Abstract
Fluorescens-medieret tomografi (FMT) muliggør langsgående og kvantitativ bestemmelse af fluorescens fordeling in vivo og kan anvendes til at vurdere biofordelingen af hidtil ukendte prober og vurdere sygdomsprogression under anvendelse af etablerede molekylære prober eller reportergener. Kombinationen med en anatomisk modalitet, fx mikro computertomografi (μCT), er til gavn for billedanalyse og til fluorescens genopbygning. Vi beskriver en protokol for multimodal μCT-FMT billedbehandling, herunder billedbehandling nødvendige skridt til at udtrække kvantitative målinger. Efter udarbejdelsen musene og udføre billedbehandling er de multimodale datasæt registreret. Efterfølgende en forbedret fluorescens rekonstruktion udført, som tager hensyn til formen på musen. For kvantitativ analyse, er orgel segmentations genereres på grundlag af de anatomiske data ved hjælp af vores interaktive segmentering værktøj. Endelig biodistributionen curves genereres under anvendelse af en batch-behandling funktion. Vi viser anvendeligheden af metoden ved at vurdere biofordelingen af en velkendt probe som binder til knogler og led.
Introduction
Fluorescens-medieret tomografi, også kaldet fluorescens molekylære tomografi (FMT), er en lovende teknik til kvantitativ vurdering fluorescensen fordeling i diffuse væv, såsom bedøvede mus eller endog humane kropsvæv, fx bryster eller fingerled. I modsætning til ikke-invasive mikroskopi teknikker, der tillader billeddannelse af overfladiske mål på subcellulær opløsning 1, FMT giver tredimensionel rekonstruktion af fluorescerende kilder i dybder på flere centimeter, om end på lavere opløsning 2. Mange målrettede fluorescerende prober er tilgængelige for billedet angiogenese, apoptose, inflammation og andre 2 - 5,. Nogle prober er aktiverbare, f.eks. Ved specifikke enzym spaltning fører til unquenching af fluorochromer. Desuden kan reportergener udtrykker fluorescerende proteiner skal afbildes, fx til at spore tumorcellemigration 6.
FMT stærkt nyder godt af kombinationen med en anatomisk modalitet, f.eks μCT 2,7 eller MR 8. Mens enkeltstående FMT-enheder er kommercielt tilgængelige 9, er vanskelige at fortolke uden anatomiske referenceoplysninger fluorescens billeder. For nylig var vi i stand til at vise, at de fusionerede anatomiske billeddata muliggør en mere robust analyse 10. De anatomiske data kan også anvendes til at tilvejebringe forudgående viden, såsom den ydre form af mus, hvilket er vigtigt for præcis optisk modellering og fluorescens genopbygning 11. Desuden kan estimeres optiske spredning og absorption maps hjælp segmentering af vævstyper og ved at tildele klasse specifikke koefficienter 12,13. For nær-infrarødt lys, hæmoglobin er den vigtigste absorber i mus, foruden melanin og pels 14. Siden blodvolumen relative varierer regionalt ved størrelsesordener, en absorption map er særlig vigtig for quantitative fluorescens genopbygning 13.
Én fordel ved anvendelse af ikke-invasive billeddannende indretninger er, at musene kan afbildes i længderetningen, dvs., på forskellige tidspunkter. Det er vigtigt at vurdere den dynamiske opførsel af sonder, dvs deres mål ophobning, biodistribution og udskillelse 10,15, eller at vurdere sygdomsprogression 16. Når billeddannelse flere mus på flere tidspunkter, en stor mængde af billedet datasæt opstår. For at aktivere sammenlignelighed, bør disse erhverves på en systematisk måde, dvs. med en veldefineret og dokumenteret protokol. Det store antal scanninger er en udfordring for billedanalyse, som kræves for at udtrække kvantitative målinger fra billeddataene.
Formålet med vores undersøgelse er at give en detaljeret beskrivelse af en μCT-FMT imaging-protokol, som vi anvendte og optimeret hele flere undersøgelser 10,13,15,17,18. Vi beskriverhvordan datasæt genereres, behandles, visualiseres og analyseres. Dette demonstreres ved hjælp af en etableret molekylær probe, OsteoSense, som binder til hydroxyapatit 19, og kan anvendes til at afbilde knoglesygdomme og remodellering 2. Alle procedurer, der involverer dyr blev godkendt af den statslige bedømmelsesudvalg på dyrs pleje.
Protocol
Protokollen indeholder en detaljeret beskrivelse af de følgende trin: Først er fantomer eller mus og det multimodale musen sengen forberedt til billeddannelse. Så en hel-krop-scanning er erhvervet i μCT. Efterfølgende musen sengen overføres til FMT hvor to scanninger er anskaffet (op og hovedet). Dette kan gentages for flere mus på forskellige tidspunkter. Efter afslutningen af købet af data, skal eksporteres og sorteres for at muliggøre automatiseret segmentering (kræver en Definiens softwarelicens), såvel som billede fusion og fluorescens rekonstruktion (kræver en Imalytics Prækliniske softwarelicens) dataene. Endelig er det vist, hvordan de multimodale datasæt visualiseres og hvordan organer er interaktivt segmenteret at kvantificere biofordelingen af fluorescerende prober.
