Abstract
La fluorescence induite par tomographie (FMT) permet de déterminer longitudinal et quantitative de la distribution de la fluorescence in vivo et peut être utilisé pour évaluer la biodistribution de nouvelles sondes et pour évaluer la progression de la maladie en utilisant des sondes moléculaires établies ou des gènes rapporteurs. La combinaison avec une modalité anatomique, par exemple, micro tomodensitométrie (μCT), est bénéfique pour l'analyse d'image et de reconstruction de fluorescence. Nous décrivons un protocole d'imagerie multimodal μCT-FMT, comprenant les étapes de traitement d'image nécessaires pour extraire des mesures quantitatives. Après avoir préparé les souris et effectuer la formation d'image, les ensembles de données sont des marques multimodales. Par la suite, une amélioration de la reconstruction de la fluorescence est effectuée, qui tient compte de la forme de la souris. Pour l'analyse quantitative, segmentations d'organes sont générés sur la base des données anatomiques en utilisant notre outil de segmentation interactive. Enfin, le cu de biodistributionrves sont générées en utilisant une fonction de traitement par lots. Nous montrons l'applicabilité de la méthode en évaluant la biodistribution d'une sonde bien connu qui se lie à des os et des articulations.
Introduction
tomographie de fluorescence à médiation par, tomographie moléculaire par fluorescence aussi appelée (FMT), est une technique prometteuse pour évaluer quantitativement la distribution de la fluorescence diffuse dans les tissus, tels que les souris anesthésiées, voire des tissus du corps humain, par exemple les seins ou les articulations des doigts. Contrairement aux techniques de microscopie non invasives, ce qui permet l'imagerie des cibles superficielles à une résolution subcellulaire, FMT permet la reconstruction tridimensionnelle de sources fluorescentes à des profondeurs de plusieurs centimètres, mais à plus basse résolution 2. De nombreuses sondes fluorescentes ciblés sont disponibles pour l'image de l'angiogenèse, l'apoptose, l'inflammation et d'autres 2-5. Certaines sondes sont activable, par exemple,. Par clivage enzymatique spécifique conduisant à unquenching de fluorochromes. En outre, des gènes rapporteurs exprimant des protéines fluorescentes peuvent être visualisés, par exemple, pour suivre la migration des cellules tumorales 6.
FMT bénéficie fortement de la combinaison avec une modalité anatomique, par exemple, μCT 2,7 ou 8 IRM. Alors que les dispositifs de FMT autonomes sont disponibles dans le commerce 9, les images de fluorescence sont difficiles à interpréter sans information de référence anatomique. Récemment, nous avons pu montrer que les données fondu d'image anatomique permet une analyse plus robuste 10. Les données anatomiques peuvent également être utilisés pour fournir des connaissances antérieures, telles que la forme extérieure de la souris, ce qui est important pour la modélisation optique précis et reconstruction 11 fluorescence. En outre, les cartes de diffusion et d'absorption optiques peuvent être estimées en utilisant la segmentation des types de tissus et en attribuant des coefficients spécifiques de classe 12,13. Pour la lumière proche infrarouge, l'hémoglobine est l'absorbeur principal chez la souris, outre la mélanine et de la fourrure 14. Depuis le volume relatif de sang varie selon les régions par ordre de grandeur, une carte d'absorption est particulièrement important pour les quanquanti- 13 reconstruction de fluorescence.
Un avantage de l'utilisation de dispositifs d'imagerie non invasifs est que les souris peuvent être imagés longitudinalement, soit en de multiples points de temps. Ceci est important pour évaluer le comportement dynamique des sondes, à savoir, leur accumulation cible, biodistribution et l'excrétion 10,15, ou pour évaluer la progression de la maladie 16. Lorsque Imagerie plusieurs souris à de multiples points dans le temps, une grande quantité d'ensembles de données d'image se produit. Pour permettre la comparabilité, ceux-ci devraient être acquis d'une manière systématique, à savoir, avec un protocole bien défini et documenté. Le grand nombre de scans pose un défi pour l'analyse de l'image, qui est nécessaire pour extraire des mesures quantitatives à partir des données d'image.
Le but de notre étude est de fournir une description détaillée d'un protocole d'imagerie μCT-FMT que nous avons utilisé et optimisé à travers plusieurs études 10,13,15,17,18. Nous décrivonsla manière dont les ensembles de données sont générées, traitées, visualisées et analysées. Cela est démontré en utilisant une sonde moléculaire établi, OsteoSense, qui se lie à l'hydroxyapatite 19, et peut être utilisé pour des maladies osseuses et l'image 2 remodelage. Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvés par le comité d'examen gouvernemental sur les soins aux animaux.
