Introduction
Biomarcadores obtenidos a partir de sangre proporcionan utilidad de diagnóstico, predicción y estratificación medidas en muchos contextos clínicos, incluyendo la enfermedad cardiovascular 1, ciencias cáncer 2 y enfermedad psiquiátrica 3. También pueden ser utilizados en la ciencia básica para evaluar el "estado" de un organismo, incluyendo el grado de hambre, la inflamación, o el estrés presente. Estas medidas pueden ser influenciados por variables que pueden o no pueden ser críticos a la pregunta de interés, incluyendo la hora del día en que se obtiene la muestra y el sexo de los sujetos. También puede estar influenciada por la tensión inducida durante el propio procedimiento de muestreo de sangre. Las hormonas del estrés y la percepción del dolor pueden alterar rápidamente la composición de la sangre.
Los roedores son el animal de laboratorio más comúnmente utilizado, y múltiples métodos han sido desarrollados para la recogida de sangre. El método ideal de muestreo de sangre debe tener physiologica mínimol impacto sobre el animal, no requieren anestesia, permite muestreo rápido y repetido, y proporcionar el volumen de sangre suficiente para numerosas aplicaciones posteriores. Técnicas populares para la recogida de la sangre, como la cateterización de la vena yugular o la amputación de la cola de punta no cumplen con estos criterios.
El objetivo de este protocolo es describir una técnica de muestreo de sangre para su uso en ratas que es mínimamente estresante, no requiere anestesia, permite múltiples colecciones de sangre dentro de un mismo tema, y ofrece un volumen de muestra relativamente grande tal que varios ensayos pueden realizarse en una sola muestra. El objetivo de este método es la obtención de muestras de sangre que están mínimamente influenciados por la respuesta de estrés agudo.
Protocol
Todos los experimentos se realizaron utilizando adulto ratas macho Long-Evans. Todos los procedimientos fueron de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud (NIH) Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional Cuidado de Animales y el empleo del Instituto de Tecnología de Massachusetts y el Cuidado de Animales y el Empleo Oficina de Revisión de el USAMRMC.
1. Preparación
- Heparinise el catéter y la jeringa mediante la colocación de la aguja blindado en un tubo que contenía heparina 500 l (1.000 unidades USP / ml) y, a continuación aspirando y expulsando solución de heparina a través de la aguja.
- Adjuntar un catéter de mariposa a la jeringa. Mantenga el escudo sobre la aguja del catéter para proteger la punta afilada de los daños.
- Retirar un volumen de heparina que es ligeramente mayor que el volumen de sangre que se recoge. Separe la jeringa y llenarlo con aire.
- Vuelva a colocar la jeringa al catéter y utilizar elde aire para expulsar el exceso de solución de heparina; garantizan solamente trazas permanecen en los tubos, agujas y jeringas.
- Coloque el catéter estéril, con la jeringa todavía unida, sobre una superficie estéril.
- Asegurar rápidamente la rata en un paño limpio asegurando que delanteras y patas traseras se encuentran en una posición cómoda y la respiración es irrestricta.
- Asegure la envoltura con gancho y lazo de cinta; asegurar que los genitales externos no están constreñidos.
- Tener un ayudante con suavidad y firmeza frenar la rata (abdomen y base de la cola) sobre una superficie sólida con la cola colgando del borde del mostrador.
Muestreo 2. Sangre
- Sumerja la cola de 42 ° C el agua para 40 a 50 segundos para dilatar los vasos sanguíneos y seque la cola con una toalla de papel. Localice la vena de la cola para ser desangrado (girar todo el cuerpo con la cola para evitar torcer la cola).
Nota: el calentamiento suficiente de la cola es crítico para la rápida collection de una muestra de sangre. Si se estrecha la vasculatura, la colocación apropiada del catéter es difícil, y el flujo sanguíneo se reduce enormemente. Una almohadilla de calentamiento puede ser utilizado como una alternativa a la inmersión en agua. - Identificar el punto de muestreo.
