Introduction
Biomarkörer erhållna från blod ge användbar diagnostik, automatisk, och stratifiering åtgärder i många kliniska sammanhang, bland annat hjärt-kärlsjukdom 1, cancervetenskap 2, och psykisk sjukdom 3. De kan också användas i grundforskning för att bedöma "tillståndet" för en organism, inklusive den grad av hunger, inflammation eller stress närvarande. Sådana åtgärder kan påverkas av variabler som kan eller inte kan vara avgörande för frågan om intresse, inklusive den tid på dagen som provet erhålls och kön av ämnena. Den kan även påverkas av den stress som induceras under de förfaranden blodprovtagnings själv. Stresshormoner och uppfattningen av smärta kan snabbt ändra sammansättningen av blodet.
Gnagare är de mest vanligen använda laboratoriedjur, och flera metoder har utvecklats för bloduppsamling. Den ideala metoden för blodprovstagning bör ha minimal physiological inverkan på djuret, kräver ingen bedövning, möjliggör snabb och upprepad provtagning, och ge tillräcklig volym blod för många tillämpningar nedströms. Populära tekniker för uppsamling av blod, såsom kateterisering av halsvenen eller svanstipp amputation inte uppfyller dessa kriterier.
Syftet med detta protokoll är att beskriva en blodprovtagningsteknik för användning hos råttor som är minimalt stressigt, inte kräver narkos, möjliggör för flera blod samlingar inom ett enda ämne, och ger en relativt stor provvolym så att flera analyser kan utföras på ett enda prov. Målet med denna metod är att erhålla blodprover som minimalt påverkas av den akuta stressrespons.
Protocol
Alla experiment gjordes med hjälp av vuxna manliga Long-Evans råttor. Alla förfaranden var i enlighet med den amerikanska National Institutes of Health (NIH) Guide för skötsel och användning av försöksdjur och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén av Massachusetts Institute of Technology och Djurvård och användning Review kontor den USAMRMC.
1. Förberedelse
- Heparinise katetern och sprutan genom den skärmade nålen placering i en 500 | il rör innehållande heparin (1000 USP-enheter / ml) och sedan aspirera och utdrivning heparinlösning genom nålen.
- Fäst en fjärilskateter till sprutan. Håll skärmen över nålen av katetern för att skydda den vassa spetsen mot skador.
- Dra tillbaka en volym av heparin som är något större än volymen av blod som kommer att samlas in. Lossa sprutan och fyll den med luft.
- Sätt tillbaka sprutan till katetern och användaluft att utvisa överflödig heparinlösning; säkerställa endast spårmängder finns kvar i slangen, nål och spruta.
- Placera den sterila katetern med sprutan fortfarande fastsatt på en steril yta.
- Snabbt säkra råtta i en ren trasa säkerställa att fram- och baktassar är i en bekväm ställning och andningen är obegränsad.
- Säkra wrap med kardborre band; se till att genitalier inte trängd.
- Låt en medhjälpare försiktigt och stadigt hålla råttan (buken och svansrot) på en fast arbetsyta med svansen hängande utanför kanten av disken.
2. Blodprovstagning
- Sänk svansen i 42 ° C vatten i 40-50 sekunder för att vidga blodkärlen och torka svansen med en pappershandduk. Leta svansvenen att luftas (rotera hela kroppen med svansen för att förhindra vrida svans).
Obs: Tillräcklig uppvärmning av svansen är avgörande för snabb collection av ett blodprov. Om vaskulaturen är förträngd, är korrekt placering av katetern svårt, och blodflödet är vida reduceras. En värmedyna kan användas som ett alternativ till nedsänkning i vatten. - Identifiera provtagningspunkten.
Obs: artären ligger längs mitt dorsala aspekten av svansen; inte använda detta för provtagning.- Target antingen vänster och höger svans vener som ligger i sidled till artären. Pigmentering av svansen, som varierar beroende på belastning och ökar med åldern, kan skymma en del av kärl. Rikta en del av venen i det nedre partiet av svansen.
- Torka målområdet med 2% klorhexidin antiseptisk lösning.
- Skapa undertryck i sprutan och katetern genom att dra tillbaka kolven från noll till ca 50 | il.
- Håll svansen försiktigt och stadigt nära spetsen för att hålla svansen rakt genom provtagning. Se till att blodflödet inte är tilltäppt av en alltför fast grepp.
- Sakta föra in katetern in i venen i en flack vinkel ungefär 5 cm från svansspetsen. När venen penetreras kommer blod strömma in i katetern. Dra långsamt upp kolven i sprutan för att samla in önskad volym i jämn takt (~ 20 l per sekund).
- Konsultera veterinär personal för information om den maximala volymen blod som kan samlas in. Den maximala mängden blod som ska samlas in beroende på vikt och hälsotillstånd hos råttan. Ta inte ut mer än 15% av den totala blodvolymen i en 14-dagarsperiod.
