Abstract
Флуоресцентный-опосредованной томографии (FMT) дает продольную и количественное определение распределения флуоресценции в естественных условиях, и может быть использован для оценки биораспределение новых зондов и для оценки прогрессирования заболевания с использованием установленных молекулярных зондов или репортерных генов. Сочетание с анатомической модальности, например, микро компьютерная томография (μCT), является полезным для анализа изображений и реконструкции флуоресценции. Мы опишем протокол для мультимодальных μCT-FMT изображений, включая шаги обработки изображений, необходимых для извлечения количественных измерений. После подготовки мышей и выполнения обработки изображений мультимодальный наборы данных зарегистрированы. Впоследствии, улучшенная реконструкция флуоресценции осуществляется, которая принимает во внимание форму мыши. Для количественного анализа, орган сегментации генерируются на основе анатомических данных с использованием интерактивной сегментации инструмент. Наконец, биораспределение CuРВЭС генерируются с помощью функции пакетной обработки. Мы показываем применимость метода по оценке биораспределение известного зонда, который связывается с костей и суставов.
Introduction
Флуоресцентный-опосредованной томографии, которая также называется флуоресценции молекулярного томографии (FMT), является перспективным методом количественной оценки распределения флуоресценции в диффузных тканей, таких как анестезированных мышей или даже ткани тела человека, например, грудь или суставов пальцев. В отличие от неинвазивных методов микроскопии, которые позволяют визуализации поверхностных целей на субклеточном резолюции 1, FMT позволяет трехмерную реконструкцию люминесцентных источников в глубине нескольких сантиметров, хотя и с более низким разрешением 2. Многие целевые флуоресцентные зонды доступны изображения ангиогенеза, апоптоза, воспаления и других 2 - 5. Некоторые зонды активируемый., Например, с помощью специфического фермента расщепления, ведущей к размораживание флуорохромов. Кроме того, репортер гены, выражающие флуоресцентные белки могут быть отображены, например, для отслеживания миграции опухолевых клеток 6.
FMT сильно выигрывает от сочетания с анатомической модальности, например, μCT 2,7 или МРТ 8. В то время как автономные устройства FMT коммерчески доступны 9, флуоресцентные изображения трудно интерпретировать без анатомического справочной информации. Недавно мы были в состоянии показать, что данные плавленого анатомическое изображение позволяет более тщательный анализ 10. Анатомические данные также могут быть использованы, чтобы обеспечить предварительное знание, например, внешней форме мыши, что очень важно для точного оптического моделирования и реконструкции флуоресценции 11. Кроме того, карты оптические рассеяния и поглощения можно оценить с помощью сегментации типов тканей и назначения конкретных коэффициентов класса 12,13. Для ближней инфракрасной света, гемоглобин является основным поглотителем у мышей, к тому же меланина и меха 14. Так относительный объем крови изменяется региональном на несколько порядков, карта поглощения особенно важно для цюаньвенных флуоресценции реконструкция 13.
Одно из преимуществ использования неинвазивных устройств обработки изображений является то, что мыши могут быть отображены в продольном направлении, то есть в различные моменты времени. Это важно для оценки динамического поведения зондов, т.е. их целевое накопление, биораспределение и выведение 10,15, или оценить прогрессирование заболевания 16. При визуализации несколько мышей в различные моменты времени, большое количество наборов данных изображения возникает. Чтобы включить сопоставимости, они должны быть приобретены на систематической основе, то есть, с хорошо определенным и документально протокола. Большое количество сканирований представляет собой вызов для анализа изображений, который необходим, чтобы извлечь количественные измерения на основе данных изображения.
Целью нашего исследования является разработка подробное описание протокола изображений μCT-FMT, которые мы использовали и оптимизированной на протяжении нескольких исследований 10,13,15,17,18. Мы описываемкак наборы данных создаются, обрабатываются визуализируются и анализируются. Это продемонстрировано с помощью установленного Molecular Probe, OsteoSense, который связывается с гидроксиапатитом 19, и может быть использован для заболеваний костей изображений и реконструкции 2. Все процедуры, связанные с животными были одобрены правительственной экспертной комиссии по уходу за животными.
Protocol
Протокол содержит подробное описание следующих этапов: Во-первых, фантомы или мыши и мультимодальные кровать мышь готовы к визуализации. Затем сканирование всего тела приобрела в μCT. Впоследствии кровати мыши передается FMT, где два сканирования приобретены (и вниз). Это может быть повторено для нескольких мышей в различные моменты времени. После завершения сбора данных, необходимо экспортировать и сортируются для автоматизированного сегментации (требующий лицензию Definiens), а также слияние изображений и реконструкция флуоресценции (требующий лицензию Imalytics доклинических) данных. Наконец, показано, как мультимодальные наборы данных визуализируется и как органы интерактивно сегментирован количественно биораспределение флуоресцентных зондов.