Nota: La arteria se encuentra a lo largo del aspecto mediados de dorsal de la cola; no utilice este para el muestreo.- Objetivo, ya sea las venas de la cola izquierda y derecha que se encuentran lateral a la arteria. La pigmentación de la cola, que varía por la tensión y aumenta con la edad, puede oscurecer algunos de la vasculatura. Objetivo a una porción de la vena en la parte inferior de la cola.
- Limpie el área objetivo con clorhexidina al 2% solución antiséptica.
- Crear una presión negativa en la jeringa y el catéter al retirar el émbolo de cero a aproximadamente 50 l.
- Mantenga la cola suave y firmemente cerca de la punta para mantener la cola recta durante la recogida de muestras. Asegúrese de que el flujo sanguíneo no está ocluida por un agarre demasiado apretado.
- Lentamente insertar el catéter en la vena en un ángulo superficial de aproximadamente 5 cm de la punta de la cola. Cuando se penetra la vena, la sangre fluirá en el catéter. Retire lentamente el émbolo de la jeringa para recoger el volumen deseado a un ritmo constante (~ 20 l por segundo).
- Consulte al personal veterinario para obtener información sobre el volumen de sangre máxima que se puede recoger. La cantidad máxima de sangre que debe ser recogido depende del estado de peso y la salud de la rata. No retirar más de 15% del volumen total de sangre en un período de 14 días.
Nota: La sangre es mucho más difícil de cobrar a los animales que se destacaron de forma aguda en los minutos previos a la recogida de muestras, porque las hormonas del estrés constriñen los vasos. Por ejemplo, mover jaula de la rata a una habitación novela, teniendo varios minutos para envolver el animal, o inserción repetida del catéter en una vena son todos propensos a desencadenar una respuesta de estrés agudo. - Facilitar blooflujo d por "ordeñar" la vena. Ejecutar un dedo a lo largo de la longitud de la vena, desde la base hacia la punta de la cola, pero siguen siendo más de 2 cm desde la punta de la aguja que se inserta el catéter o puede desprenderse de la vena.
- Si la sangre no puede ser recogido con éxito desde el sitio inicial de la penetración del catéter, vuelva a insertar la aguja más arriba en la vena. Si la sangre se recogió en el lugar inicial, re-presurizar la aguja desconectando y volviendo a conectar el catéter y la jeringa antes de la re-inserción en la vena. En general, evitar las penetraciones adicionales.
- Como múltiples penetraciones pueden causar colapso vena de la cola, en el que el suministro de sangre a la cola se corta y el tejido blando de la cola se vuelve necrotizado, la eutanasia la rata si hay cola colapso vena.
- Consulte al personal veterinario para obtener información sobre el volumen de sangre máxima que se puede recoger. La cantidad máxima de sangre que debe ser recogido depende del estado de peso y la salud de la rata. No retirar más de 15% del volumen total de sangre en un período de 14 días.
- Cuando se recoge el volumen de muestra adecuado, liberar la presión en la jeringa al desconectar y volver a conectar el catéter. Aspirar ligeramente mediante el émbolo de la jeringa (~ 50 & #181; l), y retirar la aguja de la vena.
Nota: Si se retira la aguja sin primero liberando la presión en la jeringa, la sangre gotea desde la aguja. - Brevemente aplique presión en el sitio de inserción para detener el sangrado, y limpie el área con solución antiséptica. Regreso a la rata a su jaula.
3. Procesamiento de la muestra de sangre
- Aspirar el aire para asegurar que no sangre permanece dentro de la aguja del catéter, y el uso de las tijeras para cortar el tubo del catéter justo por encima de la aguja. Expulsar la sangre en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril.
Nota: Si la sangre es empujada a través de la aguja, la fuerza de cizallamiento puede causar que las células rojas de la sangre a la ruptura que puede interferir con muchos ensayos aguas abajo. Retire la aguja para evitar la hemólisis.- Para recoger el plasma sanguíneo, las trompas de uso que contienen EDTA como anticoagulante (en este caso, utilice 10 l de EDTA 0,1 M de 200 a 400 l de sangre; garantizar la concentración de EDTA empleada no interfiere won el ensayo de aguas abajo) y el lugar en el hielo.
