Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הדמיה μCT-FMT היברידי וניתוח תמונה

Published: June 4, 2015 doi: 10.3791/52770
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2, 1,3, 1, 1
1Experimental Molecular Imaging, RWTH Aachen University, 2Institute for Biomedical Engineering - Biointerface Laboratory, RWTH Aachen University, 3Utrecht Institute for Pharmaceutical Sciences, Utrecht University
* These authors contributed equally

Abstract

טומוגרפיה תיווך הקרינה (FMT) מאפשרת קביעת אורך וכמותי של הפצת הקרינה in vivo וניתן להשתמש בו כדי להעריך את biodistribution של בדיקות חדשניות ולהעריך את התקדמות מחלה באמצעות בדיקות מולקולריות הוקמו או גני כתב. השילוב עם שיטה אנטומיים, למשל, טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו (μCT), מועיל לניתוח תמונה ולשיקום הקרינה. אנו מתארים פרוטוקול להדמיה multimodal μCT-FMT כוללים צעדי עיבוד תמונה דרושים כדי לחלץ מדידות כמותיות. לאחר הכנת העכברים וביצוע ההדמיה, ערכות נתונים multimodal רשומות. בהמשך לכך, שחזור הקרינה משופר מתבצע, אשר לוקח בחשבון את הצורה של העכבר. לניתוח כמותי, פילוחי איבר נוצרים מבוססים על נתונים אנטומיים באמצעות כלי הפילוח האינטראקטיבי שלנו. לבסוף, מ"ק biodistributionrves נוצרים באמצעות תכונת עיבוד אצווה. אנחנו מראים את תחולתה של השיטה על ידי הערכת biodistribution של בדיקה ידועה שנקשרה לעצמות ומפרקים.

Introduction

טומוגרפיה תיווך הקרינה, טומוגרפיה הקרינה נקראת גם מולקולרית (FMT), היא טכניקה מבטיחה להעריך את הפצת הקרינה ברקמות מפוזרת, כגון עכברים מורדמים או אפילו רקמות גוף אדם, למשל, שדיים או מפרקי אצבע כמותית. בניגוד לשיטות מיקרוסקופיה לא פולשנית, המאפשרות הדמיה של מטרות שטחיות ברזולוציה subcellular 1, FMT מאפשר שחזור תלת ממדי של מקורות ניאון במעמקים של כמה סנטימטרים, אם כי ברזולוציה נמוכה יותר 2. בדיקות ניאון ממוקדות רבות זמינות לאנגיוגנזה תמונה, אפופטוזיס, דלקת, ואחרים 2-5. בדיקות חלקם activatable, למשל., על ידי מחשוף אנזים ספציפי המוביל לunquenching של fluorochromes. יתר על כן, ניתן הדמיה גני הכתב להביע חלבוני ניאון, למשל, כדי לעקוב אחר תאים סרטניים הגירה 6.

FMT מאוד נהנה מהשילוב עם שיטה אנטומיים, למשל, μCT 2,7 או MRI 8. בעוד מכשירי FMT עצמאיים הם זמינים מסחריים 9, תמונות הקרינה קשות לפרש ללא מידע התייחסות אנטומיים. לאחרונה הצליחו להראות, כי נתוני תמונה אנטומית התמזגו מאפשרים ניתוח חזק יותר 10. גם נתונים אנטומיים יכולים לשמש כדי לספק ידע מוקדם, כגון צורה החיצונית של העכבר, וזה חשוב עבור מודלים אופטיים מדויקים וקרינת שחזור 11. יתר על כן, ניתן להעריך מפות פיזור וקליטה אופטיות באמצעות פילוח של סוגי רקמות ועל ידי הקצאת מקדמים ספציפיים כיתת 12,13. לאור האינפרה-אדום קרוב, המוגלובין הוא בולם העיקרי בעכברים, מלבד מלנין ופרווה 14. מאז ביחס נפח הדם משתנה אזורי לפי סדר גודל, מפת קליטה היא חשובה במיוחד עבור קוואןשחזור הקרינה titative 13.

אחד יתרונות של שימוש במכשירי הדמיה לא פולשנית הוא שניתן הדמיה העכברים לאורך זמן, כלומר, בנקודות זמן שונות. זה חשוב להעריך את ההתנהגות הדינמית של בדיקות, כלומר, הצטברות היעד שלהם, biodistribution והפרשה 10,15, או להעריך את התקדמות המחלה 16. כאשר הדמיה כמה עכברים בנקודות זמן מרובים, כמות גדולה של ערכות נתונים תמונה עולה. כדי לאפשר השוואה, אלה צריכים להיות שנרכשו באופן שיטתי, כלומר, עם פרוטוקול מוגדר היטב ומתועד. המספר הגדול של סריקות מציב אתגר לניתוח תמונה, אשר נדרש כדי לחלץ מדידות כמותיות מנתוני התמונה.

מטרת המחקר שלנו היא לספק תיאור מפורט של פרוטוקול ההדמיה μCT-FMT שהשתמשנו ומותאם לאורך מספר מחקרים 10,13,15,17,18. אנו מתאריםאיך ערכות נתונים נוצרות, מעובד, דמיינו, ונותח. זה בא לידי ביטוי באמצעות בדיקה הוקמה מולקולרית, OsteoSense, שנקשרה לhydroxyapatite 19, וניתן להשתמש בם למחלות עצם תמונה ושיפוץ 2. כל הנהלים הקשורים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת ביקורת הממשלתית על טיפול בבעלי חיים.