1. Подготовка Фантом
Примечание: Фантомы полезны для тестирования системы обработки изображений, но также и для определения фактического калибровкиR для нового зонда.
- Готовят раствор 200 мл воды, 2% агарозы, 1,8 г порошка TiO 2, 50 мкл трипанового синего. После кипячения заполнить раствора в прямоугольной форме, примерно 8 см длины, 3 см в ширину и 1,5 см в высоту.
- Подготовьте несколько флуоресцентных включений в фантоме, используя наконечники, содержащий смесь флуоресценции и μCT контрастного вещества. Для создания включений, сократить наконечники и запечатать их с зажигалкой.
- После того как раствор затвердеет, вставьте включения в фантом. Срежьте несколько частей фантома для достижения неправильную форму и прикрепить его к смешанной владельца мыши.
- Чтобы определить коэффициент калибровки для нового зонда, некоторые фантомные сканирование требуется. Для этого, FMT фантом умолчанию используется в сочетании с известными количествами зонда. Для повышения точности, добавить 4% липидную эмульсию к раствору, чтобы получить тот же коэффициент рассеяния внутри включения, как вОстальные фантома. Кроме того, добавить небольшое количество (2%) μCT контрастного вещества для облегчения анализа изображений.
2. Подготовка мыши
ПРИМЕЧАНИЕ: изображений μCT-FMT требует специальной подготовки, включая обезболивания и удаления волос.
- Наведите на хлорофилла-бесплатное питание за 7 дней до съемки. Это позволит снизить фоновый сигнал, и это особенно важно для каналов FMT ниже 750 нм.
- Все эксперименты на животных проводили под наркозом. Чтобы начать анестезии, поместите курсор в камере, заполненной не с 2% изофлуран в воздухе (расхода 5 л / мин) до тех пор, мышь засыпает. Подтвердите правильное обезболивания по нежной коже ног или щипать и проверяя расслабление мышечного тонуса (например., Челюсти мышцы). Для поддержания анестезии, продолжить ИФ приложение, используя трубку, которая помещена на носу мыши (2% изофлуран в воздухе, скорость потока 1 л / мин). Для того, чтобы предотвратить глазные drynesс, использовать ветеринар мазь на наркотизированных мышей.
- Для подачи контрастного вещества, исправить наркозом мышь на грелку, используя ленту. Поместите катетер (иглу шприца, прикрепленный к трубке) в хвостовую вену и вводят флуоресцентную контрастное вещество (например, 2 нмоль, с максимальным объемом впрыска 5 мл / кг массы тела, то есть, 150 мкл на 30 г мыши).
- Для сканирования волосатую мышь, область сканирования должна быть депилированной заранее. Для этого используйте бритву или крем удаления волос. Некоторые штаммы мышей могут развиваться сыпь от крема для удаления волос. Таким образом, мониторинг мышей для изменения кожи и связаться с ветеринарной персонал для ухода за, если это необходимо. Кроме тест толерантности на небольшом количестве животных при использовании новых линий мышей.
- Держите мышь под наркозом во время μCT и FMT томографии (2% изофлуран в воздухе, скорость потока 1 л / мин).
3. Мышь кровать Подготовка
ПРИМЕЧАНИЕ: Для сканирования μCT-FMT, использовать мультимодальныемыши кровать, которая подходит как в μCT и FMT.
- Перед визуализации, очистить постель мыши мокрыми тканей. Не используйте этанол, потому что это может привести к повреждению акриловое стекло. Убедитесь, что маркеры могут свободно воды, потому что это может ухудшить автоматизированной обнаружения маркера.
- Откройте винты смешанной кровати мыши и снимите верхнюю часть.
- Прикрепите обезболивающий газовая труба на кровати мыши и зафиксировать его с ленты.
- Поместите курсор в наркозом кровати мыши и поставить нос в газовой трубе. Убедитесь, что голова мыши находится на передней индикатора кровати мыши (рис 1).
- Убедитесь, что мышь находится в середине кровати мыши, чтобы оптимально использовать поле зрения ДРМ.
- Закройте кровать мыши и затяните винты, пока мышь не плотно состоялась. Убедитесь, что мышь может дышать постоянно визуально мониторинга грудных дыхательных движений.
4. μCT яmaging
ПРИМЕЧАНИЕ: сканирование всего тела выполняется с использованием μCT. Сгенерированный анатомические данные, необходимые для слияния изображений, для улучшенной реконструкции флуоресценции и для анализа изображений.
- Поместите кровать мыши с помощью мыши в μCT. Убедитесь, что мышь находится в пути, что он идет «хвост первой" в μCT. Это важно для автоматизированного синтеза.
- Для поддержания анестезии при μCT-крышка закрыта, повторно трубки, чтобы направить газ через случае μCT. Во-первых отсоединить длинную трубку с кровати мыши и прикрепить ее к разъему на внешней стороне μCT. Затем присоедините оставшийся свободный конец к разъему внутри μCT.