Protocol
Le protocole contient une description détaillée des étapes suivantes: Dans un premier temps, des fantômes ou des souris et le lit de la souris multimodal sont préparés pour l'imagerie. Puis un balayage du corps entier est acquis dans le μCT. Ensuite, le lit de la souris est transférée à la FMT où deux balayages sont acquis (en haut et tête en bas). Ceci peut être répété pour plusieurs souris à différents points dans le temps. Après l'achèvement de l'acquisition de données, les données doivent être exportées et triés pour permettre la segmentation automatique (nécessitant une licence de logiciel Definiens), ainsi que la fusion d'images et de la reconstruction de fluorescence (nécessitant une licence de logiciel Imalytics préclinique). Enfin, il est montré comment les ensembles de données multimodales sont visualisés et la façon dont les organes sont segmentées de manière interactive pour quantifier la biodistribution des sondes fluorescentes.
1. Préparation Phantom
REMARQUE: Les fantômes sont utiles pour tester le système de formation d'image, mais aussi de déterminer la calibration factor pour une nouvelle sonde.
- Préparer une solution de 200 ml d'eau, 2% d'agarose, 1,8 g de poudre de TiO 2, 50 pi de bleu trypan. Après ébullition, remplissez la solution dans une forme rectangulaire, d'environ 8 cm de longueur, 3 cm de largeur et 1,5 cm de hauteur.
- Préparer plusieurs inclusions fluorescentes dans le fantôme en utilisant des embouts de pipette, contenant un mélange de fluorescence et μCT agent de contraste. Pour créer les inclusions, couper les pointes de pipette et les sceller avec un briquet.
- Après que la solution a solidifié, insérer les inclusions dans le fantôme. Coupez certaines parties du fantôme de parvenir à une forme irrégulière et de l'adapter au support de la souris multimodal.
- Pour déterminer le facteur d'étalonnage pour une nouvelle sonde, quelques scans de fantômes sont nécessaires. Pour cela, le défaut FMT fantôme est utilisé en combinaison avec des quantités connues de la sonde. Pour une précision accrue, ajouter 4% émulsion lipidique à la solution pour recevoir le même coefficient de diffusion à l'intérieur de la prise en compte que dans lereste du fantôme. Également ajouter une petite quantité (2%) de μCT agent de contraste pour faciliter l'analyse d'image.
2. Préparation de la souris
NOTE: imagerie μCT-FMT nécessite une préparation spéciale, y compris l'anesthésie et l'épilation.
- Placez la souris sur la nourriture gratuite chlorophylle 7 jours avant l'imagerie. Cela permettra de réduire le signal de fond et est particulièrement important pour les chaînes de FMT dessous de 750 nm.
- Toutes les expériences sur les animaux sont réalisées sous anesthésie. Pour lancer l'anesthésie, placez la souris dans une chambre remplie de 2% d'isoflurane dans l'air (de débit de 5 L / min) jusqu'à ce que la souris se endort. Confirmez anesthésie appropriée par orteil douce ou pincements de la peau et en cochant la relaxation du tonus musculaire (par ex., La mâchoire musculaire). Pour maintenir l'anesthésie, de continuer l'application isoflurane utilisant un tube qui est placé sur le nez de la souris (2% d'isoflurane dans l'air, débit de 1 L / min). Afin d'éviter drynes oculairess, utilisez vétérinaire pommade sur des souris anesthésiées.
- Pour injecter un agent de contraste, fixer la souris anesthésiée sur un coussin chauffant en utilisant du ruban. Placer un (aiguille de seringue fixée à un tube) de cathéter de la veine de la queue et injecter l'agent de contraste fluorescent (par exemple, 2 nmol, avec un volume maximum d'injection de 5 ml / kg de poids corporel, soit 150 ul pour une souris de 30 g).
- Pour balayer une souris velues, la zone de numérisation doit être épilé à l'avance. Pour cela, utiliser une crème de suppression rasoir ou les cheveux. Certaines souches de souris peuvent développer des éruptions cutanées de la crème d'épilation. Par conséquent, suivre la souris pour les modifications de la peau et de communiquer avec le personnel vétérinaire pour des soins si nécessaire. Également tester la tolérance sur un petit nombre d'animaux lors de l'utilisation de nouvelles souches de souris.
- Garder la souris anesthésiés pendant μCT et l'imagerie FMT (2% d'isoflurane dans l'air, débit de 1 L / min).
3. Souris Chambres Préparation
NOTE: Pour la numérisation μCT-FMT, utiliser un multimodallit la souris, ce qui correspond à la fois dans le μCT et la FMT.
- Avant imagerie, nettoyer le lit de la souris avec les tissus humides. Ne pas utiliser de l'éthanol, car cela pourrait endommager le verre acrylique. Assurez-vous que les marqueurs sont libres d'eau, car cela peut nuire à la détection du marqueur automatisé.