Protocol

הפרוטוקול מכיל תיאור מפורט של השלבים הבאים: בשלב ראשון, רוחות רפאים או עכברים ומיטת עכבר multimodal מוכנים להדמיה. לאחר מכן סריקה של כל הגוף שנרכשה בμCT. בהמשך לכך מיטת העכבר מועברת לFMT בו שתי סריקות נרכשות (והפוכה). זה יכול להיות חוזר ונשנה לעכברים מרובים בנקודות זמן שונות. לאחר השלמת רכישת נתונים, הנתונים צריך להיות מיוצאים ומסודרים על מנת לאפשר פילוח אוטומטי (דורש רישיון תוכנת Definiens), כמו גם היתוך תמונה ושחזור הקרינה (דורש רישיון תוכנת Imalytics פרה-קליני). לבסוף הוא הראה כיצד ערכות נתונים multimodal הם דמיינו ואיך איברים אינטראקטיבי מפולחים לכמת את biodistribution של בדיקות ניאון.

1. הכנת פנטום

הערה: פנטומים שימושיים כדי לבדוק את מערכת ההדמיה, אלא גם כדי לקבוע את הכיול פקטוr לבדיקה חדשה.

  1. הכן תמיסה של מים 200 מיליליטר, agarose 2%, אבקת Tio 2 1.8 גר ', trypan כחול 50 μl. לאחר הרתיחה, למלא את הפתרון לצורה מלבנית, כ באורך 8 סנטימטר, רוחב 3 סנטימטר, וגובה 1.5 סנטימטר.
  2. הכן כמה תכלילים ניאון בפנטום באמצעות טיפים פיפטה, המכיל שילוב של הקרינה וחומר ניגוד μCT. כדי ליצור את תכלילים, לחתוך את הטיפים פיפטה ולאטום אותם עם מצית.
  3. לאחר הפתרון הקרושה, להכניס את תכלילים לפנטום. לחתוך חלקים מסוימים של הפנטום כדי להשיג צורה לא סדירה ולהתאים אותה לבעל עכבר multimodal.
  4. כדי לקבוע את גורם הכיול לבדיקה חדשה, כמה סריקות פנטום נדרשות. לשם כך, פנטום FMT ברירת המחדל משמש בשילוב עם סכומים ידועים של החללית. לדיוק מוגבר, להוסיף 4% תחליב שומנים לפתרון כדי לקבל את אותו מקדם פיזור בתוך ההכללה כמו בשאר הפנטום. גם להוסיף כמות קטנה (2%) חומר ניגוד μCT של לניתוח תמונה יותר קל.

2. עכבר הכנה

הערה: ההדמיה μCT-FMT דורשת הכנה מיוחדת הכוללים הרדמה והסרת שיער.

  1. מניחים את העכבר על מזון ללא כלורופיל 7 ימים לפני ההדמיה. זה יקטין את אות הרקע וחשוב במיוחד עבור ערוצי FMT מתחת 750 ננומטר.
  2. כל הניסויים בבעלי החיים מבוצעים תחת הרדמה. ליזום ההרדמה, במקום את העכבר בתא מלא בisoflurane 2% באוויר (קצב זרימה 5 L / min) עד העכבר להירדם. לאשר הרדמה תקינה על ידי הבוהן או עור צביטה עדינה ועל ידי בדיקת הרפיה של שרירים טונוס (למשל., שרירים לסת). כדי לקיים את ההרדמה, להמשיך את יישום isoflurane באמצעות צינור שמונח על האף של העכבר (2% isoflurane באוויר, זרימת 1 ליטר / דקת שיעור). על מנת למנוע drynes העיןים, להשתמש במשחת וטרינר בעכברים מורדמים.
  3. להזריק חומר ניגוד, לתקן את העכבר הרדים על כרית חימום באמצעות קלטת. מניחים (מחט מזרק המצורפת לצינור) צנתר לוריד הזנב ולהזריק את חומר ניגוד הניאון (למשל, 2 nmol, עם הזרקה מקסימאלי כלומר נפח של 5 מיליליטר / קילוגרם משקל גוף,, 150 μl לעכבר 30 גרם).
  4. לסריקת עכבר שעיר, אזור הסריקה צריך להיות מקולף מראש. לשם כך, השתמש בקרם להסרת שיער גילוח או. כמה זנים של עכברים יכולים לפתח פריחות מהקרם להסרת שיער. לכן, לפקח על העכברים לשינויים בעור וליצור קשר עם צוות וטרינרים לטיפול במידת הצורך. כמו כן לבדוק את הסובלנות על מספר קטן של בעלי חיים בעת שימוש בזני עכבר חדשים.
  5. שמור את העכבר מורדם במהלך μCT וההדמיה FMT (2% isoflurane באוויר, זרימת 1 ליטר / דקת שיעור).

3. מיטת עכבר הכנה

הערה: לסריקת μCT-FMT, להשתמש multimodalמיטת עכבר, שמתאימה גם לμCT וFMT.

  1. לפני ההדמיה, לנקות את המיטה עם עכבר רקמות רטובות. אין להשתמש באתנול כי זה עלול לגרום נזק לזכוכית אקריליק. ודא כי הסמנים חופשיים של מים, כי זה עלול לפגוע בזיהוי הסמן האוטומטי.
  2. פתח את הברגים של מיטת עכבר multimodal ולהסיר את החלק העליון.
  3. צרף את צינור גז ההרדמה על מיטת העכבר ולקבע אותו עם קלטת.
  4. מניחים את העכבר בהרדמה לתוך מיטת העכבר ולשים את האף לתוך צינור הגז. ודא הראש של העכבר הוא במדד מול מיטת העכבר (איור 1).
  5. ודא שהעכבר הוא באמצע מיטת העכבר להשתמש בצורה אופטימלית את שדה ראיה של FMT.
  6. סגור את מיטת העכבר ולהדק את הברגים עד העכבר מוחזק בחוזקה. ודא העכבר יכול לנשום בעקביות על ידי ניטור חזותי של תנועות נשימת בית חזה.

4. μCT אניmaging

הערה: סריקה של כל הגוף מתבצעת באמצעות μCT. נתונים אנטומיים נוצרו נדרש להיתוך תמונה, לשחזור הקרינה משופר ולניתוח תמונה.