- Драйв кровать мыши в μCT. Убедитесь, что газ трубка не потерять и не может попасть на вращающейся козловых. При необходимости, зафиксировать его с ленты. Вставьте трубку в вырез держателя кровати мыши. Закройте μCT и приобрести топограмма. Выберите по крайней мере, два subscans покрывать существенную часть мыши и кровати мыши, что очень важно для слияния и реконструкции.
- Выберите протокол μCT сканирования имени HQD-6565-360-90, который приобретает 720 проекций с 1032 х 1012 пикселей в течение одного полного оборота, требующего время сканирования 90 с на субсканирования. Трубы работают при напряжении 65 кВ и 1,0 мА тока. Кроме того, чтобы уменьшить длительность дозы облучения и сканирования, выберите протокол сканирования СКО-6565-360-29, которые приобретает 720 проекций с 516 х 506 пикселей со временем сканирования 29 с на субсканирования.
- Запустите сканирование μCT. Синяя полоса показывает прогресс. В subscans будет впоследствии приобретены. Переохлаждение и потеря жидкости не проблема, потому что в короткий срок сканирования только несколько минут. Не открывайте крышку во время сканирования μCT, потому что это автоматически прерывать сканирование, чтобы защитить пользователя отизлучение.
- Когда сканирование завершено, откройте крышку, подключите обезболивающий трубку и отсоедините кровать мыши из держателя для транспортировки его к FMT.
5. FMT изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Сразу после сканирования μCT, мыши сканируется в FMT в двух конфигурациях (вверх и вверх вниз), которые используются вместе для улучшения реконструкции флуоресценции.
- Включите питание анестезирующего газа (2% изофлуран в воздухе, скорость потока 1 л / мин) для FMT до размещения кровать мыши в ДРМ. Использование программного обеспечения управления FMT, создать исследовательскую группу с соответствующим количеством субъектов (т.е. мышей). Выберите зондов, которые будут использоваться для визуализации (использование OsteoSense для новых зондов, которые не перечислены).
- Carry мультимодального кровать мыши с помощью мыши, чтобы FMT. Длинный гибкий анестезирующий газ труба сохраняет поток газа. Перед установкой кровать мыши в ДРМ, осторожно снимите трубку с нейне требуется внутри FMT. Избегайте поворотом винта кровати мыши.
- Поместите кровать мыши в ДРМ с красным индикатором первый ("головой вперед"). Это важно для слияния изображения в соответствие с μCT.
- Закройте FMT.
- Выберите нужную группу изучения и предмет. Выберите нужный канал FMT (для OsteoSense 750EX, используйте 750 нм канал).
- Добавить описание, например., "Вверх" или "вниз" и приобрести обзорную проверку, нажав кнопку "Capture". Это захватывает отражения изображение всего поля зрения. Убедитесь, что нет "отражательной Изображения только" выбран, потому что иначе это не возможно, чтобы приобрести 3D сканирование в дальнейшем.
- Отрегулируйте параметры изображения для 3D сканирования. Увеличить поле зрения, чтобы включать в себя как можно больше мыши. Как правило, голова и хвост не совсем вписываются в поле зрения, однако. Нажмите "Расширенный221; и проверьте настройки изображений. Установите плотность выборки до 3 мм, чувствительность к нормальной и освещения мин / макс 5000 и 50000, соответственно.
- Нажмите кнопку "Добавить в очередь реконструкции", а затем нажмите кнопку "Сканировать", чтобы начать сканирование FMT. Это займет около 5 до 15 мин, в зависимости от размера и толщины мыши, потому более длительное время экспозиции, требующееся для более толстых объектов. Устройство содержит нагреваемую камеру изображений, чтобы избежать переохлаждения.
- После сканирования, перевернуть кровать мыши в том числе мыши вниз и приобрести еще одно сканирование. Это обеспечивает дополнительные данные для восстановления флуоресценции.
- Когда μCT и FMT-сканирование завершено, и мышь просыпается от наркоза, не оставляйте его без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточно, например, ходить или поддерживать грудины лежачее положение.
6. Изображение Fusion и реконструкция
ПРИМЕЧАНИЕ: Послезавершение сканирования μCT-FMT, например, в конце исследования, собранные данные должны быть отсортированы, чтобы включить автоматическую слияние изображения и реконструкцию флуоресценции.
- Для сортировки сканирования для дальнейшей обработки, создать папку для исследования. Для каждого сканирования μCT-FMT, создать одну вложенную чье имя содержит идентификатор мыши и момент времени, например,., M01_02h.
- Для каждого μCT-FMT сканирования, сканирования экспортировать FMT (вверх и вниз), как .fmt файлов и сохранять их в подпапку с использованием имен файлов, оканчивающиеся либо "_up.fmt" или "_down.fmt". Каждый файл содержит .fmt полученные исходные данные, т.е. возбуждения и эмиссии изображения, полученные с помощью камеры, метаданные, такие как время экспозиции, и реконструкция флуоресценции генерируется FMT.