1. Phantom Forberedelse
BEMÆRK: Phantoms er nyttige til at teste billeddannende system, men også at bestemme kalibreringen factor for en ny probe.
- Der fremstilles en opløsning af 200 ml vand, 2% agarose, 1,8 g TiO2 pulver, 50 pi trypanblåt. Efter kogning, fylde opløsningen i en rektangulær form omtrent 8 cm længde, 3 cm bredde og 1,5 cm høj.
- Forbered flere fluorescerende optagelser i fantom hjælp pipettespidser, der indeholder en blanding af fluorescens og μCT kontrastmiddel. At skabe de optagelser, skære pipettespidser og forsegle dem med en lighter.
- Efter at opløsningen er størknet, indsætte indeslutninger i fantom. Skåret væk nogle dele af fantomet til at opnå en uregelmæssig form og til at passe det til den multimodale muse holderen.
- At bestemme kalibreringsfaktoren til en ny probe, er nogle fantom scanninger påkrævet. Til dette er standard FMT fantom anvendes i kombination med kendte mængder af proben. For en øget nøjagtighed, tilsættes 4% lipid emulsion til løsningen for at modtage den samme spredning koefficient inde i integration som iResten af fantomet. Også tilføje en lille mængde (2%) af μCT kontrastmiddel til lettere billedanalyse.
2. Mouse Forberedelse
BEMÆRK: μCT-FMT imaging kræver særlig forberedelse, herunder bedøvelse og hårfjerning.
- Placer musen på klorofyl-fri mad 7 dage før billeddannelse. Dette vil reducere baggrundssignalet og er særlig vigtigt for FMT kanaler under 750 nm.
- Alle dyreforsøg udføres under bedøvelse. At indlede anæstesi, placeres musen i et kammer fyldt med 2% isofluran i luft (strømningshastighed 5 l / min), indtil musen er at falde i søvn. Bekræft ordentlig bedøvelse ved forsigtig tå eller hud klemme og ved at kontrollere lempelse af muskeltonus (f.eks., Kæbe muskel). At opretholde anæstesi, fortsætter isofluran program ved hjælp af et rør, der er anbragt på næsen af musen (2% isofluran i luft, strømningshastighed 1 l / min). For at forhindre øjet dryness, brug dyrlæge salve på bedøvede mus.
- At injicere kontrastmiddel, fastsætte den bedøvede musen på en varmepude ved brug tape. Placere et kateter (sprøjte nål fastgjort til et rør) til halevenen og sprøjt fluorescerende kontrastmiddel (f.eks 2 nmol med maksimal indsprøjtning volumen på 5 ml / kg legemsvægt, dvs. 150 pi for en 30 g mus).
- Til scanning af en behåret mus, scanningsområdet skal depileret på forhånd. Til dette skal du bruge en barbermaskine eller hårfjerning creme. Nogle stammer af mus kan udvikle udslæt fra hårfjerning fløde. Derfor overvåger musene for hudforandringer og kontakte veterinære personale til pleje, hvis nødvendigt. Også teste tolerancen på et lille antal dyr ved brug af nye musestammer.
- Holde musen bedøvet under μCT og FMT billeddannelse (2% isofluran i luft, strømningshastighed 1 l / min).
3. Mus Bed Preparation
BEMÆRK: μCT-FMT scanning, skal du bruge en multimodalseng mus, som passer både til μCT og FMT.
- Før billedbehandling, rengøre musen seng med vådt væv. Brug ikke ethanol, da dette kan beskadige akrylglas. Sørg for, at markører er fri for vand, da dette kan forringe automatiserede markør afsløring.
- Åbn skruerne på multimodale mus seng og fjern den øverste del.
- Fastgør bedøvende gas røret på musen seng og fikser den med tape.
- Placer bedøvede mus i musen seng og satte næsen ind i gassen røret. Sørg lederen af musen er på forsiden indikator for muse seng (figur 1).
- Kontroller, at musen er i midten af musen sengen til optimalt brug synsfeltet af FMT.
- Luk musen seng og spænd skruerne, indtil musen er stramt holdt. Sørg for, at musen kan ånde støt ved visuel kontrol af thorax vejrtrækning bevægelser.
4. μCT Imaging
BEMÆRK: En hel-krop scanning udføres ved hjælp af μCT. Den genererede anatomiske data er nødvendig for billedet fusion, for en forbedret fluorescens genopbygning og til billedanalyse.
- Placer musen seng med musen i μCT. Sørg for, at musen er placeret på en måde, det går "hale-først" i μCT. Dette er vigtigt for den automatiserede fusion.
- For at opretholde anæstesi når μCT-låget er lukket, tilslut rørene til at kanalisere gassen gennem tilfælde af μCT. Først afmontere langt rør fra musen seng og fastgøre den til stikket på ydersiden af μCT. Derefter lægger de resterende frie ende til stikket inde i μCT.