  1. מניחים את מיטת העכבר עם העכבר לμCT. ודא שהעכבר ממוקם באופן שזה הולך "זנב-ראשון" לμCT. זה חשוב לאיחוי האוטומטי.
  2. על מנת לשמור על הרדמה כאשר μCT-המכסה סגור, חבר מחדש את הצינורות לתעל את הגז דרך המקרה של μCT. הראשון לנתק את הצינור הארוך מהמיטה העכבר ולצרף אותו למחבר בצד החיצוני של μCT. לאחר מכן לצרף את הקצה החופשי שנותר למחבר בתוך μCT.
  3. כונן את מיטת העכבר לμCT. ודא שצינור הגז אינו רופף ולא יכול להיתפס על ידי gantry מסתובב. במידת צורך, לקבע אותו עם קלטת. הכנס את הצינור לתוך החתך של בעל מיטת העכבר. סגור את μCT ולרכוש topogram. בחר לפחות שתי subscans כדי לכסות חלק ניכר מהעכבר ועכבר המיטה, וזה חשוב לאיחוי והשחזור.
  4. בחר את פרוטוקול μCT הסריקה בשם HQD-6565-360-90, שרוכש 720 תחזיות עם 1,032 x 1,012 פיקסלים במהלך סיבוב מלא אחד דורש זמן סריקה של 90 שניות לsubscan. צינורות מופעלים במתח 65 קילו וולט ואמפר 1.0 הנוכחי. לחלופין, לצמצם את משך מינון הקרינה וסריקה, בחר את פרוטוקול סריקת SQD-6565-360-29 שרוכשים 720 תחזיות עם 516 x 506 פיקסלים עם זמן סריקה 29 של לsubscan.
  5. התחל את סריקת μCT. בר הכחול מציין את ההתקדמות. Subscans תירכש לאחר מכן. היפותרמיה ואובדן נוזלים הם לא בעיה, כי משך הסריקה הקצר של דקות ספורות בלבד. אל תפתח את המכסה של μCT במהלך הסריקה כי זה באופן אוטומטי להפסיק את הסריקה כדי להגן על המשתמש מקרינה.
  6. כאשר הסריקה הושלמה, לפתוח את המכסה, חבר מחדש את צינור ההרדמה ולנתק את מיטת עכבר מבעל להעביר אותו לFMT.

5. FMT הדמיה

הערה: מייד לאחר סריקת μCT, העכבר נסרק בFMT בשתי תצורות (והפוך), המשמשות יחד לשחזור הקרינה משופר.

  1. הפעל את אספקת גז ההרדמה (2% isoflurane באוויר, זרימת 1 ליטר / דקת שיעור) לFMT לפני הצבת מיטת העכבר לFMT. שימוש בתוכנת שליטת FMT, ליצור קבוצת מחקר עם מספר מתאים של נושאים (כלומר, עכברים). בחר את הבדיקות שישמשו להדמיה (OsteoSense שימוש לבדיקות רומן שאינם רשומות).
  2. לשאת את מיטת עכבר multimodal עם העכבר כדי FMT. צינור גז הרדמה הארוכה גמיש שומר על זרימת הגז. לפני הכנסת מיטת העכבר לFMT, להסיר בזהירות את הצינור שכןאין צורך בתוך FMT. להימנע מלהפוך את הברגים של מיטת העכבר.
  3. מניחים את מיטת העכבר לFMT עם החיווי האדום הראשונה ("ראש-הראשון"). זה חשוב להיתוך התמונה להיות עקבי עם μCT.
  4. סגור את FMT.
  5. בחר את קבוצת הלימוד הנכונה והנושא. בחר את הערוץ המבוקש לFMT (לOsteoSense 750EX, להשתמש בערוץ 750 ננומטר).
  6. להוסיף תיאור, למשל., "למעלה" או "למטה" ולרכוש סריקת סקירה על ידי לחיצה על "לכידה". זה לוכד תמונת החזרה של כל שדה הראייה. ודא שלא צריך "תמונות החזרה רק" נבחרו, משום שאחרת לא ניתן לרכוש 3D סורק לאחר מכן.
  7. להתאים את הפרמטרים הדמיה לסריקת 3D. הגדלת שדה הראייה לכלול ככל האפשר של העכבר. בדרך כלל, הראש והזנב לא לגמרי משתלבים בשדה הראייה, עם זאת. לחץ על "מתקדם221; ולבדוק את הגדרות ההדמיה. צפיפות שנקבעה דגימה עד 3 מ"מ, רגישות למינימום / מקסימום נורמלי ותאורה 5000 ו50000, בהתאמה.
  8. לחץ על "הוסף לתור שיקום" ולאחר מכן לחץ על "סריקה" כדי להתחיל בסריקת FMT. זה ייקח בערך 5 עד 15 דקות, תלוי בגודל ובעובי של העכבר, כי זמני חשיפה ארוכים יותר נדרשים לאובייקטים עבים יותר. המכשיר מכיל חדר הדמיה מחומם כדי למנוע היפותרמיה.
  9. לאחר הסריקה, להעיף את מיטת העכבר כולל העכבר הפוך ולרכוש סריקה אחרת. זה מספק נתונים נוספים על שחזור הקרינה.
  10. כאשר μCT וFMT-הסריקות הושלמו והעכבר מתעורר מההרדמה, לא להשאיר אותו ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת, למשל, להסתובב או לשמור כיבה sternal.

6. תמונת היתוך ושיקום

הערה: לאחרהשלמת סריקת μCT-FMT, למשל, בסוף המחקר, נתונים שנרכשו צריכה להיות מסודרות כדי לאפשר היתוך תמונה האוטומטית ושחזור הקרינה.

