Introduction
Kanından elde edilen Biyomarkörler yararlı tanı, prediktif sağlamak ve kardiyovasküler hastalık 1, kanser bilimleri 2, ve psikiyatrik hastalık 3 dahil olmak üzere birçok klinik bağlamda önlemler stratifying. Onlar da açlık, inflamasyon, ya da stres mevcut derecesi de dahil olmak üzere, bir organizmanın "devlet" değerlendirmek için temel bilimlerdeki kullanılabilir. Bu tür önlemler ya da örnek elde edilir günün saatine ve konuların cinsiyet de dahil olmak üzere ilgi sorusuna, kritik olmayabilir değişkenler tarafından etkilenebilir. Aynı zamanda kan örnekleme prosedürleri kendini sırasında uyarılan strese etkilenebilir. Stres hormonları ve ağrı algısı hızla kan bileşimini değiştirebilir.
Kemirgenler en sık kullanılan laboratuar hayvanları, ve birden çok yöntem, kan toplama için geliştirilmiştir. kan örneklemesi ideal yöntem asgari physiologica olmalıdırHayvansal l etkisi, anestezi gerektirmez, hızlı ve tekrarlanan örnekleme izin ve çok sayıda downstream uygulamalar için yeterli kan hacmi sağlar. Bu tür kriterlere uymayan şahdamarı veya kuyruk ucu amputasyon kateterizasyon olarak kan toplamak için Popüler teknikleri.
Bu protokolün amacı, anestezi gerektirmez, minimal stresli farelerde kullanılmak üzere bir kan numunesi alma tekniği açıklamak için bir tek bir konu içinde birden fazla kan alma sağlar ve çok sayıda deneyler gerçekleştirilebilir, öyle ki nispeten büyük bir numune hacmi sağlar Tek bir numune üzerinde. Bu yöntemin amacı, minimal akut stres tepkisi etkilenmektedir kan örnekleri elde etmektir.
Protocol
Bütün deneyler, yetişkin erkek Long-Evans sıçanları kullanılarak yapıldı. Tüm işlemler Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık (NIH) Rehberi ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri ile uyumlu idi ve Massachusetts Institute of Technology Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Hayvan Bakımı ve Kullanımı İnceleme Bürosu tarafından kabul edildi USAMRMC.
1. Hazırlık
- Iğne ile heparin çözeltisi (1000 USP birim / ml) 500 ul tüpü ihtiva eden heparin korunan iğne yerleştirilmesi ve daha sonra aspire edilmesiyle ve atarak kateter ve şırınga Heparinise.
- Şırıngaya bir kelebek kateter takın. Hasardan keskin ucu korumak için kateterin iğne üzerine kalkanını tutun.
- Toplanacaktır kan hacmi biraz daha büyüktür heparin bir hacim çıkarın. Şırınga ayırın ve hava ile doldurun.
- Yeniden takın kateter şırınga ve kullanımıHava aşırı heparin çözüm sınırdışı etmek; Sadece tutarlar boru, iğne, şırınga ve iz kalmasını sağlamak.
- Steril bir yüzey üzerinde, hala bağlı şırınga ile steril kateter yerleştirin.
- Hızla ön ve pençelerin rahat bir konumda ve nefes sınırsız olmasını sağlamak temiz bir bez sıçan sabitleyin.
- Kanca ve halka bant ile sarın sabitleyin; Dış genital ş değil emin olun.
- Yavaşça bir asistana sahip ve sıkıca kuyruk sayaç kenarına asılı olan katı bir çalışma yüzeyine sıçan (karın ve kuyruk tabanı) dizginlemek.
2. Kan Alınması
- Kan damarlarını genişletmek ve bir kağıt havlu ile kuyruk kurumasını 40-50 saniye 42 ° C su içinde kuyruk daldırın. (Kuyruk büküm önlemek için kuyruk ile bütün vücudu döndürmek) kanadı olan kuyruk ven bulun.
Not: kuyruk yeterli ısınma hızlı collectio için kritik öneme sahiptirBir kan numunesinin n. Damar ş ise, kateter doğru yerleştirilmesi güçtür ve kan akımı büyük ölçüde azalır. Bir ısıtma yastığı suya daldırma için bir alternatif olarak kullanılabilir. - Örnekleme noktasını tanımlayın.