- Kør musen sengen i μCT. Sørg for, at gassen slangen ikke er løs og kan ikke blive fanget af den roterende gantry. Hvis det er nødvendigt, fiksere det med tape. Læg slangen ind i udskæringen på indehaveren af musen sengen. Luk μCT og erhverve en topogram. Vælge mindst to subscans at dække en væsentlig del af mus og musen seng, som er vigtigt for fusion og genopbygning.
- Vælg μCT scan protokol opkaldt HQD-6565-360-90, som erhverver 720 fremskrivninger med 1032 x 1012 pixels under en fuld rotation kræver en scanning på 90 s pr subscan. Rør drives ved spænding 65 kV og strøm 1,0 mA. Alternativt for at reducere dosis og scanning stråling varighed den, skal du vælge scanning protokol SQD-6565-360-29 som erhverver 720 fremskrivninger med 516 x 506 pixels med scanningstid 29 s pr subscan.
- Start μCT scanning. Den blå linje viser, at fremskridt. De subscans vil erhverves efterfølgende. Hypotermi og væsketab er ikke et problem på grund af den korte scanning varighed på kun nogle få minutter. Åbn ikke låget på μCT under scanningen, fordi det automatisk afbryde scanningen for at beskytte brugeren modstråling.
- Når scanningen er fuldført, skal du åbne låget, tilslut bedøvende røret og afmontere musen seng fra indehaveren til at transportere den til FMT.
5. FMT Imaging
BEMÆRK: Direkte efter μCT scanning, er musen scannes i FMT i to konfigurationer (op og hovedet ned), som anvendes sammen til en forbedret fluorescens genopbygning.
- Tænd bedøvelsesmidlet gasforsyning (2% isofluran i luft, strømningshastighed 1 l / min) for FMT før at placere musen sengen i FMT. Brug af FMT kontrol software, skal du oprette en studiekreds med et passende antal emner (dvs., mus). Vælg de prober, der vil blive anvendt til billeddannelse (brug OsteoSense for hidtil ukendte prober, der ikke er anført).
- Bær multimodale mus seng med musen til FMT. Den lange fleksible bedøvende gasrør opretholder gasstrømmen. Inden du sætter musen sengen i FMT, forsigtigt fjerne røret, da deter ikke nødvendigt inde i FMT. Undgå at dreje skruerne på musen sengen.
- Placer musen sengen ind i FMT med den røde indikator først ("hovedet først"). Dette er vigtigt for billedet fusion at være i overensstemmelse med μCT.
- Luk FMT.
- Vælg den korrekte studiegruppe og emne. Vælg den ønskede kanal FMT (for OsteoSense 750EX bruge 750 nm kanal).
- Tilføj en beskrivelse, f.eks., "Op" eller "ned" og erhverve et overblik scanning ved at trykke på "Capture". Dette indfanger en reflektans billede af hele synsfeltet. Sørg for ikke at have "Reflektansmålinger Images Only" er valgt, fordi ellers er det ikke muligt at erhverve 3D scanner efterfølgende.
- Justere billeddannende parametre for 3D scanning. Forstørre synsfeltet at medtage så meget som muligt af musen. Sædvanligvis vil hoved og hale ikke helt passer ind i synsfeltet, men. Klik på "Avanceret221; og kontrollere de billeddannende indstillinger. Sæt prøvetagning tæthed til 3 mm, følsomhed over for normal og belysning min / max til 5000 og 50000 hhv.
- Klik på "tilføj til genopbygning kø", og derefter klikke på "Scan" for at starte FMT scanning. Dette vil tage omkring 5 til 15 minutter, afhængig af størrelsen og tykkelsen af musen, fordi længere eksponeringstider er nødvendige for tykkere genstande. Enheden indeholder en opvarmet imaging kammer for at undgå hypotermi.
- Efter scanningen, flip musen sengen herunder musen på hovedet og erhverve en anden scanning. Dette giver yderligere data for fluorescens genopbygning.
- Når μCT og FMT-scanninger er afsluttet, og musen vågner op fra bedøvelsen, ikke overlade det uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed, fx at gå rundt eller at opretholde brystleje.
6. Billede Fusion og genopbygning
BEMÆRK: Efterfærdiggørelse af μCT-FMT scanning, f.eks, ved afslutningen af undersøgelsen, behov den erhvervede data, der skal sorteres, for at den automatiserede billede fusion og fluorescens genopbygning.
- At sortere scanner efter yderligere behandling, skal du oprette en mappe til undersøgelsen. For hver μCT-FMT scanning, skal du oprette en undermappe, hvis navn indeholder muse-id og tidspunkt, f.eks., M01_02h.