  1. כדי למיין את הסריקות לעיבוד נוסף, ליצור תיקייה למחקר. עבור כל סריקת μCT-FMT, ליצור תיקיית משנה אחת ששמה מכיל את מזהה העכבר ונקודת הזמן, למשל., M01_02h.
  2. לכל μCT-FMT לסרוק, לייצא סריקות FMT (למעלה ולמטה) כ.fmt קבצים ולשמור אותם לתיקיית המשנה באמצעות שמות קבצים המסתיימים ב- "_up.fmt" או "_down.fmt". כל קובץ .fmt מכיל את נתוני גלם שנרכשו, כלומר, תמונות עירור ופליטה נרכשו על ידי המצלמה, מטה, כגון זמני חשיפה, ושחזור הקרינה שנוצר על ידי FMT.
  3. שימוש בתוכנת μCT, ליצור שחזור עם גודל voxel איזוטרופיים 35 מיקרומטר. בחר ליבה חלקה שיקום (T10). התאם את שדה הראייה כךשכל מיטת העכבר כוללים הסמנים מכוסים. בחר MIFX / פלט בפורמט RAW וכלהתחיל מחדש. לאחר השחזור נעשה, להעביר את קבצי שחזור μCT לתיקיית המשנה של סריקת μCT-FMT.
  4. לייצא את נתוני μCT וFMT לכל הסריקות. ודא שכל תת-תיקייה מכילה שני קבצי .fmt (למעלה ולמטה) ושחזור μCT ב/ פורמט RAW MIFX. כדי לבדוק לשלמות בחר תפריט> CT-FMT-> בדוק שלמות באמצעות תוכנת Imalytics פרה-הקלינית. רשימה של טעויות עשויה להופיע, כגון חסר .fmt קבצים או שחזורי μCT. לתקן את השגיאות ולבדוק לשלמות עד שכל השגיאות.
  5. שימוש ב> הגדרות CT-FMT-> תפריט התחל-, בדוק את שם השרת של תוכנת Definiens ולהתאים במידת צורך. ברירת המחדל הוא http: // localhost: 8184, בהנחת שתוכנת Definiens מותקנת באותו המחשב. תוכנת Definiens נדרשת בשלב הבא לבצע auפילוח tomated המיטה העכבר והסמנים.
  6. לחץ> קבוצת נתיך תפריט התחל- CT-FMT-> בתוכנת Imalytics פרה-הקלינית לבצע היתוך μCT-FMT אוטומטי לכל המחקר. זה לוקח כמה דקות לμCT-FMT לסרוק ותוצאות בתיקייה עם סיומת מקבילה "חבילה" לתיקיית המחקר. זה מכיל תת-קבוצה קטנה יותר של קבצים (נתונים μCT ושיקום FMT סופק על-ידי ספק התמזגו), שהם רלוונטיים לניתוח נוסף.
  7. לחץ> קבוצת התפריט התחל- CT-FMT-> לשחזר (FMT) בתוכנת Imalytics פרה-הקלינית לביצוע שחזור הקרינה כולל את הדור של קליטה ופיזור מפות 13. למרות שהעיבוד הוא 20 מואץ של GPU, כל שחזור דורש 1-4 שעות, תלוי בגודל של העכבר. התוצאות תישמר בתיקיית החבילה. הערה: כדי לאפשר תפוקה גבוהה יותר, אנו מבצעים כיום שחזורים אלה באשכול GPU עם 56 GPUs.

    ניתוח 7. תמונה

    הערה: כדי לחלץ מדידות כמותיות מנתוני התמונה, נדרש פילוח של נגעים ואיברים.

    1. ברגע שכל נתוני סטים הם התמזגו ומשוחזרים, ליצור פילוח לכל μCT-FMT סריקה באמצעות תוכנת Imalytics פרה-הקלינית.
    2. לטעון קובץ μCT כיסוד ואת קובץ הקרינה ככיסוי. "3D" לחץ כדי להפעיל את נפח טיוח ולבדוק את מערכת הנתונים.
    3. למגזר הריאות, לחץ תפריט> Classes-> להוסיף בכיתה וליצור מחלקה בשם "tmp". זה יכול להיעשות גם דרך תפריט ההקשר. יצירת מעמד חדש מגדירה באופן אוטומטי אותו כמעמד פלט לפעילות הפילוח הבא.
      1. לבצע פעולת thresholding למגזר כל האזורים בעוצמה נמוכה בערכת נתוני μCT (לחץ תפריט> Segmentation-> Thresholding-> להלן והזן 600). עכשיו כיתת tmp מכילה האוויר מחוץ למולהשתמש, אלא גם את רקמת הריאה.
      2. ליצור מעמד "ריאות". לבצע פעולה "מלא אזור" (לחץ לחיצה ימנית לתוך הריאות ובחר תפריט> מלא אזור-> מלא אזור בלתי מוגבלת), להפריד את הריאות מהאוויר החיצוני.
      3. מחק את מעמד tmp כי זה לא נחוץ יותר.
    4. לאזורי קטע קמורים, למשל., שלפוחית ​​השתן, להשתמש במצב הקשקוש. ראשון ליצור "שלפוחית ​​השתן" בכיתה.
      1. לחץ על F1 כדי למחוק את כל הקשקושים.
      2. שימוש בעכבר המחשב, לצייר שרבוטים להתוות את הגבולות של שלפוחית ​​השתן.
      3. לחץ F3 כדי למלא את האזור מוקף שרבוטים עם מסכה זמנית שמופיעה ככיסוי אדום. Iteratively להוסיף עוד קשקושים (בכיוון כלשהו חיתוך) ולחץ על F3 עד דיוק מספיק מושגת. בדרך כלל, שרבוטים ב 10 פרוסות מספיקים.
      4. לחץ F4 כדי לאחסן את המסכה הזמנית "שלפוחית ​​השתן".
      5. להמשיך ככה למגזראזורים קמורים אחרים כגון לב וכליות. אזורים רבים, למשל., הקיבה או הכבד, יכולים להיות מקורב על ידי כמה אזורים קמורים.
    5. למגזר עמוד השדרה, ליצור מעמד "עצם" ראשון.
      1. בחר ContextMenu-> Thresholding-> מעל לביצוע פעולת thresholding לסווג את כל voxels הבהיר (למשל., מעל 1,600) כמו "עצם".
      2. פעולת מילוי האזור תיכשל למגזר עמוד השדרה כי הוא מחובר עם חלקים רבים אחרים של השלד, לדוגמא., הצלעות. לבצע כמה פעולות חיתוך על ידי iteratively ציור שרבוטים ולחיצה על F2 כדי להפריד את עמוד השדרה מהגולגולת, הצלעות, ועצם עצם העצה.
      3. לבסוף, ליצור מעמד "שדרה" ולבצע פעולת מילוי אזור כדי לקבל את עמוד השדרה (לחץ לחיצה ימנית בעמוד השדרה ובחר ContextMenu-> מלא אזור-> מלא אזור בלתי מוגבל).
    6. שמור את הפילוח כקובץ בתוך התת-תיקייה דואר של סריקת μCT-FMT. השתמש בשם עקבי, למשל, organs.seg, כדי לאפשר העיבוד אצווה.
    7. בחר תפריט> Statistics-> מחלקת סטטיסטיקה (כיסוי), כדי ליצור גיליון אלקטרוני המכיל את עוצמת הקרינה הממוצעת, נפח וכמות הכוללת (המוצר של ממוצע ונפח) לכל כיתה.
    8. כדי ליצור גיליון אלקטרוני יחיד המכיל את הערכים לכל האזורים של כל סריקות μCT-FMT, לחץ תפריט> הגדרות אצווה הוגדר Batch-> ולאחר מכן לחץ על תפריט> Batch-> סטטיסטיקה אצווה. זה ימנע את המאמץ של יצירת ומיזוג קבצים של גיליונות אלקטרוניים רבים, כלומר, אחד לכל סריקת μCT-FMT.