- Использование программного обеспечения μCT, создать реконструкцию с размером изотропной вокселей 35 мкм. Выберите гладкое ядро реконструкции (T10). Настройте поле зрения такчто весь слой мыши в том числе маркеров покрыта. Выберите MIFX / RAW в качестве выходного формата и начать реконструкцию. После реконструкции будет сделано, переместить файлы μCT реконструкции в подпапке сканирования μCT-FMT.
- Экспорт данных μCT и FMT для всех сканов. Убедитесь, что каждая подпапка содержит два .fmt файлы (вверх и вниз) и реконструкцию μCT в / RAW формате MIFX. Для проверки полноты выберите Меню-> CT-FMT-> Проверить Полнота использования программного обеспечения Imalytics доклинических. Список ошибок может появиться, например, не хватает .fmt файлов или μCT реконструкций. Исправьте ошибки и проверить на полноту, пока все ошибки не будут устранены.
- Использование Меню-> КТ-FMT-> Настройки, проверьте имя сервера программного обеспечения Definiens и при необходимости отрегулировать. Умолчанию HTTP: // локальный: 8184, предполагая, что программное обеспечение Definiens установлен на том же компьютере. Программное обеспечение Definiens требуется на следующей стадии, чтобы выполнить а.е.tomated сегментация кровати мыши и маркеров.
- Нажмите Меню-> КТ-FMT-> Предохранитель группу в программном обеспечении Imalytics доклинических выполнять автоматизированный μCT-FMT слияние в течение всего исследования. Это займет несколько минут за μCT-FMT сканирования и результаты в папку с суффиксом "пакет" параллельно в папку исследования. Он содержит меньший набор файлов (данных μCT и плавленого вендора условии реконструкции FMT), которые имеют отношение для дальнейшего анализа.
- Нажмите Меню-> КТ-FMT-> реконструировать группу (FMT) в программном обеспечении Imalytics доклинических выполнить реконструкцию флуоресценции в том числе поколения поглощения и рассеяния карты 13. Даже если обработка GPU-ускорением 20, каждый реконструкция требуется от 1 до 4 ч в зависимости от размера мыши. Результаты будут сохранены в папке пакета. Примечание: Чтобы включить более высокую пропускную способность, мы в настоящее время выполняют этих реконструкций на GPU кластера с 56 графическими процессорами.
Анализ 7. Изображение
ПРИМЕЧАНИЕ: Для извлечения количественных измерений из данных изображения, сегментация поражений и органов требуется.
- После того, как все наборы данных слиты и реконструированные, создать сегментацию для каждого μCT-FMT сканирования с помощью программного обеспечения Imalytics доклинических.
- Загрузите μCT файл как подложку и файл флуоресценции как наложения. Нажмите "3D", чтобы включить объемный рендеринг и осмотреть набор данных.
- Для сегмента легких, нажмите Меню-> классами:> Добавить класс и создать класс с именем "TMP". Это также может быть сделано с помощью контекстного меню. Создание нового класса автоматически устанавливает его в качестве выходного класса для последующих операций сегментации.
- Выполните операцию пороговой сегментации все регионы с низкой интенсивностью в наборе данных μCT (нажмите Меню-> Segmentation-> Thresholding-> Ниже и введите 600). Теперь класс TMP содержит воздух за пределы МОиспользовать, но и легочной ткани.
- Создать класс "легких". Выполните "Заполните Регион" операцию (щелкните правой кнопкой мыши в легких и выберите Меню-> Fill Region-> Fill регион ограничено), чтобы отделить легкие от наружного воздуха.
- Удалить класс TMP, потому что он больше не нужен.
- Для сегмента выпуклых областей., Например, мочевого пузыря, используйте режим каракули. Сначала создайте класс "Пузырь".
- Нажмите F1, чтобы удалить все каракули.
- Использование компьютерной мыши, нарисуйте каракули, чтобы очертить границы мочевого пузыря.
- Нажмите F3, чтобы заполнить области, охваченной каракулями с временной маски, которая выглядит как красный наложения. Итеративно добавить каракули (в любой ориентации нарезки) и нажмите F3, пока достаточная точность достигается. Как правило, каракули в 10 срезах достаточно.
- Нажмите F4 для хранения временной маски как "пузыря".
- Действуйте, как это сегментдругие выпуклые области, такие как сердце и почки. Многие регионы, например., Желудка или печени, может быть аппроксимирована несколько выпуклых областей.
- Для сегмента позвоночника, сначала создайте класс "Bone".
- Выберите ContextMenu->> Thresholding- выше выполнить операцию пороговой классифицировать все яркие вокселей (например., Выше 1600) как "Bone".
- Операция наполнения регион будет не в сегменте позвоночника, потому что это связано со многими другими частями скелета., Например, ребер. Выполните несколько операций резания путем итеративного рисунок каракули и нажав клавишу F2, чтобы отделить позвоночник от черепа, ребер, и крестцовой костью.