- Ouvrez les vis du lit de la souris multimodal et retirez la partie supérieure.
- Fixez le tube de gaz anesthésique sur le lit de la souris et fixer avec du ruban adhésif.
- Placez la souris anesthésiés dans le lit de la souris et de mettre le nez dans le tube de gaz. Assurez-vous que la tête de la souris est à l'indicateur devant le lit de la souris (Figure 1).
- Assurez-vous que la souris est dans le milieu du lit de la souris pour utiliser de manière optimale le champ de vision de la FMT.
- Fermez le lit de la souris et serrer les vis jusqu'à ce que la souris est bien tenu. Assurez-vous que la souris peut respirer régulièrement par une surveillance visuelle des mouvements respiratoires thoraciques.
4. Je μCTforgemagie
NOTE: Un balayage du corps entier est effectuée en utilisant l'μCT. Les données générées anatomique est requise pour la fusion d'images, pour une reconstruction améliorée de fluorescence et d'analyse de l'image.
- Placez le lit de la souris avec la souris dans le μCT. Assurez-vous que la souris est placée d'une manière qui il va «queue-première" dans la μCT. Ceci est important pour la fusion automatisé.
- Afin de maintenir l'anesthésie lorsque le μCT-couvercle est fermé, reconnecter les tubes de canaliser le gaz à travers le cas de la μCT. Première détacher le tube long du lit de la souris et fixez-le au connecteur à l'extérieur de la μCT. Ensuite, fixez l'extrémité libre restant sur le connecteur à l'intérieur du μCT.
- Conduire le lit de la souris dans le μCT. Assurez-vous que le tube de gaz est lâche pas et ne peut pas se faire prendre par le portique rotatif. Si nécessaire, fixer avec du ruban adhésif. Insérer le tube dans la découpe du support du lit de la souris. Fermez le μCT et acquérir un topogramme. Sélectionnez au moins deux sous-balayages pour couvrir une partie substantielle de la souris et le lit de la souris, ce qui est important pour la fusion et de la reconstruction.
- Sélectionnez le protocole de balayage μCT nommé HQD-6565-360-90, qui acquiert 720 projections avec 1032 x 1012 pixels au cours d'une rotation complète nécessitant un temps de 90 s par sous-balayage de balayage. Les tubes sont exploités à la tension de 65 kV et un courant de 1,0 mA. Sinon, pour réduire la durée de la dose de rayonnement et de la numérisation, sélectionnez le protocole de balayage SQD-6565-360-29 qui acquiert 720 projections avec 516 x 506 pixels avec un temps de balayage 29 s par sous-balayage.
- Démarrez la numérisation μCT. La barre bleue indique la progression. Les sous-balayages seront acquises ultérieurement. Hypothermie et la perte de liquide ne sont pas un problème en raison de la durée de l'analyse à court de seulement quelques minutes. Ne pas ouvrir le couvercle de la μCT pendant la numérisation parce que cela va interrompre automatiquement le balayage pour protéger l'utilisateur contrerayonnement.
- Lorsque la numérisation est terminée, ouvrir le couvercle, rebrancher le tube d'anesthésie et de détacher le lit de la souris de son détenteur à transporter à la FMT.
5. FMT Imaging
NOTE: Directement après la numérisation μCT, la souris est balayé dans la FMT en deux configurations (haut et la tête en bas) qui sont utilisés conjointement pour une reconstruction de fluorescence améliorée.
- Ouvrir l'alimentation de gaz anesthésique (2% d'isoflurane dans l'air, débit de 1 L / min) pour la FMT avant de placer le lit de la souris dans la FMT. En utilisant le logiciel de contrôle FMT, créer un groupe d'étude avec un nombre approprié de sujets (c.-souris). Sélectionnez les sondes qui seront utilisés pour l'imagerie (utilisation OsteoSense pour de nouvelles sondes qui ne sont pas répertoriés).
- Effectuer le lit de la souris multimodal avec la souris pour la FMT. Le long tube flexible de gaz anesthésique maintient le débit de gaz. Avant d'insérer le lit de la souris dans la FMT, retirez soigneusement le tube car ilest pas nécessaire à l'intérieur de la FMT. Évitez de tourner les vis du lit de la souris.
- Placez le lit de la souris dans la FMT avec l'indicateur rouge premier ("la tête la première»). Ceci est important pour l'image de fusion pour être cohérent avec le μCT.
- Fermez la FMT.
- Sélectionnez le groupe d'étude correcte et le sujet. Sélectionnez le canal requis de la FMT (pour OsteoSense 750EX, utiliser le canal 750 nm).