    8. בדיקה כיול

    1. כדי לחשב את גורם הכיול לבדיקה, סריקות פנטום μCT-FMT מרובים עם סכומים ידועים שונים של הבדיקה נדרשים (ראו שלב 1.4), למשל., עם 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol ו0 pmol.
    2. סרוק את רוחות הרפאים כפי שתואר בסעיפים 4 ו 5. גם לסריקות פנטום, למעלה ולמטה סריקות בFMT נדרשים.
    3. לייצא את הנתונים ולבצע היתוך ושיקום כאמור בסעיף 6.
    4. מגזר ההכללה באמצעות נתונים μCT עבור כל סריקה על ידי thresholding (מעל 1,200) ומילוי אזור.
    5. צור גיליון אלקטרוני עם כמויות הקרינה שנמדדו ולתכנן אותם כפונקציה של הסכומים הידועים. לחשב את השיפוע של יניארי בכושר רגרסיה. זהו גורם הכיול לבדיקה.

Representative Results

אנחנו מוחלים פרוטוקול המתואר להעריך biodistribution של בדיקה, OsteoSense ממוקד, אשר נקשר לhydroxyapatite. 3 עכברים (C57BL / 6 APOE - / - Ahsg - / - עכברי כפולים נוקאאוט, 10 שבועות) הם צילמו לפני 15 דקות ו, 2 שעות, 4 שעות, 6 שעות, 24 שעות ולאחר הזרקת IV של 2 OsteoSense nmol. התוכנה שלנו מזוהה באופן אוטומטי הסמנים מובנים בתוך מיטת עכבר multimodal (איור 1, איור 2 א, ב), שאיפשר שילוב של נתונים אנטומיים μCT עם שחזור הקרינה שבוצע על ידי FMT (איור 2 ג, ד). מאז OsteoSense היא בדיקה עם משקל מולקולרי נמוך, הפרשת כליות מהירה ולכן אות גבוהה בשלפוחית ​​השתן צפוי. שילוב של שחזור הקרינה של FMT חשף בעיות כגון אות איבדה מחוץ לשלפוחית ​​השתן (איור 2 ג, ד). בעיות אלה מתרחשות עקב FMT לא יודע את הצורה האמיתית של העכבר ומניח צורת בלוק. Ouשחזור r קובע את הצורה מדויקת מנתוני μCT ויוצר פיזור וקליטה מפות 13 על מנת לאפשר שחזור הקרינה מדויק יותר עם ​​לוקליזציה אות טובה יותר, וזה בולט במיוחד לשלפוחית ​​השתן (איור 2E, F).

כדי להקצות את הקרינה המשוחזרת לאזורים מתאימים, אנחנו אינטראקטיבי מפולחים כמה איברים באמצעות התוכנה שלנו (איור 3). לכל אחת מהסריקות 18, 7 אזורים היו מפולחים על בסיס נתוני μCT, כלומר., לב, ריאות, כבד, כליות, עמוד השדרה, מעי ושלפוחית ​​שתן. בהמשך לכך, התוכנה שימשה לחישוב ריכוז הקרינה הממוצע לכל אחד מהאזורים 126. למרבה המזל, התוכנה מספקת במצב אצווה, שמחשב את כל הערכים ושומר אותם בגיליון אלקטרוני יחיד.

כדי להמחיש את הפצת הקרינה, הדמיות 3D נוצרו עבור כל נקודת זמן,באמצעות הגדרת חלונאית דומה (איור 4 א-ו). שימוש בערכי האיבר לכמת, biodistribution חושבו על ידי ממוצע ערכי איברים בשלושה העכברים (איור 4G). הסריקות מראש, שנרכשו לפני ההזרקה, הראו אות רקע זניחה. 15 דקות לאחר ההזרקה, האות החזק ביותר הופיע בשלפוחית ​​השתן, בגלל הפרשת הכליות מהירה. בנקודות הזמן שלאחר מכן, הבדיקה שנותרה הצטברה בעצמות ומפרקים.