- Girar muestras de sangre entera a 2100 xg en una centrífuga refrigerada (4 ° C) durante 10 min a menos de 10 min de la recolección. Eluir el plasma, evitando molestar a las capas de glóbulos rojos y blancos.
- Para recoger el suero sanguíneo, lugar muestras (sin anticoagulante) a temperatura ambiente durante un máximo de 30 minutos para permitir la coagulación. Haga girar los tubos de recogida en una centrífuga refrigerada (4 ° C) a 2000 x g. El suero puede entonces ser eluido.
- Para recoger el plasma sanguíneo, las trompas de uso que contienen EDTA como anticoagulante (en este caso, utilice 10 l de EDTA 0,1 M de 200 a 400 l de sangre; garantizar la concentración de EDTA empleada no interfiere won el ensayo de aguas abajo) y el lugar en el hielo.
- Use muestras de inmediato, o tienda a -80 ° C durante un máximo de un año.
Representative Results
Plasma de la sangre obtenida de la vena lateral de la cola como se describe en el protocolo da una muestra de plasma que era translúcida y de color amarillo pálido en apariencia. Como se muestra en la Figura 1, la hemólisis en una muestra imparte un tinte rojo a la plasma. La respuesta de estrés agudo puede alterar rápidamente la composición de la sangre. Por ejemplo, la concentración de corticosterona circulante puede aumentar notablemente dentro de 10 minutos de exposición factor de estrés, como se muestra en la Figura 2. Los bajos niveles basales de corticosterona obtenidos con este método antes de la exposición estresores revelan que el procedimiento de muestreo en sí no es una fuente significativa de estrés.
Figura 1: se muestra el aspecto de la muestra (A) Una muestra hemolizada.. Después de la centrifugación, el plasma o suero capa (superficie indicada por la ar negrofila) aparece teñida de color rosa o rojo. Tintes más oscuros indican mayores niveles de hemólisis. (B) Después de la centrifugación, una muestra recogida correctamente tendrá un claro, aspecto amarillento a la banda superior (superficie indicada por la flecha negro), que corresponde a la del plasma no hemolizado o suero. Cuando la eliminación de esta capa, es importante para no molestar a la sangre entera subyacente, ya sea empujando la punta de la pipeta en toda la capa de sangre o por aspiración de algunos de toda la sangre en la punta. Cualquier plasma o suero contaminado con sangre entera deben desecharse.
Figura 2: corticosterona plasma se eleva rápidamente después de una experiencia estresante Se obtuvo sangre de la vena lateral de la cola de ratas adultas Long-Evans hembra antes y 10 min tras la exposición a 4 tonos (10 seg, 2 kHz, 85 dB) co-terminación. con footshocks (1 seg, 350 mu). Corticosterona en plasma de sangre al inicio del estudio (290,4 ± 138,8 pg / ml) fue significativamente menor que los niveles observados 10 min después de la presentación de la tensión de descarga en las patas (2204,8 ± 454,5 pg / ml, p = 0,02, n = 4), según lo determinado por t pareada -test. *, P <0,05
Discussion
Aquí se describe un procedimiento rápido y sencillo para la obtención de una muestra de sangre de una rata que ofrece importantes ventajas sobre otras técnicas de uso común. En primer lugar, no requiere anestesia, en contraste con el muestreo de la vena yugular o seno retroorbital. Cuando se recogen muestras de sangre que rodea procedimientos conductuales, la administración de anestésicos no es deseable porque puede interferir con el aprendizaje y 4,5 memoria. En segundo lugar, ofrece la posibilidad de recoger volúmenes de sangre más grandes que otras técnicas de venopunción, como la recogida de las venas safena pedal o dorsales. Usando la técnica descrita aquí, hasta 1,5 ml de sangre se puede recoger de una rata en un solo punto de tiempo, un volumen que permite fácilmente múltiples ensayos que se ejecutan en paralelo. Por último, este procedimiento minimiza el potencial de daño a los tejidos en comparación con la amputación punta de la cola o sangrado retroorbital. El uso de este procedimiento facilita el cumplimiento del Animal WLey elfare y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, el cual requiere reducir al mínimo el dolor y la angustia que resultan de procedimientos de laboratorio realizadas en los animales.