- Наконец, создать класс "Spine" и выполнить операцию заполнения область получит позвоночника (щелкните правой кнопкой мыши в позвоночнике и выберите ContextMenu-> Fill Region-> Fill область неограниченное).
- Сохранить сегментации в виде файла внутри йе вложенной сканирования μCT-FMT. Используйте последовательную имя, например, organs.seg, для того, чтобы пакетную обработку.
- Выберите Меню-> статистику-> Class статистика (наложение), чтобы создать таблицу, которая содержит среднюю интенсивность флуоресценции, объем и общая сумма (продукт среднего и объема) для каждого класса.
- Для создания единого таблицу, содержащую значения для всех регионов всех сканов μCT-FMT, нажмите Меню-> Batch-> Установить параметры пакетных а затем нажмите Меню-> Batch-> Статистика партии. Это позволяет избежать усилия по созданию и слияние многих файлов электронных таблиц, то есть, по одному для каждого сканирования μCT-FMT.
8. Зонд калибровки
- Для расчета коэффициента калибровки для зонда, несколько фантомные сканирует μCT-FMT с требуются различные известные количества зонда (см шаг 1,4), например., С 100 пмоль, 50 пмоль, 25 пмоль и 0 пмоль.
- Сканирование фантомы, как описано вразделы 4 и 5. Кроме того, для фантомных сканирования, вверх и вниз сканирует в ДРМ требуется.
- Экспорт данных и выполнять слияние и реконструкцию, как описано в разделе 6.
- Сегмент включение используя данные μCT для каждого сканирования с помощью пороговой (выше 1200) и заполнение области.
- Создание таблицы с измеренной суммы флуоресценции и сюжет их функции известных количествах. Вычислить наклон линейной регрессии подходит. Это калибровочный коэффициент для зонда.
Representative Results
Мы применили описанный протокол для оценки биораспределение целевой зонда, OsteoSense, который связывается с гидроксиапатита. 3 мышей (C57BL / 6 APOE - / - AHSG - / - двойных нокаутных мышей, 10 недель) были обследованы до и 15 мин, 2 ч, 4 ч, 6 ч и 24 ч после внутривенной инъекции 2 нмоль OsteoSense. Наше программное обеспечение автоматически обнаружены маркеры, встроенные в смешанных кровати мыши (рис 1, 2А, Б), что позволило слияние анатомических данных μCT с реконструкцией флуоресценции в исполнении FMT (рис 2С, D). Так OsteoSense является зонд с низкой молекулярной массой, быстро почечной экскреции и, следовательно, высоким отношением сигнал в мочевом пузыре, как ожидается. Слияние реконструкции флуоресценции ДРМ показали такие проблемы, как неуместной сигнала внешнего мочевого пузыря (фиг.2с, D). Эти проблемы возникают из-за ДРМ не знает истинную форму мыши и принимает форму блок. Оуг реконструкция определяет точную форму из данных μCT и генерирует рассеяния и поглощения отображает 13, с тем чтобы более точного воспроизведения флуоресценции с лучшей локализации сигнала, что особенно очевидно в мочевом пузыре (рис 2E, F).
Чтобы назначить реконструированный флуоресценции в соответствующих регионах, мы в интерактивном режиме на сегменты несколько органов, используя наше программное обеспечение (рисунок 3). Для каждого из 18 сканов, 7 регионы сегментированный на основе данных μCT, т.е.., Сердце, легких, печени, почек, позвоночника, кишечника и мочевого пузыря. Впоследствии программа была использована для вычисления среднего значения концентрации флуоресценции для каждой из областей 126. К счастью, программное обеспечение пакетный режим, который вычисляет все значения и сохраняет их в одной таблице.
Для визуализации распределения флуоресценции, 3D визуализации были получены для каждой временной точки,используя сопоставимые установку оконной (4А-F). Используя количественные значения органов, биораспределение вычисляется путем усреднения значений органов более трех мышей (рис 4G). Предварительно сканирует, приобретенные до инъекции, показали незначительное фонового сигнала. Через 15 мин после инъекции, самый сильный сигнал появился в мочевом пузыре, из-за быстрого почечной экскреции. На последующих временных точках, оставшихся зонда набралось на костях и суставах.