- For hver μCT-FMT scan, eksportere FMT scanninger (op og ned) som .fmt filer og gemme dem i undermappen hjælp filnavne slutter med enten "_up.fmt" eller "_down.fmt". Hver .fmt fil indeholder den erhvervede rådata, dvs. de excitation og emission billeder erhvervet af kameraet, metadata, såsom eksponeringstider og fluorescens rekonstruktion genereret af FMT.
- Ved hjælp af μCT softwaren, skal du oprette en rekonstruktion med isotropisk voxel størrelse 35 um. Vælg en glat rekonstruktion kerne (T10). Justere synsfeltet såat hele muse sengen herunder markørerne er dækket. Vælg MIFX / RAW som output format og starte genopbygningen. Efter genopbygningen er færdig, flytte μCT genopbygning filer i undermappen af μCT-FMT scanning.
- Eksportere μCT og FMT data for alle scanninger. Sørg for, at hver undermappe indeholder to .fmt filer (op og ned) og μCT genopbygning i MIFX / RAW-format. At kontrollere for fuldstændighed vælge Menu-> CT-FMT-> Kontroller fuldstændighed ved hjælp af Imalytics Prækliniske software. En liste over fejl kan forekomme, såsom manglende .fmt filer eller μCT rekonstruktioner. Fix de fejl, og kontrollere for fuldstændighed, indtil alle fejl er løst.
- Brug af Menu-> CT-FMT-> Indstillinger, check servernavnet på Definiens software og juster om nødvendigt. Standarden er http: // localhost: 8184, under forudsætning af, at Definiens softwaren er installeret på den samme computer. Den Definiens software er påkrævet i det næste trin at udføre automated segmentering af musen seng og markører.
- Klik Menu-> CT-FMT-> Fuse gruppe i Imalytics Prækliniske software til at udføre automatiserede μCT-FMT fusion for hele undersøgelsen. Det tager et par minutter pr μCT-FMT scanning og resulterer i en mappe med endelsen "pakke" parallelt med undersøgelsen mappe. Dette indeholder en mindre delmængde af filer (de μCT data og smeltet leverandør-forudsat FMT rekonstruktion), der er relevante for yderligere analyse.
- Klik Menu-> CT-FMT-> Rekonstruere gruppe (FMT) i Imalytics Prækliniske software til at udføre fluorescens genopbygning, herunder generering af absorption og spredning maps 13. Selv om behandlingen er GPU-accelererede 20, hver rekonstruktion kræver 1 til 4 h afhængigt af størrelsen af musen. Resultaterne vil blive gemt i pakken mappe. Bemærk: Hvis du vil aktivere en højere kapacitet, vi i øjeblikket udføre disse rekonstruktioner på en GPU klynge med 56 GPU'er.
7. Image Analysis
BEMÆRK: For at udtrække kvantitative målinger fra billeddataene, er segmentering af læsioner og organer påkrævet.
- Når alle data sæt er smeltet og rekonstrueret, oprette en segmentering for hver μCT-FMT scanne ved hjælp af Imalytics Prækliniske software.
- Indlæse en μCT fil som underlag og fluorescens-fil som overlay. Tryk på "3D" for at tænde for lyden rendering og inspicere datasættet.
- At segmentere lungerne, klik Menu-> Classes-> Tilføj klasse og oprette en klasse med navnet "tmp". Dette kan også ske gennem genvejsmenuen. Oprettelse af en ny klasse indstiller det automatisk som output klasse for efterfølgende segmentering operationer.
- Udfør en tærskelværdiansættelse operation at segmentere alle regioner med lav intensitet i μCT datasættet (klik Menu-> Segmentation-> Thresholding-> Nedenfor og indtast 600). Nu tmp klassen indeholder luften uden for mobruge, men også lungevævet.
- Opret en "Lung" klasse. Udfør en "Fill Region" operation (højreklik i lungerne, og vælg Menu-> Fyld region-> Udfyld region ubegrænset), for at adskille lungerne fra den ydre luft.
- Slet tmp klasse, fordi det ikke er nødvendigt længere.
- At segmentere konvekse regioner, f.eks., Blæren, bruge skrible tilstand. Først oprette en klasse "Blære".
- Tryk på F1 for at slette alle skriblerier.
- Brug af computermus, tegne skriblerier at afgrænse grænserne for blæren.
- Tryk F3 for at fylde området afgrænses af skriblerier med midlertidig maske, der vises som røde overlay. Iterativt tilføje flere skriblerier (i enhver udskæring orientering), og tryk F3, indtil en tilstrækkelig nøjagtighed er opnået. Typisk scribbles i 10 skiver er tilstrækkelige.
- Tryk F4 for at gemme den midlertidige maske som "Blære".
- Fortsæt på denne måde at segmentereandre konvekse regioner som hjerte og nyrer. Mange regioner, f.eks., Maven eller leveren, kan tilnærmes med et par konvekse regioner.
- At segmentere rygsøjlen, først oprette en "Bone" klasse.
- Vælg ContextMenu-> Thresholding-> Over at udføre en tærskelværdiansættelse operation for at klassificere alle lyse voxels (f.eks., Over 1.600) som "Bone".