Se recomienda que los investigadores nuevos para este método practican las técnicas de inmovilización y de sangrado de la cola con el fin de minimizar el tiempo que los animales experimentales son restringidos. La sangre recogida en menos de 3 minutos desde el inicio de la restricción proporciona resultados óptimos.
El protocolo descrito aquí puede utilizarse para el muestreo de 1 a 4 veces por semana, pero no más de dos veces por día. Mientras que las colecciones de sangre repetidas pueden llevar a cabo, diferentes sitios de muestreo que se mueven hacia arriba desde la base de la cola deben ser utilizados, y las venas de la cola izquierda y derecha deben alternarse como sitios de muestreo. El volumen total de sangre de los roedores es 6-7% de su peso corporal, y no más de 15% del volumen total de la sangre se debe recoger dentro de un período de 2 semanas. Sueroo plasma comprende aproximadamente un 40-60% del volumen de muestra recogida.
Las muestras de sangre a través de las venas de la cola laterales también se puede realizar en el ratón como se describe aquí con algunas modificaciones menores. En primer lugar, se pueden usar sólo pequeñas de calibre (27 G) catéteres. En segundo lugar, se recomienda utilizar un tubo de contención, en lugar de una envoltura, para inmovilizar los ratones. El volumen de sangre que se puede obtener desde el ratón usando venopunción del haz vascular submandibular (200-500 l) es mayor que se pueden recoger de forma segura desde la vena de la cola (200 l máximo). Debido a que el muestreo de sangre del paquete vascular submandibular requiere restricción mínima y puede producir más sangre, ésta es la ruta preferida para el muestreo en el ratón.
La rapidez con la que se puede realizar este procedimiento, junto con su naturaleza mínimamente invasiva, también minimiza la perturbación potencial de las medidas basadas en la sangre por la respuesta de estrés agudo 6. Losrespuesta al estrés agudo puede alterar los niveles circulantes de muchas moléculas, incluyendo las interleucinas y otros factores inmunes activa 7, hormonas del eje hipotálamo-hipófisis-suprarrenal 8, hormonas en el sistema nervioso simpático 9, 10 grelina, opioides endógenos 11, dopamina, y serotonina 12. Si se desean medidas de reposo circulantes de estas moléculas u otros regulados por estas moléculas, es importante para minimizar la respuesta al estrés, que se activa dentro de tan poco como un minuto del inicio de la exposición factor estresante.
Las respuestas al estrés no sólo alteran la composición de la sangre, sino que también representan un obstáculo técnico para el muestreo debido a la constricción de los vasos de la sangre a través de una mayor unidad del sistema nervioso simpático. Se vuelve cada vez mayor dificultad para obtener el flujo de sangre constante de una rata que está montando una respuesta de estrés agudo. Por lo tanto, la angustia del animal debe ser minimzado con el fin de obtener rápidamente muestras que reflejan el estado fisiológico de interés.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Virginia Doherty y Junmei Yao para la asistencia técnica. Esta investigación fue financiada por el NIMH (R01 MH084966), y la Oficina de Investigación del Ejército de Estados Unidos y la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (conceder W911NF-10-1-0059) a KAG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin (1,000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor rinse-chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1 cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500 ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, 0.75 in width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
- Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction. Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).
- Shah, R., et al. Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).
- Chan, M. K., et al. Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders. Prog Neurobiol. , (2014).
- Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents. PLoS One. 7 (12), e51431 (2012).
- Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats. Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).
- Vahl, T. P., et al. Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).
- Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress. Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).
- McEwen, B. S. Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators. Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).
- Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress. Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).
- Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear. Mol Psychiatry. , (2013).
- Knoll, A. T., Carlezon, W. A. Dynorphin, stress, and depression. Brain Res. 1314 (56-73), (2010).
- Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder. Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).