Not: arter kuyruk orta dorsal boyunca yatıyor; örnekleme için bu kullanmayın.- Arterin lateral yalan sol ve sağ kuyruk damarları ya hedefleyin. Suşu göre değişir ve yaşla birlikte artar kuyruk, pigmentasyon, damarsal bazı gizleyebilir. Kuyruk alt kısmında ven bir kısmını hedef.
- % 2 klorheksidin antiseptik solüsyonla hedef alan silin.
- Yaklaşık 50 ul sıfırdan pistonu çekerek şırınga ve kateter negatif basınç oluşturur.
- Düz numune toplama boyunca kuyruk tutmak için ucuna yakın yavaşça ve sıkıca kuyruk tutun. Kan akımı aşırı sıkı tutuş ile tıkalı olmadığından emin olun.
- Yavaşça yaklaşık 5 cm kuyruğun ucundan eğik bir açıda damar içine kateter yerleştirin. Damar nüfuz edildiğinde, kan kateterin akacaktır. Yavaş yavaş (~ saniyede 20 ul) sabit bir hızda istenen hacmi toplamak için şırınga pistonu geri çekin.
- Tahsil edilebilir maksimum kan hacmi hakkında bilgi için veteriner personel danışın. toplanması gereken kan maksimum miktarı sıçan ağırlığı ve sağlık durumuna bağlıdır. 14 günlük bir süre içinde toplam kan hacminin% 15'den fazla çekmeyin.
Not: Kan akut stres hormonları damar sıkmak çünkü toplama örnek öncesinde dakikada vurguladı hayvanlardan toplamak çok daha zordur. Örneğin, bir damar içine hayvan veya kateterin tekrarlayan sokulmasını sarmak için birkaç dakika alarak, yeni bir odaya sıçan ev kafes hareketli tüm akut stres yanıtı tetiklemek için muhtemeldir. - Bloo kolaylaştırılması'sağım' ven yoluyla d akışı. Kuyruğun ucuna doğru tabanından, damar uzunluğu boyunca parmak başlat ama damarından yerinden olabilir yerleştirilen iğne veya kateter ucundan 2 cm ve daha kalır.
- Kan başarıyla kateter penetrasyon ilk siteden tahsil edilemezse, ven daha da yukarı iğne yeniden takın. Kan, ilk yerinde toplandı Eğer çıkarmadan sonra ven-sokulmasını yeniden öncesinde kateter ve şırınga yeniden bağlamadan tarafından iğne yeniden basınç. Genel olarak, ilave girmeler kaçının.
- Birden girmeler kuyruk kan akımı kesilir ve yumuşak doku kuyruk ölen bir hale geldiği kuyruk ven çökmesine neden olabilir gibi kuyruk damar çöküşü varsa, sıçan euthanize.
- Tahsil edilebilir maksimum kan hacmi hakkında bilgi için veteriner personel danışın. toplanması gereken kan maksimum miktarı sıçan ağırlığı ve sağlık durumuna bağlıdır. 14 günlük bir süre içinde toplam kan hacminin% 15'den fazla çekmeyin.
- Yeterli örnek hacmi toplandığı zaman ayırmadan ve kateter yeniden bağlantı yoluyla şırınga basıncı bırakın. Aspire biraz şırınga pistonu kullanarak (~ 50 & #181; l) ve damardan iğneyi çıkartın.
Not: İğne ilk şırınga basınç bırakmadan geri edilirse, kan iğneden damla olacaktır. - Kısaca kanamayı durdurmak ve antiseptik solüsyon ile bölgeyi silin ekleme siteye basınç uygulayın. Kendi ev kafesine sıçan dönün.
3. Kan Örnek İşleme
- Aspire hava kan kateter iğne içine kalmasını sağlamak ve sadece iğne üstünde kateter boru kesmek için makas kullanın. Steril 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine kan sınırdışı.
Not: Kan iğne ile basıldığında, kesme kuvveti çok sayıda alt analizlere müdahalede hangi rüptüre kırmızı kan hücrelerinin sebep olabilir. Hemoliz önlemek için iğneyi çıkarın.- , Kan plazması, burada pıhtılaşma önleyici (olarak EDTA ihtiva kullanımı tüpleri toplar kan 200-400 ul 0.1 M EDTA, 10 ul kullanmak için, temin w karışmaz kullanılan EDTA konsantrasyonununBuz üzerinde aşağı tahlil) ve yerine i.