- En region fyldningen ikke ville segment rygsøjlen, fordi den er forbundet med mange andre dele af skelettet, f.eks., Ribbenene. Udføre et par skæreoperationer ved iterativt at tegne kruseduller og trykke på F2 for at adskille rygsøjlen fra kraniet, ribbenene og den sakrale knoglen.
- Endelig oprette en klasse "Spine" og udføre en region påfyldning operation at få rygsøjlen (højreklik i rygsøjlen og vælg ContextMenu-> Udfyld region-> Udfyld region ubegrænset).
- Gem segmentering som en fil inde the undermappe af μCT-FMT scanning. Anvende en ensartet navn, f.eks organs.seg, at aktivere batchbehandling.
- Vælg Menu-> Statistics-> Klasse statistik (overlay), til at generere et regneark, som indeholder den gennemsnitlige fluorescensintensitet, volumen og det samlede beløb (produkt af gennemsnitlig og volumen) for hver kategori.
- For at generere en enkelt regneark, der indeholder værdierne for alle regioner i alle μCT-FMT scanninger, skal du klikke på Menu-> Batch-> Indstil batch indstillinger, og klik derefter på Menu-> Batch-> Batch statistik. Derved undgår indsatsen for at skabe og samle mange regneark filer, dvs én for hver μCT-FMT scanning.
8. Probe kalibrering
- At beregne kalibreringsfaktoren for en probe, flere μCT-FMT phantom scanninger med er obligatoriske forskellige kendte mængder af proben (se trin 1.4), f.eks., Med 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol og 0 pmol.
- Scan fantomer som beskrevet i§§ 4 og 5. Også for phantom scanninger, op og ned scanninger i FMT er påkrævet.
- Eksportere data og udfører fusion og genopbygning, som beskrevet i afsnit 6.
- Segment optagelsen ved hjælp af μCT data for hver scanning ved tærsklingsrutine (over 1.200) og region påfyldning.
- Generer et regneark med de målte fluorescens mængder og plot dem som funktion af de kendte mængder. Beregne hældningen af en lineær regression fit. Dette er kalibreringsfaktoren for sonden.
Representative Results
Vi anvendte den beskrevne protokol til at vurdere biofordelingen af en målrettet probe, OsteoSense, som binder til hydroxyapatit. 3 mus (C57BL / 6 ApoE - / - Ahsg - / - dobbelt knockout mus 10 uger gamle) blev afbildet før og 15 min, 2 timer, 4 timer, 6 timer og 24 timer efter iv injektion af 2 nmol OsteoSense. Vores software registreres automatisk markørerne indbygget i den multimodale muse seng (figur 1, figur 2A, B), som gjorde det muligt fusion af de anatomiske μCT data med fluorescens rekonstruktion udført af FMT (figur 2C, D). Da OsteoSense er en sonde med en lav molekylvægt, en hurtig renal udskillelse og derfor højt signal i urinblæren forventes. Fusion af fluorescensen rekonstruktion af FMT afsløret problemer såsom malplaceret signal uden for blæren (figur 2C, D). Disse problemer opstår fordi FMT ikke kender den sande form af musen og antager en blok form. Our genopbygning bestemmer den nøjagtige form fra μCT data og genererer spredning og absorption kort 13 for at muliggøre en mere nøjagtig rekonstruktion fluorescens med bedre signal lokalisering, som er særlig tydelig for blæren (Figur 2E, F).
For at tildele den rekonstruerede fluorescens passende områder, vi interaktivt segmenteret flere organer ved hjælp af vores software (Figur 3). For hver af de 18 scanninger blev 7 regioner segmenteret baseret på μCT data, dvs.., Hjerte, lunge, lever, nyrer, spine, tarm og blære. Efterfølgende blev den software, der anvendes til at beregne den gennemsnitlige fluorescens koncentration for hver af de 126 regioner. Heldigvis softwaren giver en batch mode, som beregner alle de værdier og gemmer dem i en enkelt regneark.
At visualisere fluorescens distribution, blev 3D-gengivelser genereret for hvert tidspunkt,hjælp sammenlignelige vinduesystemet indstilling (figur 4A-F). Brug af kvantificerede orgel værdier blev biofordelingen beregnet ved at tage gennemsnittet af de orgel værdier over tre mus (Figur 4G). Pre scanninger, erhvervet før injektion, udviste ubetydelig baggrund signal. 15 min efter injektion, det stærkeste signal optrådte i urinblæren, på grund af den hurtige renal udskillelse. På de efterfølgende tidspunkter, havde den tilbageværende sonden akkumuleret på knogler og led.