- Ajoutez une description, par exemple., «Haut» ou «bas» et d'acquérir une analyse aperçu en appuyant sur "Capture". Cette capture une image de réflectance de l'ensemble du champ de vision. Assurez-vous de ne pas avoir "réflectance Images Only" choisis, parce que sinon il est impossible d'acquérir 3D numérise ensuite.
- Réglez les paramètres d'imagerie pour la numérisation 3D. Agrandir le champ de vision d'inclure autant que possible de la souris. Habituellement, la tête et la queue ne rentre pas entièrement dans le champ de vue, cependant. Cliquez sur "Avancé221; et de vérifier les paramètres d'imagerie. Densité d'échantillonnage réglée sur 3 mm, la sensibilité aux min / max normal et un éclairage de 5000 et 50 000, respectivement.
- Cliquez sur "Ajouter à la liste de reconstruction" puis cliquez sur "Scan" pour lancer le scan de FMT. Cela prendra environ 5 à 15 minutes, selon la taille et l'épaisseur de la souris, parce que de plus longues durées d'exposition sont nécessaires pour des objets épais. Le dispositif contient une chambre d'imagerie chauffé à éviter l'hypothermie.
- Après le scan, retournez le lit de la souris, y compris la souris à l'envers et d'acquérir une autre analyse. Ceci permet d'obtenir des données supplémentaires pour la reconstruction de fluorescence.
- Lorsque le μCT et la FMT-scans sont terminées et la souris se réveille de l'anesthésie, ne le laissez pas sans surveillance tant qu'il a repris conscience suffisante, par exemple, pour se promener ou pour maintenir décubitus sternal.
6. Fusion d'image et de la Reconstruction
NOTE: Aprèsachèvement du balayage μCT-FMT, par exemple, à la fin de l'étude, les données acquises doivent être triés pour permettre la fusion de l'image et de reconstruction automatique de fluorescence.
- Pour trier les scans pour un traitement ultérieur, créer un dossier pour l'étude. Pour chaque balayage μCT-FMT, créer un sous-dossier dont le nom contient l'ID de la souris et le point de temps, par exemple., M01_02h.
- Pour numériser chaque μCT-FMT, exporter les scans FMT (haut et bas) que .fmt fichiers et de les enregistrer dans le sous-dossier en utilisant les noms de fichiers se terminant par soit "_up.fmt" ou "_down.fmt". Chaque fichier contient .fmt les données brutes acquises, à savoir, les excitation et d'émission des images acquises par la caméra, les métadonnées, telles que les temps d'exposition, et la reconstruction de fluorescence générée par la FMT.
- Utilisation du logiciel μCT, créer une reconstruction avec la taille de voxel isotrope 35 um. Sélectionnez un noyau de reconstruction lisse (T10). Réglez le champ de vision afinque le lit de souris entier, y compris les marqueurs est couverte. Sélectionnez MIFX / RAW comme format de sortie et commencer la reconstruction. Après la reconstruction est terminée, déplacer les fichiers de reconstruction μCT dans le sous-dossier de l'analyse μCT-FMT.
- Exporter les données μCT et FMT pour toutes les numérisations. Assurez-vous que chaque sous-dossier contient deux fichiers .fmt (haut et bas) et la reconstruction de μCT dans le / format RAW MIFX. Pour vérifier l'exhaustivité sélectionnez Menu-> CT-FMT-> Vérifier Exhaustivité en utilisant le logiciel Imalytics préclinique. Une liste des erreurs peut apparaître comme manquant .fmt fichiers ou reconstructions μCT. Corrigez les erreurs et vérifier l'intégralité jusqu'à ce que toutes les erreurs sont corrigées.
- Utilisation Menu-> CT-FMT-> Paramètres, vérifiez le nom du serveur du logiciel Definiens et ajuster si nécessaire. La valeur par défaut est http: // localhost: 8184, en supposant que le logiciel Definiens est installé sur le même ordinateur. Le logiciel Definiens est nécessaire à l'étape suivante pour effectuer l'UAsegmentation matique du lit de la souris et des marqueurs.
- Cliquez sur Menu-> CT-FMT-> groupe de fusibles dans le logiciel Imalytics préclinique pour effectuer automatisé fusion μCT-FMT pour l'ensemble de l'étude. Cela prend quelques minutes par μCT-FMT numériser et résultats dans un dossier avec le suffixe "Package" parallèle dans le dossier d'étude. Celui-ci contient un petit sous-ensemble de fichiers (les données μCT et la reconstruction FMT fourni par le vendeur fusionné) qui sont pertinents pour une analyse ultérieure.