- Toplama, 10 dakika içinde, 10 dakika boyunca, bir soğutmalı santrifüj (4 ° C) 'de 2,100 xg'de tam kan numuneleri dönerler. Kırmızı ve beyaz kan hücresi katmanları rahatsız kaçınarak, plazma Zehir.
- Pıhtılaşmayı sağlamak için en fazla 30 dakika boyunca oda sıcaklığında kan serumu, (antikoagülan) olmadan yer numuneleri toplamak için. 2000 x g'de soğutuculu santrifüj (4 ° C) 'de toplama tüpleri dönerler. Serum daha sonra ayrılabilir.
- , Kan plazması, burada pıhtılaşma önleyici (olarak EDTA ihtiva kullanımı tüpleri toplar kan 200-400 ul 0.1 M EDTA, 10 ul kullanmak için, temin w karışmaz kullanılan EDTA konsantrasyonununBuz üzerinde aşağı tahlil) ve yerine i.
- Kullanım derhal numuneler veya mağaza en fazla bir yıl süreyle -80 ° C'de.
Representative Results
Protokolde tarif edildiği gibi, yan kuyruk damarından alınan kan, plazma yarı saydam ve görünüm olarak soluk sarı bir plazma örneği sağlar. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bir numunedeki hemoliz plazma kırmızı bir renk tonu verir. Akut stres tepkisi hızla kan bileşimini değiştirebilir. Şekil 2'de görüldüğü gibi, örneğin, dolaşımdaki kortikosteron konsantrasyonu belirgin, stres maruz kalma 10 dakika içinde artabilir. Pozu stres öncesinde bu yöntemle elde edilen kortikosteron düşük bazal seviyeleri örnekleme prosedürü kendisi stres önemli bir kaynak olmadığını ortaya koymaktadır.
Şekil 1:. Örnek görünüm (A) pıhtılaşmış numuneler gösterilmektedir. Santrifüjlemeden sonra, plazma ya da serum katmanı (yüzey siyah ar ile gösterilensatır) pembe ya da kırmızı ile renklendirilmiş görünür. Koyu renk tonları hemoliz daha seviyelerini göstermektedir. (B) Santrifüj işleminden sonra, uygun bir şekilde, toplanmış numune olmayan pıhtılaşmış plazma ya da serum karşılık gelen üst bant (siyah okla gösterilen bir yüzey), bir berrak, sarımsı bir görünüme sahip olur. Bu tabakanın uzaklaştırılması, bu, ya da bütün kan tabakası içine pipet iterek veya ucu içine tam kan, bazı aspire yatan tam kan rahatsız önemlidir. Tam kan ile kirlenmiş herhangi bir plazma veya serum atılmalıdır.
Şekil 2: Plazma kortikosteron hızla stresli bir deneyim şu yükselir Kan önce yetişkin dişi Long-Evans sıçanlarda lateral kuyruk damarından alınan ve 10 dakika 4 sesleri (10 sn, 2 kHz, 85 dB) maruz kaldıktan sonra eş sonlandırma oldu. foo iletshocks (1 sn, 350 uA). Taban (290,4 ± 138.8 pg / ml) Kan plazma kortikosteron seviyeleri ayak şoku stresi sunumu takip eden 10 dakika gözlenenden daha belirgin olarak daha düşük (2204,8 ± 454.5 pg / ml, p = 0.02, n = 4), eşleştirilmiş t ile belirlendiği gibi -testi. * P <0.05
Discussion
Burada, yaygın olarak kullanılan diğer tekniklere göre önemli avantajlar sunan bir sıçan, bir kan örneği elde etmek için hızlı ve basit bir prosedürü açıklar. İlk olarak, juguler ven veya retroorbital sinüsten örnekleme ile tersine, anestezi gerektirmez. Kan örnekleri davranışsal prosedürleri çevreleyen toplanan zaman öğrenme ve bellek, 4,5 ile karışabilir, çünkü anestezik yönetimi istenmeyen bir durumdur. İkincisi, bu tür safen veya dorsal pedal damarlar koleksiyon gibi diğer venipunktür teknikleri, daha büyük kan hacimleri toplamak için yeteneği sunar. Kan 1,5 mi kadar burada tarif edilen teknik kullanılarak, tek bir zaman noktasında bir sıçandan toplanabilir, hali hazırda birden çok deneyler, paralel olarak çalışmasına izin veren bir birim. Son olarak, bu yordamı kuyruk ucu amputasyon veya retroorbital kanama ile karşılaştırıldığında doku hasarı olasılığını en aza indirir. Bu prosedürün kullanılması Hayvan W uyumu kolaylaştırırelfare Kanunu ve hayvanlar üzerinde yapılan laboratuar prosedürlerine kaynaklanan acı ve sıkıntı minimize gerektiren Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım için Kılavuzu.