Figur 1. Multimodal Mouse Bed. (A) Den multimodale mus seng indeholder to akryl glasplader, der stramt holder musen. Stramningen justeres ved hjælp af to skruer. Musen seng indeholder markører (tomme huller) til billedbehandling fusion. Bedøvende gas tilføres ved hjælp af en fleksibel slange, som er fikseret med tabe. (B) Musen seng er fastgjort til en metalholder og holdes i centrum af den roterende μCT gantry. (C) Undgå et mellemrum mellem mus seng og metal holderen, for ellers er de markører kan fejlagtigt tildeles fører til forkert fusion. Bedøvelsesmidlet gasrør skal være fastgjort til røret stikket. (D) Musen seng skal indsættes i FMT med den forreste først kan ske en korrekt automatiseret fusion. (E) De markører er synlige for FMT kamera, som bruges til automatisk markør afsløring og fusion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Billede Fusion og genopbygning. (A, B) Markers og den ydre form af mouSE bestemmes af den automatiserede segmentering algoritme. (C, D) 15 min efter injektion af OsteoSense, har en betydelig mængde af sonden allerede blevet udskilt i urinblæren. Efter at fusionere sælgeren-forudsat rekonstruktion med μCT data, bliver problemerne synlige. Det meste af signalet vises rundt om blæren, men ikke inde i blæren og nogle signal vises også i luften. Dette sker, fordi FMT antager en blokformet mus. (E, F) Vores forbedret fluorescens genopbygning, ved hjælp af formen på musen afledt af μCT data resulterer i en bedre lokalisering af fluorescens inde i blæren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Interaktiv Organ Segmentat. ion (A) For at kvantificere fluorescens distribution, er flere organer segmenteret: heart (rød), lunge (lyserød), lever (brun), mave (beige), ryg (lilla), nyrerne (gul), tarm (grøn) og urinblære (guld). (B) I lunge, der er stærkt kontrast i forhold til det omgivende væv, er segmenteret ved hjælp af tærskelværdier og region påfyldning. (C) Runde organer, såsom blære, nyrer og hjerte er segmenteret ved hjælp af "scribbles". (D) organer med en mere kompleks form, f.eks, lever og mave segmenteres trinvist ved hjælp skriblerier. At segmentere rygsøjlen, er en høj tærskel anvendes på segment alle knogler. Så nogle knogler, f.eks., Ribbenene, er skåret væk, indtil rygsøjlen forbliver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Biofordeling. For at vurdere biofordelingen musene scannes på flere tidspunkter (AF). (A) Den på forhånd scanning, før injektion, viser lidt baggrund signal i 750 nm kanal. (B) 15 min efter injektion, er en betydelig mængde af sonden allerede i urinblæren. (C) Ved 2 timer tidspunkt havde mus urinerede, hvilket resulterer i nogle fluorescens uden for musen. På senere tidspunkter (DF), vises signal overvejende på knogler og led, dvs.., På ryggen og knæene. (G) De kvantitative fluorescens-koncentration er vist for udvalgte organer.
Discussion
Vi beskriver og anvende en protokol for multimodal μCT-FMT billeddannelse. Vi bruger kommercielt tilgængelige og udbredte FMT og μCT enheder 3,11,15 - 17,21. Mens protokollen kræver en specifik FMT kan μCT erstattes af et andet μCT med lignende funktionalitet og sammenlignelige scanningsparametre fx skal synsfeltet være store nok til at dække musen sengen herunder markører.
FMT er blevet anvendt til biodistribution analyse uden at kombinere det med μCT eller MR 21 imidlertid den anatomiske data er gavnligt at forøge reproducerbarheden fordi segmenteringen kan baseres på organet grænser, der er synlige i de μCT data 10. Mens er blevet udviklet integrerede μCT-FMT enheder 2,7, er disse ikke kommercielt tilgængelige endnu. Desuden er brugen af to separate enheder tillader rør, dvs.., Den næste muse CAn afbildes i μCT mens den første mus er stadig i FMT, for at øge gennemløbet.
For at reducere den manuelle arbejdsbyrde, vi udfører automatisk markør afsløring og fusion. Endvidere er musen formen automatisk segmenteret og denne information forbedrer fluorescensen genopbygning 11,13,22. For kvantitativ fluorescens genopbygning, er absorption og spredning maps behov 13,23. Vi udlede spredning kortet ved automatiseret segmentering af μCT data og tildele kendte scattering koefficienter af flere vævstyper (lunge, knogler, hud, fedt, og den resterende blødt væv) 24. Efterfølgende vi rekonstruere en absorption kort fra det optiske rå data, som er særligt vigtigt for well-perfunderede organer såsom hjertet og leveren 13,20.
Scanning flere mus på forskellige tidspunkter hurtigt resulterer i et stort antal datasæt, der skal analyseres. For biodisbidragsbaserede studier, skal være segmenteret for hver μCT-FMT scanning flere organer. Desværre kan de segmentations ikke genbruges, fordi musen nyligt er placeret i musen seng gentagne gange. Vi bruger et værktøj til interaktiv segmentering, udviklet på vores institut, men andre værktøjer kan også være hensigtsmæssigt 25. Vi genererer voxel-wise segmenteringer, fordi disse matcher bedre til komplekse organer end enkle former såsom ellipser og terninger 26. Automatiseret segmentering hel-dyr ville være nyttigt at yderligere at reducere den manuelle arbejdsbyrde 27, men en interaktiv segmentering værktøj vil stadig være behov for at korrigere for segmentering fejl. Desuden kan automatiserede segmentering værktøjer næppe forudse særlige sager som patologier korrekt. Da vi bruger native μCT scanninger, er meget vanskelige at segment nogle organer såsom milten selv manuelt. Kontrastmidler ville hjælpe, men der er problemer med tolerabilitet og det er vanskeligt at maintaina steady kontrastmiddel fordeling over hele den langsgående billeddannelse.