Obs: Blod är mycket svårare att samla in från djur som akut stressade i protokollet före provsamling eftersom stresshormoner ihop kärl. Exempelvis flyttar råttans buren ett nytt rum, tar flera minuter att linda djuret, eller upprepat införande av katetern i en ven är alla benägna att utlösa en akut stress. - Underlätta blood-flöde med "mjölkning" venen. Kör ett finger utmed längden av venen, från basen mot spetsen av svansen, men förblir mer än 2 cm från spetsen av den införda nålen eller katetern kan lossna från venen.
- Om blodet inte kan framgångsrikt samlats in från den ursprungliga platsen för kateter penetration, sätt in nålen längre upp venen. Om blodet uppsamlades vid den inledande platsen, åter trycksätta nålen genom att koppla ur och sedan återansluta katetern och sprutan före åter införing i venen. I allmänhet undvika ytterligare genomföringar.
- Som flera genomföringar kan orsaka svansvenen kollaps, i vilka blodtillförseln till svansen är avskuren och den mjuka svansvävnad blir necrotized, euthanize råttan om det finns svansvenen kollaps.
- Konsultera veterinär personal för information om den maximala volymen blod som kan samlas in. Den maximala mängden blod som ska samlas in beroende på vikt och hälsotillstånd hos råttan. Ta inte ut mer än 15% av den totala blodvolymen i en 14-dagarsperiod.
- När tillräcklig provvolym samlas, släppa på trycket i sprutan genom att dra och återansluta katetern. Sug något med hjälp av sprutkolven (~ 50 & #181; l), och dra ut nålen från venen.
Obs: Om nålen dras tillbaka utan att först släppa trycket i sprutan, kommer blod droppa från nålen. - Gäller kort tryck på insättningsstället för att stoppa blödning, och torka av området med antiseptisk lösning. Återgå råttan att dess hem bur.
3. Behandling av blodprov
- Sug luft för att säkerställa inget blod kvar inuti kateter nålen och använd sax för att klippa kateterröret strax ovanför nålen. Utvisa blod i en steril 1,5 ml mikrocentrifugrör.
Obs: Om blod skjuts genom nålen, kan skjuvkraften orsakar röda blodkroppar att brista vilket kan störa många analyser nedströms. Ta bort nålen för att undvika hemolys.- För att samla blodplasma, använda rör som innehåller EDTA som antikoagulant (här, använd 10 pl 0,1 M EDTA för 200-400 il blod, se till att koncentrationen av EDTA inte påverkar wed nedströms analys) och lägg på is.
- Spin helblodprov vid 2100 x g i en kyld centrifug (4 ° C) under 10 minuter inom 10 min av samlingen. Eluera plasmat, undvika att störa de röda och vita blodcellskikt.
- För att samla blodserum, placera prover (utan antikoagulant) vid rumstemperatur i upp till 30 min för att möjliggöra koagulering. Snurra uppsamlingsrören i en kyld centrifug (4 ° C) vid 2000 X g. Serumet kan sedan elueras.
- För att samla blodplasma, använda rör som innehåller EDTA som antikoagulant (här, använd 10 pl 0,1 M EDTA för 200-400 il blod, se till att koncentrationen av EDTA inte påverkar wed nedströms analys) och lägg på is.
- Använd prover omedelbart eller förvara vid -80 ° C i upp till ett år.
Representative Results
Blodplasma från det laterala svansvenen såsom beskrivs i protokollet ger ett plasmaprov som var genomskinligt och blekgul till utseendet. Såsom visas i fig 1, hemolys i ett prov ger en röd nyans till plasman. Den akuta stressrespons kan snabbt ändra sammansättningen av blod. Till exempel kan cirkulera kortikosteron koncentrationen markant öka inom 10 min av stressexponering, såsom visas i figur 2. Den låga basala nivåer av kortikosteron som erhållits med denna metod före stressexponering visar att provtagningsförfarandet i sig är inte en betydande källa till stress.
Figur 1:. Prov utseende (A) En hemolyserat prov visas. Efter centrifugering, plasma eller serum skiktet (ytan som indikeras av den svarta arv) visas skiftar i rosa eller rött. Mörkare nyanser indikerar högre nivåer av hemolys. (B) Efter centrifugering, kommer en korrekt uppsamlade provet har en klar, gulaktig utseende till det övre bandet (yta anges av den svarta pilen), som motsvarar den icke-hemolyserat plasma eller serum. Vid demontering detta skikt, är det viktigt att inte störa den underliggande helblod, antingen genom att trycka på pipettspetsen i helblod skikt eller genom att aspirera en del av helblodet in i spetsen. Alla plasma eller serum kontaminerat med helblod ska kasseras.
