных животных и были одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных из Массачусетского технологического института и уходу и использованию животных рассмотрению Управлением по USAMRMC.
1. Подготовка
- Heparinise катетер и шприц, поместив экранированный иглу в 500 мкл пробирку, содержащую гепарин (1000 USP единиц / мл), а затем аспирации и вытесняя раствор гепарина через иглу.
- Приложите бабочка катетер шприца. Держать экран над иглой катетера, чтобы защитить острый кончик от повреждений.
- Вывод объем гепарина, который немного больше, чем объем крови, которые будут собраны. Снять шприц и заполнить его с воздухом.
- Повторно приложить шприц с катетером и использоватьвоздух выгнать излишки раствора гепарина; обеспечить только следовые количества остаются в насосно-компрессорных труб, иглы, и шприц.
- Поместите стерильную катетер, со шприцем еще прикрепленным на стерильной поверхности.
- Быстро обеспечить крысу в чистую ткань, обеспечивая, что передних и hindpaws находятся в удобном положении и дыхание ограничений.
- Закрепите пленку с крючка и петли ленты; обеспечить, чтобы внешние половые органы не стягивается.
- Попросите помощника осторожно и твердо сдерживать крысу (живот и основания хвоста) на твердой поверхности работы с хвостом висит от края прилавка.
2. Кровь проб
- Погрузитесь хвост в 42 ° C воде в течение 40-50 сек расширять кровеносные сосуды и сухой хвост с бумажным полотенцем. Найдите в хвостовую вену, чтобы пустить кровь (повернуть все тело с хвостом, чтобы предотвратить скручивание хвост).
Примечание: Достаточное потепление хвоста имеет решающее значение для быстрого Collectioп образце крови. Если сосудистая сжимается, правильное размещение катетера трудно, и поток крови значительно снижается. Грелку можно использовать в качестве альтернативы погружения в воду. - Определить точку отбора проб.
Примечание: артерии лежит вдоль середины спинной части хвоста; не использовать это для отбора проб.- Целевая либо левые и правые задние вены, которые находятся сбоку от артерии. Пигментация хвоста, которая зависит от штамма и увеличивается с возрастом, может скрывать некоторые из сосудов. Задача часть вены в нижней части хвоста.
- Протрите целевую область с 2% раствором антисептика хлоргексидина.
- Создание отрицательное давление в шприце и катетера путем отвода плунжера от нуля до примерно 50 мкл.
- Держите хвост мягко и твердо вблизи вершины, чтобы держать хвост прямо на протяжении отбора проб. Убедитесь, что поток крови не поглощается чрезмерно жесткий контроль.
- Медленно вставьте катетер в вену под небольшим углом примерно 5 см от кончика хвоста. Когда вены проник, кровь будет течь в катетер. Медленно снять поршень шприца, чтобы собрать нужную громкость на постоянной скоростью (~ 20 мкл в секунду).
- Проконсультируйтесь с ветеринарным персонал для информации о максимальном объеме в крови, что может быть собрана. Максимальное количество крови, которые должны быть собраны, зависит от веса и состояния здоровья крысы. Не снимать более 15% от общего объема крови в течение 14 дней.
Примечание: кровь гораздо сложнее собрать от животных, которые были остро подчеркнули в минут до сбора проб, потому что гормоны стресса сжимают сосудистую. Например, перемещение домой клетку крысы в новую камеру, принимая несколько минут, чтобы обернуть животное, или повторное введение катетера в вену все, скорее всего, чтобы вызвать острую реакцию на стресс. - Содействие Blooд поток от '' доения вен. Запуск пальцем по длине вены, из базы в направлении кончика хвоста, но остаются более 2 см от кончика вставленной иглы или катетера может смещаться из вены.
- Если кровь не может быть успешно собраны из исходного места проникновения катетера, повторно вставить иглу дальше в вену. Если кровь была собрана на начальном участке, вновь давление иглы, отсоединив и затем подсоединить катетер и шприц до повторной установки в вену. В общем, избежать дополнительных проходов.
- Как несколько проникновений может вызвать крах в хвостовую вену, в которой кровоснабжение хвоста отрезать и мягкие ткани хвост становится некротической, усыпить крысу, если есть хвост коллапс вен.
- Проконсультируйтесь с ветеринарным персонал для информации о максимальном объеме в крови, что может быть собрана. Максимальное количество крови, которые должны быть собраны, зависит от веса и состояния здоровья крысы. Не снимать более 15% от общего объема крови в течение 14 дней.