Vores fantom undersøgelse viser, at signalet lokalisering forbedres ved brug forminformationen til fluorescens genopbygning. In vivo, en tilsvarende forbedring er indlysende for den tidlige tidspunkt (15 min efter injektion), når en stor mængde af proben er allerede i blære. Hydroxyapatit-bindende probe akkumulerer på knogler og led. Det er bemærkelsesværdigt, hvor hurtigt dette sker, dvs. signalet er allerede tydeligt på ryggen 15 min efter injektion. Dette sandsynligvis skyldes den lave molekylvægt af sonden, som muliggør hurtig ekstravasation og diffusion til målregionerne. Proben binder kovalent til sit mål hydroxyapatit og den ubundne probe udskilles. For de senere tidspunkter, mellem 6 timer og 24 timer efter injektion, signalintensiteten i rygsøjlen forbliver relativt stabil, sandsynligvis, fordi næppe lys rebrokken dybt ind i musen til at blege fluorescensen. For vores undersøgelse, brugte vi 750 nm kanal, hvilket resulterer i lav baggrund fluorescens som tydeligt for scanninger erhvervet før injektion. Ved lavere bølgelængder, kan mere baggrund signal forventes 28.
Sammenfattende beskriver vi en multimodal billedbehandling protokol for kommercielt tilgængelige FMT og μCT enheder. Vi viser, at kombinationen giver fordele for fluorescens genopbygning. Vi viser, hvordan biofordelingen kurver er udvundet fra den store mængde billeddata ved hjælp af segmentering interaktiv orgel og batchbehandling. Vi mener, at denne standardiserede arbejdsgang kan være nyttigt for lægemiddeludvikling og andre billeddiagnostiske undersøgelser ved hjælp af fluorescens-mærkede prober.
Disclosures
Felix Gremse er grundlægger og ejer af Gremse-IT, en start virksomhed, der tilbyder software og tjenester til medicinsk billedanalyse i samarbejde med Philips og Institut for Eksperimentel Molekylær Billeddannelse af RWTH Aachen University.
Acknowledgments
Vi takker Marek Weiler til udførelse af phantom eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af Det Europæiske Forskningsråd (ERC Starting Grant 309495: NeoNaNo), den tyske stat Nordrhein-Westfalen (NRW, High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (EFRE) ForSaTum), den tyske Ministeriet for Uddannelse og Forskning (BMBF) (finansieringsprogrammer Virtual Lever (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), Den RWTH Aachen University (I 3 TM Seed Fund), og Philips Research (Aachen, Tyskland).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX | PerkinElmer | FMT2000 | Device for fluorescence molecular tomography |
| µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo | CT Imaging GmbH | Tomoscope Duo | Device for micro computed tomography |
| Multimodal Mouse Bed | CT Imaging GmbH | Experimental builder | Partially transparent animal holder |
| IsoFlo (isoflurane, USP) | Abbott | 05260-05 | Isoflurane Inhalation anesthesia |
| Small animal anesthesia system | Harvard apparatus | 726419 | Complete Isoflurane Table-Top System |
| Chlorophyll-free mouse food | Ssniff | E15051 | low chlorophyll / low fluorescence food |
| OsteoSense 750EX | PerkinElmer | NEV10053EX | Animal FMT contrast agent |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smith medical | 800/100/120 | Tube for injection catheter |
| Sterican 30g | BBraun | 4656300 | Hypodermic needle for catheter |
| Imeron | Altana pharma | INLA F.1/0203/3.5337.69 | CT contrast agent for the phantom inclusions |
| Agarose | Sigma | 90-12-36-6 | Agarose for phantom production |
| TiO2 | Applichem | A1900,1000 | Titanium oxyde as phantom scattering agent |
| Trypan blue | Fluka | 93595 | Trypan blue to adjust phantom light propagation |
| Cy7 | Lumiprobe | 15020 | Fluorochrome for the phantom inclusions |
| Lipovenoes 20% | Fresenius Kabi | 3094740 | Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents |
| Definiens Developer XD Server | Definiens AG | Server XD | Software platform for automated segmentation |
| Imalytics Preclinical | ExMI/Gremse-IT | Version 2.0.1 | Software for image fusion, reconstruction and analysis |
| NVIDIA Geforce Titan | Asus | GTXTITAN6GD5 | High end computer graphics card, 6GB Memory |
References
- Hoffman, R. M., Yang, M. Subcellular imaging in the live mouse. Nature Protocols. 1 (2), 775-782 (2006).