- Cliquez sur Menu-> CT-FMT-> Reconstruire groupe (FMT) dans le logiciel Imalytics préclinique d'effectuer la reconstruction de fluorescence y compris la génération d'absorption et de diffusion des cartes 13. Même si le traitement est accéléré par GPU 20, chaque reconstruction nécessite 1 à 4 heures en fonction de la taille de la souris. Les résultats seront stockés dans le dossier du package. Remarque: Pour permettre un débit plus élevé, nous effectuons actuellement ces reconstructions sur un cluster de GPU avec 56 GPU.
7. Analyse de l'image
NOTE: Pour extraire des mesures quantitatives à partir des données d'image, la segmentation des lésions et des organes est nécessaire.
- Une fois que tous les ensembles de données sont fusionnées et reconstruits, créent une segmentation pour chaque μCT-FMT numérisation à l'aide du logiciel Imalytics préclinique.
- Charger un fichier de sous-couche et μCT que le fichier de fluorescence en superposition. Appuyez sur "3D" pour activer le rendu de volume et d'inspecter l'ensemble de données.
- Pour segmenter le poumon, cliquez sur Menu-> Classes-> Ajouter classe et créer une classe nommée "tmp". Cela peut aussi être fait par le menu contextuel. Création d'une nouvelle classe définit automatiquement comme classe de sortie pour les opérations de segmentation suivantes.
- Effectuez une opération de seuillage de segmenter toutes les régions à faible intensité dans l'ensemble de données μCT (cliquez sur Menu-> Segmentation-> Thresholding-> Ci-dessous et entrez 600). Maintenant, la classe tmp contient l'air extérieur de la moutiliser mais également le tissu pulmonaire.
- Créer une classe "poumon". Effectuez une opération "Remplissez Région" (clic droit dans le poumon et sélectionnez Menu-> Remplir Région-> Remplir région illimité), pour séparer le poumon de l'air extérieur.
- Supprimer la classe tmp car il est plus nécessaire.
- Pour segments régions convexes, par exemple., La vessie, utilisez le mode gribouillis. D'abord créer une "vessie" de classe.
- Appuyez sur F1 pour supprimer tous les gribouillages.
- Utilisation de la souris d'ordinateur, dessiner gribouillages pour délimiter les limites de la vessie.
- Appuyez sur F3 pour remplir la région délimitée par les gribouillis avec un masque temporaire qui apparaît comme superposition rouge. Ajouter itérativement plusieurs gribouillis (dans tous les sens de tranchage) et appuyez sur F3 jusqu'à une précision suffisante est obtenue. Typiquement, gribouillis en 10 tranches sont suffisantes.
- Appuyez sur F4 pour enregistrer le masque temporaire "vessie".
- Procédez ainsi pour segmenterd'autres régions convexes tels que le cœur et les reins. De nombreuses régions, par exemple., De l'estomac ou le foie, peuvent être estimés par quelques régions convexes.
- Pour le segment de la colonne vertébrale, d'abord créer une classe "Bone".
- Sélectionner ContextMenu-> Thresholding-> ci-dessus pour effectuer une opération de seuillage à classer tous les voxels lumineuses (par exemple., 1600 ci-dessus) en tant que "Bone".
- Une opération région de remplissage ne permettrait pas de segment de la colonne vertébrale, car il est connecté avec beaucoup d'autres parties du squelette, par exemple., Les côtes. Effectuer quelques opérations de coupe en tirant de manière itérative gribouillis et en appuyant sur F2 pour séparer la colonne vertébrale du crâne, les côtes, et le sacrum.
- Enfin, créer une classe "Spine" et effectuer une opération de remplissage région pour obtenir la colonne vertébrale (clic droit dans la colonne vertébrale et sélectionnez ContextMenu-> Remplir Région-> Remplir région illimité).
- Enregistrer la segmentation comme un fichier à l'intérieur ee sous-dossier de l'analyse μCT-FMT. Utilisez un nom conforme, par exemple, organs.seg, afin de permettre le traitement par lots.
- Sélectionnez Menu-> les Statistiques> Classe statistiques (overlay), pour générer une feuille de calcul qui contient l'intensité de fluorescence moyenne, le volume et le montant total (produit de la moyenne et volume) pour chaque classe.
- Pour générer une seule feuille de calcul contenant les valeurs de toutes les régions de toutes les analyses μCT-FMT, cliquez sur Menu-> par lots> paramètres du lot SET et puis cliquez sur Menu->> Statistiques par lots par lots. Cela évite l'effort de création et de fusion de plusieurs fichiers de tableur, soit un pour chaque balayage μCT-FMT.
8. Sonde d'étalonnage
- Pour calculer le facteur d'étalonnage pour une sonde, plusieurs balayages fantômes μCT-FMT avec différentes quantités connues de la sonde sont nécessaires (voir l'étape 1.4), par exemple., Avec 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol et 0 pmol.