Figur 2: Plasma kortikosteron snabbt förhöjd efter en stressande upplevelse Blod erhölls från den laterala svansvenen hos vuxna kvinnliga Long-Evans-råttor före och 10 min efter exponering för 4 toner (10 sek, 2 kHz, 85 dB) sam-terminer. med footshocks (1 sek, 350 iA). Blodplasma kortikosteron vid baslinjen (290,4 ± 138,8 pg / ml) var betydligt mindre än de nivåer som observerades 10 min efter presentationen av footshock stress (2204,8 ± 454,5 pg / ml, p = 0,02, n = 4), som bestäms genom parat t -testet. *, P <0,05
Discussion
Här beskriver vi ett snabbt och enkelt förfarande för att erhålla ett blodprov från en råtta som erbjuder betydande fördelar jämfört med andra vanliga tekniker. För det första behöver den inte narkos, i motsats till provtagning från halsvenen eller retroorbital sinus. När blodprov samlas kring beteende förfaranden, är administrering av bedövningsmedel önskvärt eftersom det kan störa inlärning och minne 4,5. För det andra, det ger möjlighet att samla större blodvolymer än andra venpunktion tekniker, till exempel insamling från vena eller rygg pedal ådror. Användning av den teknik som beskrivs här, upp till 1,5 ml blod kan uppsamlas från en råtta vid en enda tidpunkt, en volym som lätt tillåter multipla analyser kan köras parallellt. Slutligen, minimerar detta förfarande risken för vävnadsskada jämfört med svanstipp amputation eller retroorbital blödning. Användningen av detta förfarande underlättar efterlevnaden av de djur Welfare lagen och Guide för skötsel och användning av försöksdjur, som kräver att minimera smärta och ångest som ett resultat av laboratoriegranskningsåtgärder som vidtas på djur.
Det rekommenderas att utredarna nya med denna metod öva de tekniker återhållsamhet och svans blödnings för att minimera den tid som försöksdjur är fastspända. Blod uppsamlades i mindre än tre minuter från initieringen av återhållsamhet ger optimala resultat.
Protokollet som beskrivs här kan användas för provtagning av 1 till 4 gånger per vecka, men inte mer än två gånger per dag. Även upprepade blodsamlingar kan utföras, bör olika provtagningsställen flyttar uppåt från svansroten skall användas och de vänstra och högra svans vener bör altern som provtagningsplatser. Den totala blodvolymen hos gnagare är 6-7% av sin kroppsvikt, och inte mer än 15% av den totala blodvolymen bör samlas inom en två veckors period. Serumeller plasma utgör cirka 40-60% av den insamlade prowolymen.
Blodprovstagning via de laterala venerna svans kan också utföras i mus såsom beskrivits här med några mindre modifieringar. För det första kan endast liten spårvidd (27 G) katetrar användas. För det andra, är det rekommenderat att använda en tub restrainer, snarare än en wrap, att immobilisera mössen. Volymen av blod som kan erhållas från musen med hjälp av venpunktion av submandibular vaskulära bunt (200-500 il) är större än vad som kan säkert hämtas från svansvenen (200 l max). Eftersom provtagning blod från submandibular vaskulära bunten kräver minimal återhållsamhet och kan ge mer blod, är detta den föredragna vägen för provtagning i musen.
Den snabbhet med vilken detta förfarande kan utföras, tillsammans med sin minimalt invasiva natur, minimerar också den potentiella störning av blodbaserade åtgärder av akut stress 6. Denakut stress kan förändra cirkulerande nivåer av många molekyler inkluderande interleukiner och andra immunaktiva faktorer 7, hormoner av hypotalamus-hypofys-binjure-axeln 8, hormoner i det sympatiska nervsystemet 9, ghrelin 10, endogena opioider 11, dopamin, och serotonin 12. Om vilande cirkulerande åtgärder av dessa molekyler eller andra regleras av dessa molekyler är önskvärda, är det viktigt att minimera den stress, som utlöses inom så lite som en minut av starten av stressexponering.
Stressreaktioner inte bara ändra sammansättningen på blodet, utan också utgör ett tekniskt hinder för provtagning på grund av sammandragning av vaskulaturen blod genom ökat enhet från det sympatiska nervsystemet. Det blir allt större svårt att få jämn blodflöde från en råtta som montering av en akut stress. Därför måste djurets nöd vara minimized för att snabbt erhålla prover som återspeglar det fysiologiska tillståndet av intresse.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Virginia Doherty och Junmei Yao för tekniskt stöd. Denna forskning har finansierats av NIMH (R01 MH084966), och den amerikanska armén Research Office och Defense Advanced Research Projects Agency (bevilja W911NF-10-1-0059) till KAG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin (1,000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor rinse-chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1 cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500 ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, 0.75 in width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
- Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction. Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).
- Shah, R., et al. Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).
- Chan, M. K., et al. Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders. Prog Neurobiol. , (2014).
- Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents. PLoS One. 7 (12), e51431 (2012).
- Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats. Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).
- Vahl, T. P., et al. Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).
- Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress. Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).
- McEwen, B. S. Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators. Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).
- Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress. Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).
- Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear. Mol Psychiatry. , (2013).
- Knoll, A. T., Carlezon, W. A. Dynorphin, stress, and depression. Brain Res. 1314 (56-73), (2010).
- Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder. Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).