איור 1
איור 1. מיטת מולטימודליות עכבר. () מיטת עכבר multimodal מכיל שני לוחות זכוכית אקריליק שחוזקה להחזיק את העכבר. ההידוק מותאם באמצעות שני ברגים. מיטת העכבר מכילה סמנים (חורים ריקים) להיתוך תמונה. גז הרדמה מסופק באמצעות צינור גמיש המקובע עם tקוף. מיטת העכבר (ב) מחוברת למחזיק מתכת ונערכה במרכז gantry μCT מסתובב. (ג) להימנע מפער בין מיטת עכבר ובעל המתכת, כי אחר, הסמנים ניתן להקצות באופן שגוי שהובילו להיתוך שגוי. צינור גז ההרדמה צריך להיות מחובר למחבר הצינור. (ד) מיטת העכבר צריכה להיות מוכנס לתוך FMT עם החזית הראשונה כדי לאפשר איחוי אוטומטי נכון. (ה) הסמנים גלויים למצלמה FMT, המשמשת לגילוי הסמן האוטומטי וההיתוך. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
(A, B) מסומן איור 2. תמונת היתוך ושיקום. ואת הצורה החיצונית של mouse נקבעים על ידי אלגוריתם הפילוח האוטומטי. (C, D) 15 דקות לאחר ההזרקה של OsteoSense, כמות ניכרת של החללית כבר מופרשת לתוך שלפוחית ​​השתן. לאחר פיוזינג השחזור סופק על-ידי ספק עם נתוני μCT, הבעיות להיות גלויות. רוב האות מופיע מסביב לשלפוחית ​​השתן, אך לא בתוך שלפוחית ​​השתן וחלק האות אפילו מופיעה באוויר. זה קורה כי FMT מניח עכבר בצורת בלוק. (E, F) שחזור הקרינה המשופר שלנו, תוך שימוש בצורה של העכבר נגזר מנתוני μCT, תוצאות בלוקליזציה טובה יותר של הקרינה בתוך שלפוחית ​​השתן. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. האינטראקטיבי האיברים Segmentat . יון () כדי לכמת את הפצת הקרינה, כמה איברים מפולחים: לב (אדום), ריאה (ורוד), כבד (חום), בטן (בז '), עמוד השדרה (סגולה), כליות (צהובות), מעי (ירוק) , ושלפוחית ​​שתן (זהב). (ב) הריאות, אשר מאוד בניגוד לעומת הרקמה הסובבת, היא מפולחות באמצעות thresholding ומילוי אזור. איברים (ג) עגולים, כגון שלפוחית ​​השתן, כליות, לב ומפולחים באמצעות "קשקושים". איברים (ד ') עם צורה מורכבת יותר, למשל, כבד וקיבה מפולחים באופן הדרגתי באמצעות שרבוטים. למגזר עמוד השדרה, סף גבוה מוחל על קטע כל העצמות. אז כמה עצמות, למשל., הצלעות, נחתכות משם, עד שעמוד השדרה נשארה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בתוך עמודים = "תמיד"> איור 4
איור 4. biodistribution. כדי להעריך את biodistribution, העכברים נסרקים במספר נקודות זמן (AF). (א) הסריקה מראש, לפני הזריקה, תערוכות אות רקע מעט בערוץ 750 ננומטר. (ב) 15 דקות לאחר הזרקה, כמות ניכרת של החללית כבר בשלפוחית ​​השתן. (ג) בנקודת הזמן 2 שעות, העכבר השתין, וכתוצאה מכך חלק הקרינה מחוץ לעכבר. בנקודות זמן מאוחר יותר (DF), האות מופיעה בעיקר בעצמות ובמפרקים, כלומר., בעמוד השדרה והברכיים. (G) ריכוז הקרינה לכמת מוצג לאיברים שנבחרו.

Discussion

אנו מתארים וליישם פרוטוקול הדמיה μCT-FMT multimodal. אנו משתמשים בFMT זמין מסחרי ושימוש נרחב והתקני μCT 3,11,15 - 17,21. בעוד הפרוטוקול מחייב FMT ספציפי, יכול להיות מוחלף על ידי μCT μCT אחר עם פונקציונליות דומה ופרמטרי סריקת השוואה, למשל, שדה הראייה צריך להיות גדול מספיק כדי לכסות את מיטת העכבר כולל הסמנים.

FMT כבר בשימוש לניתוח biodistribution ללא שילוב עם μCT או MRI 21, לעומת זאת, נתונים אנטומיים מועיל להגדיל את שחזור כי הפילוח יכול להיות מבוסס על גבולות האיבר שנראים בנתונים μCT 10. בעוד מכשירי μCT-FMT משולבים פותחו 2,7, אלה אינם זמינים באופן מסחרי עדיין. יתר על כן, השימוש בשני מכשירים נפרדים מאפשרת צנרת, כלומר., CA העכבר הבאn הדמיה בμCT בעוד העכבר הראשון הוא עדיין בFMT, כדי להגדיל את התפוקה.

כדי להפחית את עומס העבודה הידנית, אנו מבצעים איתור סמן אוטומטי והיתוך. יתר על כן, את צורת העכבר מפולח באופן אוטומטי ומידע זה באופן משמעותי משפר את 11,13,22 שחזור הקרינה. לשחזור הקרינה כמותי, יש צורך במפות קליטה ופיזור 13,23. אנו שואבים את מפת הפיזור על ידי פילוח האוטומטי של נתונים μCT והקצאת מקדמי פיזור ידועים של כמה סוגי רקמות (ריאות, עצמות, עור, שומן, ונותרו רקמות רכות) 24. בהמשך לכך, אנחנו לשחזר מפת קליטה מהנתונים הגולמיים האופטיים אשר חשוב במיוחד עבור איברי perfused היטב כמו הלב והכבד 13,20.