Bu yönteme yeni araştırmacılar deney hayvanları tutulmuştur zamanı en aza indirmek amacıyla kısıtlama ve kuyruk kanama tekniklerini uygulama önerilir. Kısıtlama başlangıcından itibaren en az 3 dakika içinde toplanan kan optimum sonuçlar sağlar.
Burada açıklanan protokol haftada 1-4 kez numune için kullanılır, ancak günde iki defa daha fazla olabilir. Tekrar kan toplama gerçekleştirilebilir olsa da, kuyruk tabanından yukarı doğru hareket farklı örnekleme siteleri kullanılmalıdır ve sol ve sağ arka damarları numune alanı olarak değişmelidir. kemirgenler, toplam kan hacmi vücut ağırlığının% 6-7, ve toplam kan hacminin en fazla% 15, bir 2 haftalık süre içinde alınmalıdır. Serumya da plazma toplanmış numune hacminin yaklaşık% 40-60 ihtiva etmektedir.
Bir kaç küçük modifikasyonlarla burada açıklandığı gibi yanal kuyruk venleri yoluyla kan örneği alınması, aynı zamanda fare içinde gerçekleştirilebilir. İlk olarak, sadece küçük göstergesi (27 g) kateter kullanılabilmektedir. İkinci olarak, bu fareler hareketsiz hale getirmek için, daha ziyade, bir sargı yerine bir boru koruyucularını kullanılması tavsiye edilir. submandibuler vasküler demet (200-500 ul) Damara kullanılarak fareden elde edilebilir kan hacmi güvenli bir şekilde kuyruk damarından (200 ul maksimum) alınabilir daha büyüktür. Submandibuler damar paket kan örnekleme az kısıtlama gerektiren ve daha fazla kan verebilir, çünkü bu fare örnekleme için tercih edilen yoldur.
Bu prosedür, minimal invaziv doğası ile birlikte yapılabilir hangi hız, aynı zamanda akut stres tepkisi 6 kan esaslı tedbirlerin potansiyel pertürbasyon en aza indirir.akut stres tepkisi interlökinler ve diğer immün aktif faktörlerin 7, hipotalamus-hipofiz-adrenal ekseninin 8 hormonlar, sempatik sinir sisteminin 9 hormonlar, ghrelin 10, endojen opioidler 11, dopamin gibi birçok moleküllerin dolaşımdaki düzeyleri, değiştirebilir ve olabilir Serotonin 12. Bu moleküllerin düzenlenir, bu moleküllerin veya başkalarının dinlenme dolaşımdaki önlemler arzu edildiği takdirde, bir stres maruz bırakılmanın başlamasından bir dakika gibi kısa bir süre içinde tetiklenir stres cevabı, en aza indirmek için önemlidir.
Stres tepkiler sadece kan kompozisyonunu değiştirmek değil, aynı zamanda sempatik sinir sistemi artan sürücü ile nedeniyle damar daralması kan örneklemesi için bir teknik engel teşkil değil. Bu akut stres yanıtı montaj olduğunu bir sıçan sürekli kan akışını elde etmek zor artan olur. Bu nedenle, hayvanın sıkıntı minim olmalıHızla ilgi fizyolojik durumunu yansıtır örnekleri elde etmek için ized.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz teknik yardım için Virginia Doherty ve Junmei Yao teşekkür ederiz. Bu araştırma NIMH (R01 MH084966) ve Amerikan Ordusu Araştırma Ofisi ve Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı tarafından finanse edildi KAG için (W911NF-10-1-0059 hibe).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin (1,000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor rinse-chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1 cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500 ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, 0.75 in width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
- Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction. Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).
- Shah, R., et al. Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).
- Chan, M. K., et al. Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders. Prog Neurobiol. , (2014).
- Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents. PLoS One. 7 (12), e51431 (2012).
- Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats. Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).
- Vahl, T. P., et al. Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).
- Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress. Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).
- McEwen, B. S. Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators. Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).
- Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress. Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).
- Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear. Mol Psychiatry. , (2013).
- Knoll, A. T., Carlezon, W. A. Dynorphin, stress, and depression. Brain Res. 1314 (56-73), (2010).
- Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder. Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).