- Scannez les fantômes comme décrit danssections 4 et 5. Aussi pour les scans fantômes, en hausse et les analyses dans la FMT sont nécessaires.
- Exporter les données et d'effectuer la fusion et de la reconstruction, comme décrit dans la section 6.
- Segment l'inclusion en utilisant les données μCT pour chaque balayage par seuillage (au-dessus de 1200) et la région de remplissage.
- Générer une feuille de calcul avec les quantités de fluorescence mesurées et les tracer en fonction des quantités connues. Calculer la pente d'un ajustement par régression linéaire. Ceci est le facteur d'étalonnage pour la sonde.
Representative Results
Nous avons appliqué le protocole décrit pour évaluer la biodistribution d'une sonde, OsteoSense ciblée, qui se lie à l'hydroxyapatite. 3 souris (C57BL / 6 Apoe - / - AHSG - / - souris à double inactivation, 10 semaines) ont été imagées avant et 15 min, 2 h, 4 h, 6 h, et 24 h après l'injection intraveineuse de 2 nmol OsteoSense. Notre logiciel détecte automatiquement les marqueurs intégrés dans le lit de la souris multimodal (figure 1, figure 2A, B), ce qui a permis la fusion des données de μCT anatomiques avec la reconstruction de fluorescence effectuée par le FMT (figure 2C, D). Depuis OsteoSense est une sonde avec un faible poids moléculaire, une excrétion rénale rapide et donc grand signal dans la vessie est attendu. Fusion de la reconstruction de la fluorescence de la FMT a révélé des problèmes tels que le signal déplacée à l'extérieur de la vessie (figure 2C, D). Ces problèmes se produisent parce que la FMT ne connaît pas la vraie forme de la souris et assume une forme de bloc. Oureconstruction r détermine la forme exacte des données et génère μCT diffusion et l'absorption des cartes 13 afin de permettre une reconstruction plus précise de la fluorescence avec une meilleure localisation de signal, ce qui est particulièrement évident pour la vessie (figure 2E, F).
Pour affecter la fluorescence reconstruit les régions appropriées, nous interactive segmenté plusieurs organes en utilisant notre logiciel (Figure 3). Pour chacun des 18 scans, 7 régions ont été segmentés basés sur les données μCT, ie., Cœur, poumon, foie, les reins, la colonne vertébrale, de l'intestin et de la vessie. Par la suite, le logiciel a été utilisé pour calculer la concentration moyenne de fluorescence pour chacun des 126 régions. Heureusement, le logiciel fournit un mode de traitement par lots, qui calcule toutes les valeurs et les enregistre dans une seule feuille de calcul.
Pour visualiser la distribution de la fluorescence, rendus 3D ont été générées pour chaque point de temps,Avec le réglage de fenêtrage comparables (figure 4A-F). En utilisant les valeurs d'organes quantifiés, la biodistribution a été calculé en faisant la moyenne des valeurs d'organes au cours des trois souris (figure 4G). Les scans pré, acquises avant l'injection, ont montré négligeable signal de fond. 15 min après l'injection, le signal le plus fort est apparu dans la vessie, en raison de l'excrétion rénale rapide. Aux points de temps ultérieurs, la sonde restante avait accumulé à os et des articulations.
Figure 1. multimodal Souris Chambres. (A) Le lit de la souris multimodal contient deux plaques de verre acrylique qui maintiennent fermement la souris. Le serrage est ajustée à l'aide de deux vis. Le lit de la souris contient des marqueurs (trous vides) pour la fusion d'images. Gaz anesthésique est fournie au moyen d'un tube flexible qui est obsédé avec tsinge. (B) Le lit de la souris est fixé à un support de métal et son maintien dans le centre du portique rotatif μCT. (C) Eviter un écart entre le lit de la souris et le support de métal, parce que sinon, les marqueurs peuvent être incorrectement assignés conduisant à la fusion incorrecte. Le tube de gaz anesthésique doit être attaché au connecteur de tube. (D) Le lit de la souris doit être inséré dans le FMT avec la première face pour permettre une fusion automatique correct. (E) Les marqueurs sont visibles à la caméra FMT, qui est utilisé pour la détection du marqueur automatisé et de la fusion. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Fusion d'image et de la reconstruction. (A, B) Marqueurs et la forme extérieure du mouse sont déterminées par l'algorithme de segmentation automatique. (C, D) 15 min après l'injection de OsteoSense, une quantité considérable de la sonde a déjà été excrétée dans la vessie urinaire. Après la fusion de la reconstruction fournie par des vendeurs avec les données μCT, les problèmes deviennent visibles. La plupart du signal apparaît autour de la vessie, mais pas à l'intérieur de la vessie et quelque signal apparaît même dans l'air. Cela arrive parce que la FMT assume une souris en forme de bloc. (E, F) Notre meilleure reconstruction de fluorescence, en utilisant la forme de la souris dérivée des données μCT, résultats dans une meilleure localisation de la fluorescence à l'intérieur de la vessie. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Organ Segmentat Interactive. ion (A) pour quantifier la distribution de fluorescence, plusieurs organes sont segmentés: coeur (rouge), du poumon (rose), le foie (marron), de l'estomac (beige), la colonne vertébrale (violet), les reins (jaune), l'intestin (vert) et la vessie urinaire (or). (B) le poumon, ce qui est fortement contrasté par rapport au tissu environnant, est segmenté en utilisant le seuillage et de la région de remplissage. (C) organes rondes, comme la vessie, les reins et le cœur sont segmentés en utilisant "gribouillis". (D) Organes avec une forme plus complexe, par exemple, le foie et l'estomac sont segmentés par incréments utilisent gribouillis. Pour le segment de la colonne vertébrale, un seuil élevé est appliqué à tous les segments os. Puis quelques os, par exemple., Les côtes, sont coupées, jusqu'à ce que la colonne vertébrale reste. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. biodistribution. Pour évaluer la biodistribution, les souris sont scannées à plusieurs points de temps (AF). (A) L'analyse préalable, avant l'injection, montre peu de signal de fond dans le canal 750 nm. (B) 15 min après l'injection, une quantité considérable de la sonde est déjà dans la vessie urinaire. (C) à la 2 h point de temps, la souris avait uriné, qui se traduit par une certaine fluorescence en dehors de la souris. Aux points de temps plus tard (DF), le signal apparaît principalement dans les os et les articulations, ie., À la colonne vertébrale et les genoux. (G) La concentration de fluorescence quantifiée est représenté pour certains organes.
Discussion
Nous décrivons et appliquons un protocole d'imagerie multimodale μCT-FMT. Nous utilisons FMT disponible dans le commerce et largement utilisé et dispositifs μCT 3,11,15 - 17,21. Bien que le protocole nécessite une FMT spécifique, le μCT peut être remplacé par un autre μCT avec des fonctionnalités similaires et les paramètres de numérisation comparables, par exemple, le champ de vision doit être suffisamment large pour couvrir le lit de la souris, y compris les marqueurs.
La FMT a été utilisé pour l'analyse de biodistribution sans le combiner avec μCT IRM ou 21, cependant, les données anatomiques est bénéfique pour augmenter la reproductibilité puisque la segmentation peut être calculée sur la base des limites d'organes qui sont visibles dans les données μCT 10. Alors que les appareils μCT-FMT intégrés ont été développés 2,7, ceux-ci ne sont pas encore disponibles dans le commerce. En outre, l'utilisation de deux dispositifs distincts permet tuyauterie, à savoir., La souris suivant can imager dans la μCT souris tandis que le premier est toujours dans la FMT, pour augmenter le débit.
Pour réduire la charge de travail manuel, nous effectuons la détection du marqueur automatisé et de la fusion. En outre, la forme de la souris est automatiquement cette information segmenté et améliore de façon significative la 11,13,22 de reconstruction de fluorescence. Pour la reconstruction quantitative de fluorescence, cartes d'absorption et de diffusion sont nécessaires 13,23. Nous tirons la carte de la diffusion par la segmentation automatique des données μCT et en attribuant des coefficients de diffusion connus de plusieurs types de tissus (poumon, os, la peau, la graisse, et le reste des tissus mous) 24. Par la suite, nous reconstruisons une carte d'absorption à partir des données brutes optique qui est particulièrement important pour les organes bien irrigués comme le cœur et le foie 13,20.
Numérisation plusieurs souris à de multiples points de temps se traduit rapidement par un grand nombre d'ensembles de données à analyser. Pour Biodisétudes de distri-, plusieurs organes doivent être segmenté pour chaque balayage μCT-FMT. Malheureusement, les segmentations ne peuvent pas être réutilisés, parce que la souris est nouvellement positionnée dans le lit de la souris à plusieurs reprises. Nous utilisons un outil de segmentation interactif, développé dans notre institut, cependant, d'autres outils peuvent aussi être approprié 25. Nous générons des segmentations de voxels-sage, parce que ceux-ci correspondent mieux aux organes complexes de formes simples telles que des ellipses et des cubes 26. Automatisée segmentation animal entier serait utile de réduire davantage la charge de travail manuel 27, mais un outil de segmentation interactive serait encore nécessaire pour corriger les erreurs de segmentation. En outre, des outils de segmentation automatique peuvent difficilement anticiper les cas particuliers tels que les pathologies correctement. Puisque nous utilisons des analyses de μCT indigènes, certains organes tels que la rate sont très difficiles à segmenter même manuellement. Les agents de contraste aideraient, mais il ya des problèmes avec la tolérabilité et il est difficile d'entretenir cetna distribution de l'agent de contraste régulière tout au long de l'imagerie longitudinale.