Рисунок 1. Мультимодальные мышь-кровать. () Мультимодальные кровать мышь содержит два акриловые стеклянные пластины, которые плотно удерживают мыши. Ужесточение регулируется с помощью двух винтов. Кровать мышь содержит маркеры (пустые отверстия) для слияния изображений. Обезболивающий газ подается с помощью гибкой трубки, которая фиксируется с тобезьяна. (B), кровать мышь присоединена к металлическом держателе и удерживается в центре вращающейся μCT козловых. (С) Избегайте разрыва между кроватью и мыши металлического держателя, потому что в противном случае, маркеры могут быть неправильно назначен приводит к неправильной слияния. Анестезирующий газ трубка должна быть прикреплена к разъему трубки. (D) Кровать мыши должен быть вставлен в ДРМ с передней сначала, чтобы дать возможность правильной автоматизированной синтеза. (Е) Маркеры видны камеры FMT, который используется для автоматического обнаружения маркера и слияния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Изображение Fusion и реконструкция. (A, B) Маркеры и внешняя форма МОВSE определяются автоматизированной алгоритма сегментации. (С, D) через 15 мин после инъекции OsteoSense, значительное количество зонда уже выводится в мочевой пузырь. После слияния реконструкцию, поставляемая производителем оборудования с данными μCT, проблемы становятся видны. Большую часть сигнала появляется вокруг мочевого пузыря, но не внутри мочевого пузыря и некоторые даже сигнал появляется в воздухе. Это происходит потому, ДРМ предполагает блок-формы мыши. (E, F) Наш улучшенный реконструкция флуоресценции, используя форму мыши, полученных из данных μCT, приводит к лучшему локализации флуоресценции внутри мочевого пузыря. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Интерактивный Орган Segmentat. ион () Для количественной оценки распределения флуоресценции, несколько органы сегментирован: сердце (красный), легких (розовый), печень (коричневый), желудка (бежевый), позвоночника (фиолетовый), почки (желтый), кишечник (зеленый) и мочевого пузыря (золото). (Б) легких, который сильно контрастирует по сравнению с окружающей тканью, сегментирован использованием порога и заполнение области. (C) Круглые органы, такие как мочевой пузырь, почки, сердце и сегментированы использовании "каракули". (D) Органы с более сложной формы, например, печени и желудка сегментированный постепенно, используя каракули. Для сегмента позвоночника, высокий порог применяется для сегмента все кости. Тогда некоторые кости, например., Ребра, срезаны, пока позвоночник не остается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Биораспределение. Для оценки биораспределение мышей сканируются в нескольких временных точках (AF). (А) предварительно сканирования, перед инъекцией, показывает немного фонового сигнала в канале 750 нм. (B), через 15 мин после инъекции, значительное количество зонда уже в мочевом пузыре. (С) В 2 ч момент времени, мышь помочился, что приводит к некоторым внешним флуоресценции мыши. На более поздних временных точках (DF), появляется сигнал преимущественно на костях и суставах, то есть., В позвоночнике и коленях. (G), количественно концентрация флуоресценции показано для выбранных органов.
Discussion
Мы описываем и применять протокол для мультимодальных изображений μCT-FMT. Мы используем все коммерчески доступные и широко используется FMT и μCT устройства 3,11,15 - 17,21. В то время как протокол требует определенного FMT, μCT может быть заменен другим μCT с аналогичной функциональностью и сопоставимых параметров сканирования, например, поле зрения должна быть достаточно большой, чтобы покрыть кровать мыши в том числе маркеров.
FMT была использована для анализа биораспределения без сочетания с μCT или МРТ 21, однако, анатомические данные выгодно, чтобы увеличить воспроизводимость, так как сегментация может быть основано на границах органов, которые видны в данных μCT 10. В то время как интегрированные устройства μCT-FMT были разработаны 2,7, это коммерчески не доступно. Кроме того, использование двух отдельных устройств позволяет трубопроводы, т.е.., Следующий CA мышип быть отображены в то время как μCT первую мышь все еще находится в FMT, чтобы увеличить пропускную способность.
Чтобы уменьшить объем ручной работы, мы проводим автоматического обнаружения маркера и слияние. Кроме того, форма мыши автоматически сегментирован, и эта информация значительно улучшает 11,13,22 реконструкции флуоресценции. Для количественного реконструкции флуоресценции, карты поглощения и рассеяния необходимы 13,23. Мы выводим карту рассеяния по автоматизированной сегментации данных μCT и назначения, известные коэффициенты рассеяния нескольких типов тканей (легкие, кости, кожи, жира, и оставшегося мягких тканей) 24. Впоследствии мы реконструировать карту поглощение из оптического исходных данных, что особенно важно для хорошо перфузии органов, таких как сердце и печень 13,20.
Сканирование нескольких мышей в различные моменты времени быстро приводит к большому количеству наборов данных, которые будут проанализированы. Для biodisвклад исследования, несколько органов должны быть сегментирован для каждого сканирования μCT-FMT. К сожалению, сегментации не могут быть повторно использованы, так как мышь вновь установлен в постели мыши повторно. Мы используем инструмент для интерактивного сегментации, разработанный в нашем институте, однако, и другие инструменты могут также целесообразно 25. Мы генерируем воксельных мудрый сегментации, потому что они подходят лучше, сложных органов, чем простые формы, такие как эллипсы и кубов 26. Автоматизированные сегментации целого животного было бы полезно, чтобы дополнительно уменьшить нагрузку на ручной 27, но интерактивный инструмент сегментации будет по-прежнему требуется для коррекции ошибок сегментации. Кроме того, автоматизированные инструменты сегментации вряд ли предвидеть особых случаев, таких как патологии корректно. Так как мы используем собственные μCT сканирования, некоторые органы, такие как селезенка очень трудно сегменте даже вручную. Контрастные агенты бы помочь, но существуют проблемы с переносимостью и трудно maintaiна распределение устойчивый контрастный агент на протяжении продольной томографии.