- Когда адекватный объем выборки собирают, сбросьте давление в шприце, отключив и повторно катетер. Аспирируйте немного с помощью шприца (~ 50 & #181; л), и вывести иглу из вены.
Примечание: Если игла выведены без предварительного сброса давления в шприце, кровь будет капать из иглы. - Кратко оказать давление на месте введения, чтобы остановить кровотечение, и протрите раствором антисептика. Вернуться крысы его клетку.
3. Обработка образца крови
- Аспирируйте воздуха, чтобы обеспечить кровь не остается внутри катетера иглой, и использовать ножницы, чтобы вырезать трубки катетера чуть выше иглы. Выгнать кровь в стерильный 1,5 мл трубки микроцентрифужных.
Примечание: Если кровь проталкивается через иглу, усилие сдвига может вызвать эритроциты к разрыву, который может помешать многих последующих анализов. Снимите иглу, чтобы избежать гемолиза.- Для сбора плазмы крови, использование труб, которые содержат ЭДТА в качестве антикоагулянта (здесь, использовать 10 мкл 0,1 М ЭДТА для 200-400 мкл крови, обеспечить концентрацию EDTA используется не мешает жIth вниз по течению анализа) и место на льду.
- Спин целые образцы крови при 2100 мкг в охлажденном центрифуге (4 ° C) в течение 10 мин в течение 10 мин сбора. Элюируют плазмы, избегая нарушения красные и белые слои клеток крови.
- Для сбора сыворотки крови, место образцов (без антикоагулянта) при комнатной температуре в течение до 30 мин для того, чтобы свертывание. Спин трубы сбора в охлажденном центрифуге (4 ° C) в 2000 х г. Затем может быть элюировали в сыворотке.
- Для сбора плазмы крови, использование труб, которые содержат ЭДТА в качестве антикоагулянта (здесь, использовать 10 мкл 0,1 М ЭДТА для 200-400 мкл крови, обеспечить концентрацию EDTA используется не мешает жIth вниз по течению анализа) и место на льду.
- Используйте образцы немедленно, или хранить при -80 ° С в течение до одного года.
Representative Results
Плазма крови собирали из хвостовой вены боковой, как описано в протоколе дает образец плазмы, который был прозрачным и бледно-желтый внешний вид. Как показано на рисунке 1, гемолиз в пробе придает красноватый оттенок в плазме. Острая реакция на стресс может быстро изменить состав крови. Например, концентрация циркулирующего кортикостерона может заметно увеличить течение 10 мин воздействия стрессора, как показано на рисунке 2. Низкие базальные уровни кортикостерона, полученные с помощью этого метода до стрессора воздействия показывают, что сама процедура отбора проб не является существенным источником стресса.
Рисунок 1:. Пример внешний вид (А) гемолизу образец показал. После центрифугирования плазмы или сыворотки слой (поверхность обозначено черным ARстрока) появится с оттенком розового или красного цвета. Более темные оттенки указывают на более высокий уровень гемолиза. (B) После центрифугирования, собранной за образец будет иметь четкое впечатление, желтовато к верхней полосе (поверхности, указанной черной стрелкой), что соответствует без гемолиза плазме или сыворотке. При удалении этот слой, важно, чтобы не нарушать основной цельной крови, либо путем нажатия пипетки в целом слоя крови или путем аспирации некоторые из цельной крови в наконечник. Любая плазма или сыворотка загрязнены цельной крови должны быть отброшены.