- Ale, A., Ermolayev, V., Herzog, E., Cohrs, C., Angelis, M. H., Ntziachristos, V. FMT-XCT: in vivo animal studies with hybrid fluorescence molecular tomography-X-ray computed tomography. Nature Methods. 9 (9), 615-620 (2012).
- Eaton, V. L., Vasquez, K. O., Goings, G. E., Hunter, Z. N., Peterson, J. D., Miller, S. D. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. Journal of Neuroinflammation. 10 (138), (2013).
- Lederle, W., Arns, S., et al. Failure of annexin-based apoptosis imaging in the assessment of antiangiogenic therapy effects. EJNMMI Research. 1 (26), (2011).
- Ntziachristos, V., Tung, C. -H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nature Medicine. 8 (7), (2002).
- Hoffman, R. M. The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nature Reviews Cancer. 5 (10), 796-806 (2005).
- Schulz, R. B., Ale, A., et al. Hybrid system for simultaneous fluorescence and x-ray computed tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29 (2), 465-473 (2010).
- Stuker, F., Baltes, C., et al. Hybrid small animal imaging system combining magnetic resonance imaging with fluorescence tomography using single photon avalanche diode detectors. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (6), 1265-1273 (2011).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdés, P. A., Pogue, B. W. Preclinical Whole-body Fluorescence Imaging: Review of Instruments, Methods and Applications. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Kunjachan, S., Gremse, F., et al. Noninvasive optical imaging of nanomedicine biodistribution. ACS Nano. 7 (1), 252-262 (2013).
- Radrich, K., Ale, A., Ermolayev, V., Ntziachristos, V. Improving limited-projection-angle fluorescence molecular tomography using a co-registered x-ray computed tomography scan. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126011 (2012).
- Freyer, M., Ale, A., Schulz, R. B., Zientkowska, M., Ntziachristos, V., Englmeier, K. -H. Fast automatic segmentation of anatomical structures in x-ray computed tomography images to improve fluorescence molecular tomography reconstruction. Journal of Biomedical Optics. 15 (3), 036006 (2010).
- Gremse, F., Theek, B., et al. Absorption Reconstruction Improves Biodistribution Assessment of Fluorescent Nanoprobes Using Hybrid Fluorescence-mediated Tomography. Theranostics. 4 (10), 960-971 (2014).
- Cheong, W. -F., Prahl, S. A., Welch, A. J. A review of the optical properties of biological tissues. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2166-2185 (1990).
- Doleschel, D., Mundigl, O., et al. Targeted near-infrared imaging of the erythropoietin receptor in human lung cancer xenografts. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 53 (2), 304-311 (2012).
- Al Rawashdeh, W., Arns, S., et al. Optical tomography of MMP-activity allows a sensitive non-invasive characterization of the invasiveness and angiogenesis of SCC-xenografts. Neoplasia. 16 (3), 235-246 (2014).
- Kunjachan, S., Pola, R., et al. Passive versus Active Tumor Targeting Using RGD- and NGR-Modified Polymeric Nanomedicines. Nano Letters. 14 (2), 972-981 (2014).
- Schober, A., Nazari-Jahantigh, M., et al. MicroRNA-126-5p promotes endothelial proliferation and limits atherosclerosis by suppressing Dlk1. Nature Medicine. 20 (4), 368-376 (2014).
- Aikawa, E., Nahrendorf, M., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
- Gremse, F., Höfter, A., Schwen, L., Kiessling, F., Naumann, U. GPU-Accelerated Sparse Matrix-Matrix Multiplication by Iterative Row Merging. SIAM Journal on Scientific Computing. , C54-C71 (2015).
- Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. Quantitative Whole Body Biodistribution of Fluorescent-Labeled Agents by Non-Invasive Tomographic Imaging. PLoS ONE. 6 (6), e20594 (2011).
- Theek, B., Gremse, F., et al. Characterizing EPR-mediated passive drug targeting using contrast-enhanced functional ultrasound imaging. Journal of Controlled Release. 182 (1), 83-89 (2014).
- Hyde, D., Schulz, R., Brooks, D., Miller, E., Ntziachristos, V. Performance dependence of hybrid x-ray computed tomography/fluorescence molecular tomography on the optical forward problem. Journal of the Optical Society of America. A, Optics, Image Science, and Vision. 26 (4), 919-923 (2009).
- Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37 (2013).
- Loening, A. M., Gambhir, S. S. AMIDE: a free software tool for multimodality medical image analysis. Molecular Imaging. 2 (3), 131-137 (2003).
- Gremse, F., Schulz, V. Qualitative and Quantitative Data Analysis. Small Animal Imaging. , 363-378 (2011).
- Baiker, M., Milles, J., et al. Atlas-based whole-body segmentation of mice from low-contrast Micro-CT data. Medical Image Analysis. 14 (6), 723-737 (2010).
- Sevick-Muraca, E. M., Rasmussen, J. C. Molecular imaging with optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine. Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041303 (2008).