Наше исследование показывает, что фантомное локализации сигнала улучшается при использовании информации формы для реконструкции флуоресценции. В естественных условиях, похоже улучшение очевидно для раннего момента времени (15 мин после инъекции), при большое количество зонда уже в мочевой пузырь. Гидроксиапатита связывания зонда накапливается в костях и суставах. Это удивительно, как быстро это происходит, то есть, сигнал уже отчетливо видны на позвоночник 15 мин после инъекции. Это, вероятно, обусловлено низкой молекулярной массой зонда, которая позволяет быстро транссудации и диффузию в целевых регионах. Зонд связывается ковалентно целевой гидроксиапатита и несвязанный зонд организма. Для более поздних временных точках, между 6 ч и 24 ч после инъекции, интенсивность сигнала в позвоночнике остается относительно стабильной, возможно, потому, что свет практически не реболит глубоко в мышь, чтобы отбелить флуоресценции. Для нашего исследования мы использовали 750 нм канал, что приводит к низкой фоновой флуоресценции Как видно на сканирование, приобретенных до инъекции. При более низких длинах волн, более фоновый сигнал можно ожидать 28.
В целом, мы описываем мультимодального протокол изображений для коммерчески доступных устройств FMT и μCT. Мы покажем, что комбинация обеспечивает преимущества для реконструкции флуоресценции. Проиллюстрируем, как кривые биораспределению извлекаются из-за большого количества данных изображения посредством интерактивного сегментации органов и пакетной обработки. Мы считаем, что это стандартизированная рабочий процесс может быть полезным для разработки лекарств и других исследований с использованием изображений флуоресцентно меченых зондов.
Disclosures
Феликс Gremse является основателем и владельцем Gremse-IT, начинающей компанией, которая предлагает программное обеспечение и услуги для медицинского анализа изображений в сотрудничестве с Philips и Департамента по экспериментальной молекулярной визуализации в университете Аахена.
Acknowledgments
Мы благодарим Марек Weiler для выполнения фантомные эксперименты. Эта работа была поддержана Европейским исследовательским советом (ERC Starting Grant 309495: NeoNaNo), немецкой федеральной земли Северный Рейн-Вестфалия (NRW; High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Программа (EFRE); ForSaTum), немецкий Министерство образования и науки (BMBF) (программы финансирования Virtual печени (0315743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), Университет Аахена (я 3 ТМ Фонд посевных инвестиций), и научно-исследовательский Philips (Аахен, Германия).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX | PerkinElmer | FMT2000 | Device for fluorescence molecular tomography |
| µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo | CT Imaging GmbH | Tomoscope Duo | Device for micro computed tomography |
| Multimodal Mouse Bed | CT Imaging GmbH | Experimental builder | Partially transparent animal holder |
| IsoFlo (isoflurane, USP) | Abbott | 05260-05 | Isoflurane Inhalation anesthesia |
| Small animal anesthesia system | Harvard apparatus | 726419 | Complete Isoflurane Table-Top System |
| Chlorophyll-free mouse food | Ssniff | E15051 | low chlorophyll / low fluorescence food |
| OsteoSense 750EX | PerkinElmer | NEV10053EX | Animal FMT contrast agent |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smith medical | 800/100/120 | Tube for injection catheter |
| Sterican 30g | BBraun | 4656300 | Hypodermic needle for catheter |
| Imeron | Altana pharma | INLA F.1/0203/3.5337.69 | CT contrast agent for the phantom inclusions |
| Agarose | Sigma | 90-12-36-6 | Agarose for phantom production |
| TiO2 | Applichem | A1900,1000 | Titanium oxyde as phantom scattering agent |
| Trypan blue | Fluka | 93595 | Trypan blue to adjust phantom light propagation |
| Cy7 | Lumiprobe | 15020 | Fluorochrome for the phantom inclusions |
| Lipovenoes 20% | Fresenius Kabi | 3094740 | Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents |
| Definiens Developer XD Server | Definiens AG | Server XD | Software platform for automated segmentation |
| Imalytics Preclinical | ExMI/Gremse-IT | Version 2.0.1 | Software for image fusion, reconstruction and analysis |
| NVIDIA Geforce Titan | Asus | GTXTITAN6GD5 | High end computer graphics card, 6GB Memory |
References
- Hoffman, R. M., Yang, M. Subcellular imaging in the live mouse. Nature Protocols. 1 (2), 775-782 (2006).