Рисунок 2: Плазма кортикостерона быстро повышается после стрессовой ситуации кровь получали от боковой хвостовой вены у взрослых самок крыс Long-Evans до и 10 минут после воздействия 4 тонов (10 сек, 2 кГц, 85 дБ) со-терминатор. с Footshocks (1 сек, 350 мкА). Плазма крови кортикостерона в исходном (290,4 ± 138,8 пг / мл) был значительно меньше, чем уровни наблюдались следующие 10 мин презентации Footshock стресса (2204,8 ± 454,5 пг / мл, р = 0,02, N = 4), как определено с помощью парного T -test. * Р <0,05
Discussion
Здесь мы описываем быстрый и простой процедуры для получения образца крови от крыс, которые предлагает значительные преимущества по сравнению с другими широко используемыми методами. Во-первых, оно не требует анестезии, в отличие от выборки из яремной вены или заглазничными синуса. При образцы крови собирали окружающих поведенческие процедуры, введение анестетиков является нежелательным, поскольку это может помешать обучения и памяти 4,5. Во-вторых, это дает возможность собирать большие объемы крови, чем другие методы вены руки, например, коллекции из подкожных или спинной педали вен. Используя методику, описанную здесь, до 1,5 мл крови может быть собрана из крыс в одной точке времени, объем которого легко позволяет нескольким анализы, чтобы быть работать параллельно. Наконец, эта процедура сводит к минимуму возможность повреждения тканей по сравнению с кончика хвоста ампутации или ретроорбитального кровотечения. Использование этой процедуры способствует соблюдение животных WЗакон elfare и Руководство по уходу и использованию лабораторных животных, которые требуют минимизации боли и страдания, которые являются результатом лабораторных процедур, выполняемых на животных.
Рекомендуется, что следователи новые этому методу практикуют методы удержания и хвост кровотечение, чтобы минимизировать время, что экспериментальные животные сдержанный. Кровь собирали в менее чем 3 мин от начала ограничения обеспечивает оптимальные результаты.
Протокол, описанный здесь, может быть использован для отбора проб от 1 до 4 раз в неделю, но не более двух раз в день. Хотя повторяющиеся коллекции крови могут быть выполнены различные участки отбора проб двигаться вверх от основания хвоста должны быть использованы, и левый и правый хвостовой вены следует чередовать в местах отбора проб. Общий объем крови грызунов 6-7% от их веса тела, и не более 15% от общего объема крови не должны быть собраны в течение 2-недельного периода. Сывороткаили плазма содержит приблизительно 40-60% от собранного объема образца.
Забор крови с помощью боковых хвостовых вен может быть также выполнен в мыши, как описано здесь, с небольшими изменениями. Во-первых, можно использовать только небольшое калибровочные (27 г) катетеры. Во-вторых, рекомендуется использовать трубки фиксатор, а не пленкой, для иммобилизации мышей. Объем крови, которые могут быть получены от мыши с помощью венепункции подчелюстной сосудистого пучка (200-500 мкл) больше, чем может быть безопасно собраны из хвостовой вены (200 мкл максимум). Потому что забор крови из подчелюстной сосудистого пучка требуется минимальное сдержанность и может дать больше крови, это предпочтительный путь для отбора проб на мышах.
Быстрота, с которой эта процедура может быть выполнена, вместе с минимально инвазивной природы, а также сводит к минимуму потенциальную возмущение мер кровь основана острой реакции на стресс 6.острый ответ напряжения может изменить циркулирующие уровни многих молекул, в том числе интерлейкинов и других иммунных активных факторов 7, гормонов гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси 8, гормонов в симпатической нервной системе, 9 грелина 10, эндогенных опиоидов 11, дофамина, и серотонина 12. Если покоящиеся циркулирующих меры этих молекул или других регулируемых этими молекулами желательно, важно, чтобы свести к минимуму реакцию на стресс, который срабатывает в течение всего лишь одной минуты от начала экспозиции стрессора.
Ответные реакции на стресс не только изменить состав крови, но и представлять собой техническую препятствие для забора крови из-за сужения сосудов за счет увеличения приводом от симпатической нервной системы. Это становится повышение трудно получить устойчивый поток крови от крыс, которые монтажа острый стресс-ответа. Таким образом, бедствия животного должен быть минимциализированных для того, чтобы быстро получить образцы, которые отражают физиологическое состояние интереса.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Вирджиния Доэрти и Junmei Яо технической помощи. Это исследование было профинансировано (NiMH R01 MH084966), и армии Research Office США и обороны перспективных исследований Проекты агентства (грант W911NF-10-1-0059) к КАГ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin (1,000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor rinse-chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1 cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500 ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, 0.75 in width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
- Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction. Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).
- Shah, R., et al. Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).
- Chan, M. K., et al. Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders. Prog Neurobiol. , (2014).
- Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents. PLoS One. 7 (12), e51431 (2012).
- Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats. Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).
- Vahl, T. P., et al. Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).
- Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress. Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).
- McEwen, B. S. Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators. Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).
- Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress. Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).
- Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear. Mol Psychiatry. , (2013).
- Knoll, A. T., Carlezon, W. A. Dynorphin, stress, and depression. Brain Res. 1314 (56-73), (2010).
- Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder. Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).