סריקה כמה עכברים בנקודות זמן מרובים תוצאות במהירות במספר רב של ערכות נתונים כדי להיות מנותחת. לbiodisמחקרי tribution, כמה איברים צריכים להיות מפולחים לכל סריקת μCT-FMT. למרבה הצער, לא ניתן לעשות שימוש חוזר בפילוחים, כי העכבר הוא מיקומו חדש למיטת העכבר שוב ושוב. אנו משתמשים בכלי לפילוח אינטראקטיבי, שפותח במכון שלנו, לעומת זאת, כלים אחרים יכולים להיות גם מתאימים 25. אנו מייצרים פילוחי voxel-חכם, כי אלה שיתאימו יותר לאיברים מורכבים מצורות פשוטות כמו אליפסות וקוביות 26. פילוח כל-חיה אוטומטית יהיה שימושי כדי להפחית את עומס העבודה הידני 27 נוסף, אבל כלי פילוח אינטראקטיבי עדיין יידרש לתקן את שגיאות פילוח. יתר על כן, כלים פילוח אוטומטיים בקושי יכולים לצפות מקרים מיוחדים כגון פתולוגיות בצורה נכונה. מכיוון שאנו משתמשים בסריקות μCT ילידים, כמה איברים כמו הטחול הם קשים מאוד למגזר גם באופן ידני. סוכנים בניגוד יעזרו, אבל יש בעיות עם סבילות וקשה maintaiהפצת חומר ניגוד היציב na ברחבי ההדמיה האורך.

המחקר שלנו מראה כי פנטום לוקליזציה האות משופרת בעת שימוש במידע בצורה לשיקום הקרינה. בvivo, שיפור דומה ניכר לנקודת הזמן המוקדם (15 דקות לאחר הזרקה), כאשר כמות גדולה של החללית כבר ב שלפוחית ​​שתן. הבדיקה מחייב hydroxyapatite מצטברת בעצמות ומפרקים. זה מדהים כמה מהר זה קורה, כלומר, האות היא כבר נראה בבירור בעמוד השדרה 15 דקות לאחר הזרקה. כנראה זו נגרמת על ידי המשקל המולקולרי הנמוך של הבדיקה, המאפשרת extravasation ודיפוזיה מהירים לאזורי היעד. הבדיקה נקשר קוולנטית לhydroxyapatite היעד שלה והבדיקה מאוגד מופרשת. לנקודות הזמן מאוחר יותר, בין 6 שעות ו -24 שעות לאחר הזרקה, עוצמת האות בעמוד השדרה נותרת יציבה יחסית, כנראה, משום שכמעט ולא מחדש אורכאבים עמוקים לתוך העכבר כדי להלבין את הקרינה. לצורך המחקר שלנו, השתמשנו בערוץ 750 ננומטר, מה שגורם הקרינה רקע נמוכה ניכרה כלסריקות שנרכשו לפני ההזרקה. באורכי גל נמוכים, ניתן לצפות יותר אות רקע 28.

לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול הדמיה multimodal למכשירי FMT וμCT זמינים מסחרי. אנו מראים כי השילוב מספק יתרונות לשיקום הקרינה. אנו מדגימים כיצד עקומות biodistribution מופקים מהכמות הגדולה של נתוני תמונה באמצעות פילוח איבר אינטראקטיבי ועיבוד אצווה. אנו מאמינים כי עבודה סטנדרטית זה יכול להיות מועיל לפיתוח תרופות ובדיקות הדמיה אחרת באמצעות בדיקות שכותרתו fluorescently.

Disclosures

פליקס Gremse הוא מייסד והבעלים של Gremse-IT, חברת סטארט-אפ שמציעה תוכנות ושירותים לניתוח תמונה רפואית בשיתוף פעולה עם פיליפס והמחלקה לניסויית הדמיה מולקולרית של האוניברסיטה אאכן RWTH.

Acknowledgments

אנו מודים למארק ויילר לביצוע ניסויי הפנטום. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה האירופית למחקר (ERC גרנט החל 309,495: NeoNaNo), המדינה הפדרלית הגרמנית של נורדריין וסטפליה (NRW; High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (EFRE); ForSaTum), גרמנית מחקר של משרד לחינוך ומחקר (BMBF) (כבד תוכניות מימון וירטואלי (0,315,743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), האוניברסיטה אאכן RWTH (אני 3 קרן זרע TM), ופיליפס (אאכן, גרמניה).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX PerkinElmer FMT2000 Device for fluorescence molecular tomography
µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo CT Imaging GmbH Tomoscope Duo Device for micro computed tomography
Multimodal Mouse Bed CT Imaging GmbH Experimental builder Partially transparent animal holder
IsoFlo (isoflurane, USP) Abbott 05260-05 Isoflurane Inhalation anesthesia
Small animal anesthesia system Harvard apparatus 726419 Complete Isoflurane Table-Top System
Chlorophyll-free mouse food Ssniff E15051 low chlorophyll / low fluorescence food
OsteoSense 750EX PerkinElmer NEV10053EX Animal FMT contrast agent
Portex Fine Bore Polythene Tubing Smith medical 800/100/120 Tube for injection catheter
Sterican 30g BBraun 4656300 Hypodermic needle for catheter
Imeron Altana pharma INLA F.1/0203/3.5337.69 CT contrast agent for the phantom inclusions
Agarose Sigma 90-12-36-6 Agarose for phantom production
TiO2 Applichem A1900,1000 Titanium oxyde as phantom scattering agent
Trypan blue Fluka 93595 Trypan blue to adjust phantom light propagation
Cy7 Lumiprobe 15020 Fluorochrome for the phantom inclusions
Lipovenoes 20% Fresenius Kabi 3094740 Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents
Definiens Developer XD Server Definiens AG Server XD Software platform for automated segmentation
Imalytics Preclinical ExMI/Gremse-IT Version 2.0.1 Software for image fusion, reconstruction and analysis
NVIDIA Geforce Titan Asus GTXTITAN6GD5 High end computer graphics card, 6GB Memory