- Ale, A., Ermolayev, V., Herzog, E., Cohrs, C., Angelis, M. H., Ntziachristos, V. FMT-XCT: in vivo animal studies with hybrid fluorescence molecular tomography-X-ray computed tomography. Nature Methods. 9 (9), 615-620 (2012).
- Eaton, V. L., Vasquez, K. O., Goings, G. E., Hunter, Z. N., Peterson, J. D., Miller, S. D. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. Journal of Neuroinflammation. 10 (138), (2013).
- Lederle, W., Arns, S., et al. Failure of annexin-based apoptosis imaging in the assessment of antiangiogenic therapy effects. EJNMMI Research. 1 (26), (2011).
- Ntziachristos, V., Tung, C. -H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nature Medicine. 8 (7), (2002).
- Hoffman, R. M. The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nature Reviews Cancer. 5 (10), 796-806 (2005).
- Schulz, R. B., Ale, A., et al. Hybrid system for simultaneous fluorescence and x-ray computed tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29 (2), 465-473 (2010).
- Stuker, F., Baltes, C., et al. Hybrid small animal imaging system combining magnetic resonance imaging with fluorescence tomography using single photon avalanche diode detectors. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (6), 1265-1273 (2011).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdés, P. A., Pogue, B. W. Preclinical Whole-body Fluorescence Imaging: Review of Instruments, Methods and Applications. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Kunjachan, S., Gremse, F., et al. Noninvasive optical imaging of nanomedicine biodistribution. ACS Nano. 7 (1), 252-262 (2013).
- Radrich, K., Ale, A., Ermolayev, V., Ntziachristos, V. Improving limited-projection-angle fluorescence molecular tomography using a co-registered x-ray computed tomography scan. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126011 (2012).
- Freyer, M., Ale, A., Schulz, R. B., Zientkowska, M., Ntziachristos, V., Englmeier, K. -H. Fast automatic segmentation of anatomical structures in x-ray computed tomography images to improve fluorescence molecular tomography reconstruction. Journal of Biomedical Optics. 15 (3), 036006 (2010).
- Gremse, F., Theek, B., et al. Absorption Reconstruction Improves Biodistribution Assessment of Fluorescent Nanoprobes Using Hybrid Fluorescence-mediated Tomography. Theranostics. 4 (10), 960-971 (2014).
- Cheong, W. -F., Prahl, S. A., Welch, A. J. A review of the optical properties of biological tissues. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2166-2185 (1990).
- Doleschel, D., Mundigl, O., et al. Targeted near-infrared imaging of the erythropoietin receptor in human lung cancer xenografts. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 53 (2), 304-311 (2012).
- Al Rawashdeh, W., Arns, S., et al. Optical tomography of MMP-activity allows a sensitive non-invasive characterization of the invasiveness and angiogenesis of SCC-xenografts. Neoplasia. 16 (3), 235-246 (2014).
- Kunjachan, S., Pola, R., et al. Passive versus Active Tumor Targeting Using RGD- and NGR-Modified Polymeric Nanomedicines. Nano Letters. 14 (2), 972-981 (2014).
- Schober, A., Nazari-Jahantigh, M., et al. MicroRNA-126-5p promotes endothelial proliferation and limits atherosclerosis by suppressing Dlk1. Nature Medicine. 20 (4), 368-376 (2014).
- Aikawa, E., Nahrendorf, M., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
- Gremse, F., Höfter, A., Schwen, L., Kiessling, F., Naumann, U. GPU-Accelerated Sparse Matrix-Matrix Multiplication by Iterative Row Merging. SIAM Journal on Scientific Computing. , C54-C71 (2015).
- Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. Quantitative Whole Body Biodistribution of Fluorescent-Labeled Agents by Non-Invasive Tomographic Imaging. PLoS ONE. 6 (6), e20594 (2011).
- Theek, B., Gremse, F., et al. Characterizing EPR-mediated passive drug targeting using contrast-enhanced functional ultrasound imaging. Journal of Controlled Release. 182 (1), 83-89 (2014).
- Hyde, D., Schulz, R., Brooks, D., Miller, E., Ntziachristos, V. Performance dependence of hybrid x-ray computed tomography/fluorescence molecular tomography on the optical forward problem. Journal of the Optical Society of America. A, Optics, Image Science, and Vision. 26 (4), 919-923 (2009).
- Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37 (2013).
- Loening, A. M., Gambhir, S. S. AMIDE: a free software tool for multimodality medical image analysis. Molecular Imaging. 2 (3), 131-137 (2003).
- Gremse, F., Schulz, V. Qualitative and Quantitative Data Analysis. Small Animal Imaging. , 363-378 (2011).
- Baiker, M., Milles, J., et al. Atlas-based whole-body segmentation of mice from low-contrast Micro-CT data. Medical Image Analysis. 14 (6), 723-737 (2010).
- Sevick-Muraca, E. M., Rasmussen, J. C. Molecular imaging with optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine. Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041303 (2008).