Notre étude fantôme montre que la localisation du signal est améliorée lors de l'utilisation des informations de forme pour la reconstruction de fluorescence. In vivo, une amélioration similaire est évidente pour le point de contrôle d'avance (15 minutes après l'injection), quand une grande quantité de la sonde est déjà dans le la vessie urinaire. La sonde d'hydroxyapatite liaison accumule à os et des articulations. Il est remarquable de voir comment cela se produit rapidement, à savoir, le signal est déjà clairement visible à la colonne vertébrale 15 minutes après l'injection. Ceci est probablement dû à la faible poids moléculaire de la sonde, ce qui permet l'extravasation et rapide diffusion dans les régions cibles. La sonde se lie de manière covalente à son hydroxyapatite cible et la sonde non liée est excrété. Pour les points de temps plus tard, entre 6 h et 24 h après l'injection, l'intensité du signal dans la colonne vertébrale reste relativement stable, sans doute, parce que presque toute la lumière recourbatures profondément dans la souris pour blanchir la fluorescence. Pour notre étude, nous avons utilisé le canal 750 nm, ce qui en résulte une faible fluorescence de fond aussi évident pour les scans acquis avant l'injection. Aux longueurs d'onde plus faibles, plus le signal de fond peut être 28 prévu.
En résumé, nous décrivons un protocole d'imagerie multimodale pour dispositifs disponibles dans le commerce et FMT μCT. Nous montrons que la combinaison offre des avantages pour la reconstruction de fluorescence. Nous illustrons la façon dont les courbes de biodistribution sont extraits à partir de la grande quantité de données d'image au moyen de segmentation interactive d'organes et de traitement par lots. Nous croyons que ce flux de travail standardisé peut être utile pour le développement de médicaments et d'autres études d'imagerie utilisant des sondes marquées par fluorescence.
Disclosures
Felix Gremse est fondateur et propriétaire de Gremse-IT, une entreprise en démarrage qui offre des logiciels et services d'analyse d'images médicales en collaboration avec Philips et le ministère des fins expérimentales d'imagerie moléculaire de l'Université RWTH Aachen.
Acknowledgments
Nous remercions Marek Weiler pour effectuer les expériences de fantômes. Ce travail a été soutenu par le Conseil européen de la recherche (ERC Starting Grant de 309 495: NeoNaNo), l'État fédéral allemand de Rhénanie du Nord Westphalie (NRW; High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (EFRE); ForSaTum), l'allemand Ministère de l'Education et de la Recherche (BMBF) (programmes de financement du foie virtuel (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), l'Université RWTH Aachen (I 3 Fonds de stimulation de TM), et de recherche de Philips (Aachen, Allemagne).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX | PerkinElmer | FMT2000 | Device for fluorescence molecular tomography |
| µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo | CT Imaging GmbH | Tomoscope Duo | Device for micro computed tomography |
| Multimodal Mouse Bed | CT Imaging GmbH | Experimental builder | Partially transparent animal holder |
| IsoFlo (isoflurane, USP) | Abbott | 05260-05 | Isoflurane Inhalation anesthesia |
| Small animal anesthesia system | Harvard apparatus | 726419 | Complete Isoflurane Table-Top System |
| Chlorophyll-free mouse food | Ssniff | E15051 | low chlorophyll / low fluorescence food |
| OsteoSense 750EX | PerkinElmer | NEV10053EX | Animal FMT contrast agent |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smith medical | 800/100/120 | Tube for injection catheter |
| Sterican 30g | BBraun | 4656300 | Hypodermic needle for catheter |
| Imeron | Altana pharma | INLA F.1/0203/3.5337.69 | CT contrast agent for the phantom inclusions |
| Agarose | Sigma | 90-12-36-6 | Agarose for phantom production |
| TiO2 | Applichem | A1900,1000 | Titanium oxyde as phantom scattering agent |
| Trypan blue | Fluka | 93595 | Trypan blue to adjust phantom light propagation |
| Cy7 | Lumiprobe | 15020 | Fluorochrome for the phantom inclusions |
| Lipovenoes 20% | Fresenius Kabi | 3094740 | Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents |
| Definiens Developer XD Server | Definiens AG | Server XD | Software platform for automated segmentation |
| Imalytics Preclinical | ExMI/Gremse-IT | Version 2.0.1 | Software for image fusion, reconstruction and analysis |
| NVIDIA Geforce Titan | Asus | GTXTITAN6GD5 | High end computer graphics card, 6GB Memory |
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