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, R. M., Yang, M. Subcellular imaging in the live mouse. Nature Protocols. 1 (2), 775-782 (2006).
  2. Ale, A., Ermolayev, V., Herzog, E., Cohrs, C., Angelis, M. H., Ntziachristos, V. FMT-XCT: in vivo animal studies with hybrid fluorescence molecular tomography-X-ray computed tomography. Nature Methods. 9 (9), 615-620 (2012).
  3. Eaton, V. L., Vasquez, K. O., Goings, G. E., Hunter, Z. N., Peterson, J. D., Miller, S. D. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. Journal of Neuroinflammation. 10 (138), (2013).
  4. Lederle, W., Arns, S., et al. Failure of annexin-based apoptosis imaging in the assessment of antiangiogenic therapy effects. EJNMMI Research. 1 (26), (2011).
  5. Ntziachristos, V., Tung, C. -H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nature Medicine. 8 (7), (2002).
  6. Hoffman, R. M. The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nature Reviews Cancer. 5 (10), 796-806 (2005).
  7. Schulz, R. B., Ale, A., et al. Hybrid system for simultaneous fluorescence and x-ray computed tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29 (2), 465-473 (2010).
  8. Stuker, F., Baltes, C., et al. Hybrid small animal imaging system combining magnetic resonance imaging with fluorescence tomography using single photon avalanche diode detectors. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (6), 1265-1273 (2011).
  9. Leblond, F., Davis, S. C., Valdés, P. A., Pogue, B. W. Preclinical Whole-body Fluorescence Imaging: Review of Instruments, Methods and Applications. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 98 (1), 77-94 (2010).
  10. Kunjachan, S., Gremse, F., et al. Noninvasive optical imaging of nanomedicine biodistribution. ACS Nano. 7 (1), 252-262 (2013).
  11. Radrich, K., Ale, A., Ermolayev, V., Ntziachristos, V. Improving limited-projection-angle fluorescence molecular tomography using a co-registered x-ray computed tomography scan. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126011 (2012).
  12. Freyer, M., Ale, A., Schulz, R. B., Zientkowska, M., Ntziachristos, V., Englmeier, K. -H. Fast automatic segmentation of anatomical structures in x-ray computed tomography images to improve fluorescence molecular tomography reconstruction. Journal of Biomedical Optics. 15 (3), 036006 (2010).
  13. Gremse, F., Theek, B., et al. Absorption Reconstruction Improves Biodistribution Assessment of Fluorescent Nanoprobes Using Hybrid Fluorescence-mediated Tomography. Theranostics. 4 (10), 960-971 (2014).
  14. Cheong, W. -F., Prahl, S. A., Welch, A. J. A review of the optical properties of biological tissues. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2166-2185 (1990).
  15. Doleschel, D., Mundigl, O., et al. Targeted near-infrared imaging of the erythropoietin receptor in human lung cancer xenografts. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 53 (2), 304-311 (2012).
  16. Al Rawashdeh, W., Arns, S., et al. Optical tomography of MMP-activity allows a sensitive non-invasive characterization of the invasiveness and angiogenesis of SCC-xenografts. Neoplasia. 16 (3), 235-246 (2014).
  17. Kunjachan, S., Pola, R., et al. Passive versus Active Tumor Targeting Using RGD- and NGR-Modified Polymeric Nanomedicines. Nano Letters. 14 (2), 972-981 (2014).
  18. Schober, A., Nazari-Jahantigh, M., et al. MicroRNA-126-5p promotes endothelial proliferation and limits atherosclerosis by suppressing Dlk1. Nature Medicine. 20 (4), 368-376 (2014).
  19. Aikawa, E., Nahrendorf, M., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
  20. Gremse, F., Höfter, A., Schwen, L., Kiessling, F., Naumann, U. GPU-Accelerated Sparse Matrix-Matrix Multiplication by Iterative Row Merging. SIAM Journal on Scientific Computing. , C54-C71 (2015).
  21. Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. Quantitative Whole Body Biodistribution of Fluorescent-Labeled Agents by Non-Invasive Tomographic Imaging. PLoS ONE. 6 (6), e20594 (2011).
  22. Theek, B., Gremse, F., et al. Characterizing EPR-mediated passive drug targeting using contrast-enhanced functional ultrasound imaging. Journal of Controlled Release. 182 (1), 83-89 (2014).
  23. Hyde, D., Schulz, R., Brooks, D., Miller, E., Ntziachristos, V. Performance dependence of hybrid x-ray computed tomography/fluorescence molecular tomography on the optical forward problem. Journal of the Optical Society of America. A, Optics, Image Science, and Vision. 26 (4), 919-923 (2009).
  24. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37 (2013).
  25. Loening, A. M., Gambhir, S. S. AMIDE: a free software tool for multimodality medical image analysis. Molecular Imaging. 2 (3), 131-137 (2003).
  26. Gremse, F., Schulz, V. Qualitative and Quantitative Data Analysis. Small Animal Imaging. , 363-378 (2011).
  27. Baiker, M., Milles, J., et al. Atlas-based whole-body segmentation of mice from low-contrast Micro-CT data. Medical Image Analysis. 14 (6), 723-737 (2010).
  28. Sevick-Muraca, E. M., Rasmussen, J. C. Molecular imaging with optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine. Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041303 (2008).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 100 טומוגרפיה תיווך הקרינה טומוגרפיה ממוחשבת פילוח תמונה מולטימודליות הדמיה ניתוח תמונה הדמיה היברידית biodistribution המפוזרת האופטי טומוגרפיה
הדמיה μCT-FMT היברידי וניתוח תמונה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gremse, F., Doleschel, D., Zafarnia, … More

Gremse, F., Doleschel, D., Zafarnia, S., Babler, A., Jahnen-Dechent, W., Lammers, T., Lederle, W., Kiessling, F. Hybrid µCT-FMT imaging and image analysis. J. Vis. Exp. (100), e52770, doi:10.3791/52770 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter