Abstract
Fluorescens-mediert tomografi (FMT) muliggjør langsgående og kvantitativ bestemmelse av fordelingen fluorescens in vivo, og kan brukes til å vurdere biofordelingen av nye prober og for å vurdere sykdomsutviklingen ved bruk av etablerte molekylære prober eller rapportørgener. Kombinasjonen med en anatomisk modalitet, f.eks, micro computertomografi (μCT), er gunstig for bildeanalyse og for fluorescens gjenoppbygging. Vi beskriver en protokoll for multimodal μCT-FMT bildebehandling inkludert bildebehandlings nødvendige skritt for å trekke kvantitative målinger. Etter utarbeidelse av mus og utfører bildebehandling, er multimodale datasett registrert. Deretter blir en forbedret fluorescens rekonstruksjon utført, noe som tar hensyn til formen på mus. For kvantitativ analyse, er organ segmentations generert basert på de anatomiske data ved hjelp av vårt interaktive segmenteringsverktøy. Til slutt, biofordelingen cukurvene under genereres ved hjelp av en batch-prosessering funksjon. Vi viser anvendelsen av fremgangsmåten ved å vurdere biofordelingen av en velkjent probe som binder seg til ben og ledd.
Introduction
Fluorescens-mediert tomografi, også kalt fluorescens molekyl tomografi (FMT), er en lovende metode for kvantitativt å vurdere fordelingen fluorescens i diffuse vev, slik som bedøvede mus eller menneskelige kroppsvev, f.eks bryster eller fingerledd. I motsetning til ikke-invasive mikroskopi teknikker, som tillater avbildning av overfladiske mål på subcellulære oppløsning 1 lar FMT tredimensjonal rekonstruksjon av fluorescerende kilder i dypet av flere centimeter, men med lavere oppløsning 2. Mange målrettet fluorescerende prober er tilgjengelig for bilde angiogenese, apoptose, inflammasjon og andre 2-5. Noen prober er aktiverbart, f.eks., Ved spesifikk enzymspaltningssete fører til unquenching av fluorokromer. Videre kan reporter gener uttrykker fluorescerende proteiner avbildes, for eksempel for å spore svulst celle migrasjon 6.
FMT sterkt drar nytte av kombinasjonen med en anatomisk modalitet, f.eks μCT 2,7 eller MR 8. Mens frittstående FMT enheter er kommersielt tilgjengelige 9, fluorescens bildene er vanskelige å tolke uten anatomisk referanseinformasjon. Nylig var vi i stand til å vise at de fusjonerte anatomiske bildedata muliggjør en mer robust analyse 10. De anatomiske data kan også benyttes til å tilveiebringe tidligere kunnskap, slik som den ytre form av musen, som er viktig for nøyaktig modellering og fluorescens optisk rekonstruksjon 11. Videre kan optiske spredning og absorpsjon kartene beregnes ved hjelp av segmentering av vevstyper og ved å tildele klassespesifikke koeffisienter 12,13. For nær-infrarødt lys, er hemoglobin hoveddemperen i mus, i tillegg til melanin og pels 14. Siden den relative blodvolum varierer regionalt av størrelsesordener, er spesielt viktig for Quan An absorpsjon karttitative fluorescens gjenoppbygging 13.
En fordel ved å bruke ikke-invasive bildeapparater er at musene kan avbildes i lengderetningen, dvs. ved flere tidspunkter. Det er viktig å vurdere den dynamiske oppførsel av sonder, dvs. deres mål akkumulering, biodistribusjon og utskillelse 10,15, eller for å vurdere sykdomsprogresjon 16. Når bildebehandling flere mus på flere tidspunkter, oppstår det en stor mengde bilde datasett. For å aktivere sammenlignbarhet, bør disse være kjøpt på en systematisk måte, dvs. med en godt definert og dokumentert protokollen. Det store antallet skanninger er en utfordring for bildeanalyse, som er nødvendig for å trekke kvantitative målinger fra bildedataene.
Hensikten med vår studie er å gi en detaljert beskrivelse av en μCT-FMT bildebehandling protokollen som vi brukte og optimalisert gjennom flere studier 10,13,15,17,18. Vi beskriverhvor datasettene blir generert, behandlet, visualisert og analysert. Dette er demonstrert ved anvendelse av en etablert molekylær probe, OsteoSense, som binder seg til hydroksyapatitt 19, og kan brukes til å avbilde bensykdommer og ombygging 2. Alle prosedyrer som involverer dyr ble godkjent av den offentlige granskningskomité på dyr omsorg.
Protocol
Protokollen inneholder en detaljert beskrivelse av følgende trinn: Først blir fantomer eller mus og multimodale musen seng forberedt for bildebehandling. Så en hel-kroppsskanning er ervervet i μCT. Deretter ble mus sjiktet overføres til FMT hvor to skanninger overtas (opp og opp-ned). Dette kan gjentas for flere mus på flere tidspunkter. Etter gjennomføring av datainnsamling, må dataene som skal eksporteres og sortert for å aktivere automatisk segmentering (krever en Definiens programvarelisens), samt bilde fusion og fluorescens rekonstruksjon (krever en Imalytics Preklinisk programvarelisens). Endelig er det vist hvordan den multimodale datasettene blir visualisert og hvor organer er interaktivt segmentert for å kvantifisere biofordelingen av fluorescerende prober.
1. Phantom Forberedelse
MERK: Phantoms er nyttig for å teste avbildningssystem, men også for å bestemme kalibreringen factor for en ny sonde.
- Tilbered en oppløsning av 200 ml vann, 2% agarose, 1,8 g TiO 2-pulver, 50 ul trypanblått. Etter koking, fylle løsningen inn i en rektangulær form, omtrent på 8 cm lengde, 3 cm bredde, og 1,5 cm høyde.
- Forbered flere fluorescerende slutninger i phantom hjelp pipettespisser, som inneholder en blanding av fluorescens og μCT kontrastmiddel. Å skape de inneslutninger, kuttet pipettespissene og forsegle dem med en lighter.
- Etter at løsningen har stivnet, setter slutninger i fantomet. Skjær bort noen deler av fantom å oppnå en uregelmessig form og for å passe den til den multimodale museholderen.
- For å bestemme kalibreringsfaktoren for en ny sonde, er noen fantom skanninger nødvendig. For dette er standard FMT fantom anvendes i kombinasjon med kjente mengder av proben. For økt nøyaktighet, tilsett 4% lipidemulsjon til oppløsningen for å få den samme spredningskoeffisienten inne inkludering som iResten av fantom. Også legge til en liten mengde (2%) av μCT kontrastmiddel for enklere bildeanalyse.
2. Mouse Forberedelse
MERK: μCT-FMT bildebehandling krever spesielle forberedelser inkludert anesthetization og hårfjerning.
- Plasser musen på klorofyll-fri mat 7 dager før bildebehandling. Dette vil redusere bakgrunnssignalet og er spesielt viktig for FMT kanaler under 750 nm.
- Alle dyreforsøk utføres under narkose. For å starte anestesi, plasserer du muse i et kammer fylt med 2% isofluran i luft (strømningshastighet 5 l / min) til musen er å sovne. Bekreft riktig anesthetization ved forsiktig tå eller hud klemming og ved å sjekke avslapning av muskel tonus (f.eks., Kjeve muskler). For å opprettholde anestesi, fortsetter isofluran program ved hjelp av et rør som er plassert på nesen til mus (2% isofluran i luft, strømningshastighet 1 L / min). For å hindre at øyet dryness, bruke veterinæren salve på bedøvede mus.
- Å injisere kontrastmiddel, fikse bedøvet musen på en varmepute å bruke tape. Plassere et kateter (sprøyte nål festet til et rør) i halevenen, og injiserer det fluorescerende kontrastmiddel (f.eks, 2 nmol, med maksimal injeksjonsvolum på 5 ml / kg kroppsvekt, dvs. 150 ul i en 30 g mus).
- For å skanne en hårete mus, har skanneområdet skal depilated på forhånd. Til dette bruker en barbermaskin eller hårfjerningskrem. Noen stammer av mus kan utvikle utslett fra hårfjerning krem. Derfor overvåke mus for hudforandringer og kontakte veterinær ansatte for omsorg ved behov. Også teste toleranse på et lite antall dyr ved bruk av nye musestammer.
- Holde musen bedøvet under μCT og FMT imaging (2% isofluran i luft, strømningshastighet 1 L / min).
3. Mouse Bed Forberedelse
MERK: For μCT-FMT scanning, bruk en multimodalmus seng, som passer både inn i μCT og FMT.
- Før bildebehandling, rengjøre musen seng med våte vev. Ikke bruk etanol fordi dette kan skade akrylglass. Kontroller at markørene er fri for vann, fordi dette kan forringe automatisert markør gjenkjenning.
- Åpne skruene på multimodal mus seng og fjerne den øvre delen.
- Fest bedøvende gass rør på musen seng og fiksere den med tape.
- Plasser bedøvet musen i musen sengen og sette nesen inn i gass tube. Pass på at hodet av musen er på forsiden indikator på musen seng (figur 1).
- Kontroller at musen er i midten av musen sengen å optimalt bruke synsfeltet av FMT.
- Lukk musen seng og stramme skruene til musen er tett holdt. Kontroller at mus kan puste jevnt ved visuell overvåking av thorax pustebevegelser.
4. μCT jegmaging
MERK: En hel-kroppsskanning er utført ved hjelp av μCT. Den genererte anatomiske data er nødvendig for bilde fusjon, for en forbedret fluorescens rekonstruksjon og for bildeanalyse.
- Plasser musen seng med musa inn i μCT. Kontroller at musen er plassert på en måte som det går "tail-først" i μCT. Dette er viktig for den automatiserte fusjon.
- For å opprettholde anestesi når μCT-lokket er lukket, koble rørene for å kanalisere gassen gjennom tilfelle av μCT. Først løsne langt rør fra musen seng og fest den til kontakten på utsiden av μCT. Deretter fester de resterende frie enden til kontakten inne i μCT.
- Kjør musen senga i μCT. Kontroller at gasslangen ikke er løs og kan ikke bli fanget opp av den roterende gantry. Hvis det er nødvendig, fiksere det med tape. Sett røret inn i cut-out av innehaveren av musen sengen. Lukk μCT og få en topogram. Velge minst to subscans å dekke en vesentlig del av mus og mus seng, som er viktig for sammensmeltingen og rekonstruksjon.
- Velg μCT scan protokollen heter HQD-6565-360-90 som erverver 720 anslag med 1032 x 1012 piksler på en full rotasjon krever en skanning på 90 s per subscan. Rørene blir operert ved 65 kV spenning og strøm 1,0 mA. Alternativt, for å redusere stråledosen og skanning varighet, velg den skanne protokollen SQD-6565-360-29 som erverver 720 anslag med 516 x 506 piksler med skannetiden 29 s per subscan.
- Start μCT scan. Den blå linjen viser fremdriften. De subscans vil bli kjøpt i ettertid. Hypotermi og fluidtapet ikke er et problem på grunn av den korte varighet scanning av bare noen få minutter. Ikke åpne lokket på μCT under skanning fordi dette vil automatisk avbryte skanning for å beskytte brukeren frastråling.
- Når skanningen er fullført, åpne lokket, koble til bedøvelse rør og koble musen seng fra holderen til å transportere det til FMT.
5. FMT Imaging
MERK: Rett etter μCT skanning, er musen skannes i FMT i to konfigurasjoner (opp og opp-ned) som brukes sammen for en bedre fluorescens gjenoppbygging.
- Slå på bedøvelse gasstilførsel (2% isofluran i luft, strømningshastighet 1 l / min) for FMT før plassere musen senga i FMT. Bruke FMT kontroll programvare, lage en kollokviegruppe med et passende antall fag (dvs. mus). Velg sondene som vil bli benyttet for imaging (bruk OsteoSense for nye prober som ikke er oppført).
- Bær multimodale musen seng med musen til FMT. Den lange fleksible rør bedøvende gass opprett gasstrømmen. Før du setter muse senga i FMT, fjerne røret forsiktig siden deter ikke nødvendig på innsiden av FMT. Unngå å skru av musen sengen.
- Plasser musen senga i FMT med den røde indikatoren ("hodet først"). Dette er viktig for bilde fusjon for å være i samsvar med μCT.
- Lukk FMT.
- Velg riktig studie gruppen og under. Velg ønsket kanal for FMT (for OsteoSense 750EX, bruker 750 nm kanal).
- Legg inn en beskrivelse, f.eks., "Opp" eller "ned" og få oversikt skanningen ved å trykke på "Capture". Dette fanger en refleksjon bilde av hele synsfeltet. Sørg for å ikke ha "Reflektansmålingene Images Only" er valgt, fordi ellers er det ikke mulig å få 3D-skanner senere.
- Justere bildeparametre for 3D-skanning. Utvid synsfeltet å få med så mye som mulig av musen. Vanligvis vil hode og hale ikke helt passer inn i synsfeltet, men. Klikk "Avansert221; og sjekke bildeinnstillingene. Satt sampling tetthet til 3 mm, følsomhet for normal og belysning min / maks til 5000 og 50000, henholdsvis.
- Klikk "Legg til gjenoppbygging køen" og klikk "Scan" for å starte FMT skanningen da. Dette tar omkring 5 til 15 minutter, avhengig av størrelsen og tykkelsen på mus, fordi lengre eksponeringstider er nødvendig for tykkere gjenstander. Enheten inneholder et oppvarmet bildebehandling kammeret for å unngå nedkjøling.
- Etter skanningen, snu musen seng inkludert musen opp ned og skaffe en ny skanning. Dette gir flere data for fluorescens gjenoppbygging.
- Når μCT og FMT-skanninger er fullført og musen våkner opp fra bedøvelsen, ikke la det stå uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet, for eksempel, å gå rundt, eller for å opprettholde sternal recumbency.
6. Bilde Fusion og Reconstruction
MERK: Etterfullføring av μCT FMT-skanning, for eksempel ved slutten av studien, må de innsamlede data til å bli sortert for å muliggjøre den automatiserte bilde fusjon og fluorescens gjenoppbygging.
- Hvis du vil sortere skanner for videre behandling, opprette en mappe for studien. For hver μCT-FMT scan, opprette en undermappe hvis navn inneholder musen ID og tidspunkt, f.eks., M01_02h.
- For hver μCT-FMT skanne, eksportere FMT skanner (opp og ned) som .fmt filer og lagre dem i undermappen hjelp filnavnene slutter med enten "_up.fmt" eller "_down.fmt". Hver .fmt filen inneholder den oppkjøpte rådata, dvs. de eksitasjon og utslipps bilder ervervet av kameraet, metadata, for eksempel eksponeringstider, og fluorescens gjenoppbygging generert av FMT.
- Bruke μCT programvare, lage en rekonstruksjon med isotrop voxel størrelse 35 mikrometer. Velg en glatt rekonstruksjon kernel (T10). Juster synsfeltet såat hele musen seng inkludert markørene er dekket. Velg MIFX / RAW som output format og starte gjenoppbygging. Etter ombyggingen er ferdig, flytter de μCT gjenoppbygging filene inn i undermappe av μCT-FMT scan.
- Eksportere μCT og FMT data for alle skanninger. Sørg for at hver undermappe inneholder to .fmt filer (opp og ned) og μCT gjenoppbygging i MIFX / RAW format. For å sjekke for fullstendighet velge Meny-> CT-FMT-> Sjekk Fullstendighet bruker Imalytics Preklinisk programvare. En liste over feil kan vises, for eksempel manglende .fmt filer eller μCT rekonstruksjoner. Fikse feilene og sjekke for fullstendighet før alle feil er løst.
- Bruke Meny-> CT-FMT-> Innstillinger, sjekk servernavnet på Definiens programvare og juster om nødvendig. Standard er http: // localhost: 8184, forutsatt at Definiens programvaren er installert på samme datamaskin. Den Definiens programvare er nødvendig i neste trinn å utføre automated segmentering av musen seng og markører.
- Klikk på Meny-> CT-FMT-> Fuse gruppe i Imalytics Preklinisk programvare for å utføre automatisert μCT-FMT fusjon for hele studien. Dette tar noen få minutter per μCT-FMT skanne og resulterer i en mappe med suffikset "pakken" parallell til studiet mappe. Denne inneholder en mindre undergruppe av filer (de μCT data og smeltet leverandør gitt FMT rekonstruksjon) som er relevante for videre analyse.
- Klikk på Meny-> CT-FMT-> Rekonstruks gruppe (FMT) i Imalytics Preklinisk programvare for å utføre fluorescens oppbyggingen inkludert generering av absorpsjon og spredning maps 13. Selv om behandlingen er GPU-akselerert 20, som hver krever ombygging 1 til 4 timer, avhengig av størrelsen på mus. Resultatene blir lagret i pakken mappen. Merk: For å muliggjøre et høyere gjennomstrømning, vi i dag utfører disse rekonstruksjoner på en GPU klynge med 56 GPUer.
7. Bildeanalyse
MERK: Hvis du vil trekke kvantitative målinger fra bildedataene, er segmentering av lesjoner og organer som kreves.
- Når alle data settene er smeltet og rekonstruert, opprette en segmentering for hver μCT-FMT skanne ved hjelp av Imalytics Preklinisk programvare.
- Laste en μCT fil som undertak og fluorescens filen som overlegg. Trykk på "3D" for å slå på volumgjengivelse og inspisere datasettet.
- Å segmentere lungen, klikk Meny-> klasser-> Legg til klasse og lage en klasse som heter "tmp". Dette kan også gjøres via kontekstmenyen. Opprette en ny klasse stiller den automatisk som output klasse for påfølgende segmentering operasjoner.
- Utfør en thresholding operasjon for å segmentere alle regioner med lav intensitet i μCT datasett (klikk Meny-> Segmentation-> Thresholding-> Her og skriv 600). Nå er den tmp klassen inneholder luften utenfor mobruke, men også i lungevevet.
- Lag en "Lung" klasse. Utfør en "Fyll Region" operasjon (høyreklikk inn i lungene og velg Meny-> Fill region> Fyll region ubegrenset), for å skille lungene fra den ytre luften.
- Slette tmp klasse fordi det ikke er nødvendig lenger.
- Å segmentere konvekse områder, f.eks., Blæren, bruker rabbel modus. Først opprette en klasse "blære".
- Trykk på F1 for å slette alle skriblerier.
- Ved hjelp av mus, trekke skrabling å avgrense grensene av blæren.
- Trykk F3 for å fylle regionen omsluttet av skriblerier med en midlertidig maske som ser ut som rød overlegg. Iterativt legge til flere skriblerier (i alle slicing orientering) og trykk F3 inntil en tilstrekkelig nøyaktighet oppnås. Vanligvis skriblerier i 10 stykker er tilstrekkelig.
- Trykk F4 for å lagre den midlertidige maske som "blære".
- Fortsett sånn til å segmentereandre konvekse områder som hjerte og nyrer. Mange områder, f.eks., Mage eller leveren, kan approksimeres ved et par konvekse områder.
- Å segmentere ryggraden, først opprette en "Bone" klasse.
- Velg ContextMenu-> Thresholding-> Fremfor å utføre en thresholding operasjon for å klassifisere alle lyse lydelementer (f.eks., Over 1600) som "Bone".
- En region fylleoperasjon ville unnlate å segment ryggraden, fordi det er forbundet med mange andre deler av skjelettet, f.eks., Ribbene. Utføre noen Oppskjæring av iterativ tegning skriblerier og trykke F2 for å skille ryggraden fra skallen, ribbeina, og det sakrale bein.
- Til slutt, lage en klasse "Spine" og utføre en region fylling operasjon for å få ryggraden (høyreklikk inn i ryggraden og velg ContextMenu-> Fyll region> Fyll region ubegrenset).
- Lagre segmentering som en fil inne the undermappe av μCT-FMT scan. Bruk samme navn, f.eks organs.seg, for å muliggjøre satsvis behandling.
- Velg Meny-> statistikk-> Class statistikken (overlay), å generere et regneark som inneholder gjennomsnittlig fluorescens intensitet, volum og den totale mengden (produkt av midlere og volum) for hver klasse.
- For å generere en enkelt regneark som inneholder verdiene for alle regioner i alle μCT-FMT skanninger, klikker du på Meny-> Batch-> Angi innstillinger bakst og klikk deretter på Meny-> Batch-> Batch statistikk. Dette unngår innsats for å skape og sammenslåing mange regnearkfiler, dvs. en for hver μCT-FMT scan.
8. Probe Kalibrering
- For å beregne kalibreringsfaktoren for en sonde, flere μCT-FMT fantom skanninger med forskjellige kjente mengder av sonden er nødvendig (se trinn 1.4), f.eks., Med 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol og 0 pmol.
- Skann fantomene som beskrevet i§§ 4 og 5. Også for phantom skanninger, opp og ned skanninger i FMT er nødvendig.
- Eksportere data og utføre fusjon og gjenoppbygging som beskrevet i kapittel 6.
- Segment inkludering ved hjelp av μCT data for hver skanning av terskel (over 1200) og region fylling.
- Generere et regneark med de målte fluorescens mengder og plotte dem som funksjon av kjente mengder. Beregn skråningen av en lineær regresjon passform. Dette er kalibreringsfaktoren for sonden.
Representative Results
Vi har anvendt den beskrevne protokoll for å vurdere biofordelingen av en målrettet probe, OsteoSense, som binder seg til hydroksyapatitt. 3 mus (C57BL / 6 ApoE - / - Ahsg - / - dobbel knockout-mus, 10 uker gamle) ble avbildet før og 15 minutter, 2 timer, 4 timer, 6 timer og 24 timer etter intravenøs injeksjon av 2 nmol OsteoSense. Vår programvaren automatisk registreres markørene er innebygget i multimodale mus seng (figur 1, figur 2A, B), som aktivert sammensmelting av de anatomiske μCT data med fluorescens rekonstruksjon utført av FMT (figur 2C, D). Siden OsteoSense er en sonde med en lav molekylvekt, en rask renal utskillelse og derfor høyt signal i urinblæren er forventet. Fusjon av fluorescensen rekonstruksjon av FMT åpenbart problemer som forlagt signal utenfor blæren (figur 2C, D). Disse problemene oppstår fordi FMT ikke vet den egentlige formen på musen og forutsetter en blokk form. Our rekonstruksjon bestemmer den nøyaktige form fra μCT data og genererer spredning og absorpsjon kartene 13 for å muliggjøre en mer nøyaktig fluorescens rekonstruksjon med bedre signal lokalisering, noe som er spesielt tydelig for blæren (figur 2E, F).
Å tildele den rekonstruerte fluorescens til egnede områder, vi interaktivt segmentert flere organer ved hjelp av vår programvare (figur 3). For hver av de 18 skanninger, ble syv regioner segmentert basert på μCT data, ie., Hjerte, lunge, lever, nyrer, ryggrad, tarm og blære. Deretter ble den programvare som benyttes for å beregne den midlere fluorescens konsentrasjonen for hver av de 126 regionene. Heldigvis leverer programvaren en batch-modus, som beregner alle verdiene og lagrer dem i et enkelt regneark.
For å visualisere fluorescens fordeling, ble 3D-gjengivelser generert for hvert tidspunkt,ved hjelp av sammenlignbare vindus innstilling (Figur 4A-F). Bruke tallfestet organ verdier, ble biofordelingen beregnet ved å ta gjennomsnittet av organverdier over tre mus (Figur 4G). De forhånds skanner, ervervet før injeksjon, viste ubetydelig bakgrunn signal. 15 minutter etter injeksjon, det sterkeste signalet vist i urinblæren på grunn av den raske renal utskillelse. Ved de påfølgende tidspunkter, hadde det gjenværende sonden akkumulert på ben og ledd.
Figur 1. Multimodal Mouse Bed. (A) Den multimodal muse bed inneholder to akrylglassplater som er tett holder musen. Innstrammingen justeres med to skruer. Musen bed inneholder markører (tomme hull) for bilde fusjon. Bedøvelsesgassen tilføres ved hjelp av et fleksibelt rør som er fiksert med tape. (B) Musen Sengen er festet til en metallholder og holdes i midten av den roterende μCT gantry. (C) Unngå et gap mellom mus sengen og metall holder, fordi ellers markørene kan være feil tildelt fører til feil fusjon. Narkosen gassrøret skal være festet til røret kontakten. (D) Musen sengen skal settes inn i FMT med forsiden først å muliggjøre en korrekt automatisert fusjon. (E) Markørene er synlig for FMT kamera, som brukes for automatisert markør deteksjon og fusion. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bilde Fusion og gjenoppbygging. (A, B) Markører og den ytre formen på mouse er bestemt av den automatiserte segmenteringsalgoritmen. (C, D) 15 min etter injeksjon av OsteoSense, har en betydelig mengde av sonden allerede er utskilt i urinblæren. Etter å fusjonere den leverandør gitt rekonstruksjon med μCT data, problemene blir synlige. Mesteparten av det signal som vises rundt blæren, men ikke inne i blæren og noen signal vises selv i luften. Dette skjer fordi FMT inntar en blokkformet mus. (E, F) Vår forbedret fluorescens rekonstruksjon ved hjelp av formen på musen utledet fra μCT data, resulterer i bedre lokalisering av fluorescens inne i blæren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Interaktiv Organ Segmentat. ion (A) For å kvantifisere fluorescens distribusjon, er flere organer segmentert: hjerte (rød), lunge (rosa), lever (brunt), mage (beige), rygg (lilla), nyrer (gul), tarm (grønn) og urinblære (gull). (B) Den lunge, som er sterkt i kontrast sammenlignet med det omgivende vev, er segmentert ved hjelp av terskling og region fylling. (C) Runde organer, slik som blære, nyrer, hjerte og er segmentert ved hjelp av "skrabling". (D) Organer med en mer kompleks form, for eksempel, lever og mage er segmentert trinnvis hjelp skriblerier. Å segmentere ryggraden, er en høy terskel brukt til å segmentere alle bein. Så noen bein, f.eks., Ribbeina, er kuttet bort, inntil ryggraden forblir. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Biofordeling. For å vurdere biofordelingen, blir musene skannet ved flere tidspunkter (AF). (A) Den pre scan, før injeksjon, viser liten bakgrunnssignalet i 750 nm-kanalen. (B) 15 min etter injeksjon, er en betydelig mengde av sonden allerede i urinblæren. (C) På det tidspunkt 2 timer, hadde mus urin, noe som resulterer i noen fluorescens utsiden av musen. På senere tidspunkter (DF), vises signal hovedsakelig på bein og ledd, ie., På ryggen og knærne. (G) den kvantifiserte fluorescens-konsentrasjonen er vist for utvalgte organer.
Discussion
Vi beskriver og bruke en protokoll for multimodal μCT-FMT bildebehandling. Vi bruker kommersielt tilgjengelig og mye brukt FMT og μCT enheter 3,11,15 - 17,21. Mens protokollen krever en bestemt FMT kan μCT erstattes av en annen μCT med lignende funksjoner og sammenlignbare parametere for skanning, for eksempel bør det synsfeltet være stor nok til å dekke mus seng inkludert markørene.
Den FMT har vært brukt for biodistribusjon analyse uten å kombinere det med μCT eller MR 21, er imidlertid den anatomiske data gunstig å øke reproduserbarheten fordi segmenteringen kan være basert på organgrenser som er synlige i det μCT data 10. Mens integrerte μCT-FMT enheter har blitt utviklet 2,7, disse er ikke kommersielt tilgjengelig ennå. Videre tillater bruken av to separate enheter rør, det vil si., Den neste mus CAN avbildes i μCT mens den første mus er fortsatt i FMT, for å øke gjennomstrømningen.
For å redusere den manuelle arbeidsmengden, vi utfører automatisert markør deteksjon og fusion. Videre er formen mus automatisk segmentert og denne informasjonen forbedrer fluorescensen oppbyggingen 11,13,22. For kvantitativ fluorescens gjenoppbygging, er absorpsjon og spredning kart trengte 13,23. Vi utlede spredning kartet ved automatisert segmentering av μCT data og tildele kjente spredning koeffisientene flere vevstyper (lunge, bein, hud, fett, og resterende bløtvev) 24. Deretter vi rekonstruere en absorpsjon kart fra det optiske rådata som er spesielt viktig for riktig-perfuserte organer, slik som hjertet og leveren 13,20.
Skanning flere mus på flere tidspunkter raskt resulterer i et stort antall datasett som skal analyseres. For BIODISsjonsstudier, flere organer må segmenteres for hver μCT-FMT scan. Dessverre kan de segmentations ikke gjenbrukes, fordi musa er nylig plassert i musen sengen gjentatte ganger. Vi bruker et verktøy for interaktiv segmentering, utviklet ved vårt institutt, men andre verktøy kan også være aktuelt 25. Vi skaper vokselver-messig segmentations, fordi disse passer bedre til komplekse organer enn enkle former som ellipser og kuber 26. Automatisert hel-animalsk segmentering ville være nyttig for ytterligere å redusere den manuelle arbeidsbelastning 27, men et interaktivt segmenterings verktøyet ville fortsatt være nødvendig å korrigere for segmenteringsfeil. Videre kan automatiserte segmenteringsverktøy knapt forutse spesielle tilfeller, for eksempel patologier korrekt. Siden vi bruker innfødte μCT skanninger, noen organer som milt er svært vanskelig å segmentere selv manuelt. Kontrastmidler ville hjelpe, men det er problemer med toleranse, og det er vanskelig å maintaina jevn kontrastmiddel distribusjon i hele lengde bildebehandling.
Vår fantom studie viser at signalet lokalisering er forbedret ved bruk av formen informasjonen for rekonstruksjon fluorescens. In vivo, er en tilsvarende forbedring åpenbart for tidlig tidspunkt (15 minutter etter injeksjon), når en stor mengde av sonden er allerede i urinblære. Den hydroksyapatitt-bindende probe akkumuleres på ben og ledd. Det er bemerkelsesverdig hvor raskt dette skjer, det vil si, er signalet allerede er godt synlig på ryggraden 15 min etter injeksjon. Dette er sannsynligvis forårsaket av den lave molekylvekt av sonden, noe som muliggjør hurtig ekstravasasjon og diffusjon til målregioner. Sonden binder kovalent til sitt mål hydroksyapatitt og det ubundne probe utskilles. For de senere tidspunkter, mellom 6 timer og 24 timer etter injeksjon, signalintensiteten i ryggraden er relativt stabil, antagelig fordi nesten ingen lys resmerter dypt inn i musen til å bleike fluorescens. For vår studie har vi brukt 750 nm kanal, noe som resulterer i lav bakgrunnsfluorescensen så tydelig for de skanner ervervet før injeksjon. Ved lavere bølgelengder, kan mer bakgrunnssignal forventes 28.
I sammendraget beskriver vi en multimodal bildebehandling protokoll for kommersielt tilgjengelige FMT og μCT enheter. Vi viser at kombinasjonen gir fordeler for fluorescens gjenoppbygging. Vi illustrere hvordan biofordelingsstudier kurvene ekstraheres fra den store mengden av bildedata ved hjelp av interaktiv organ segmentering og satsvis behandling. Vi tror at dette standardisert arbeidsflyt kan være nyttig for legemiddelutvikling og andre bildebehandlings studier med fluorescensmerkede prober.
Disclosures
Felix Gremse er grunnlegger og eier av Gremse-IT, en oppstart selskap som tilbyr programvare og tjenester for medisinsk bildeanalyse i samarbeid med Philips og Institutt for Eksperimentell molekylær avbildning av RWTH Aachen.
Acknowledgments
Vi takker Marek Weiler for å utføre fantom eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av European Research Council (ERC Starting Grant 309495: NeoNaNo), den tyske delstaten Nordrhein Westfalen (NRW, High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Prog (EFRE); ForSaTum), den tyske Departementet for utdanning og forskning (BMBF) (finansiering programmer Virtual Liver (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), RWTH Aachen universitetet (jeg tre TM Seed Fund), og Philips Research (Aachen, Tyskland).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX | PerkinElmer | FMT2000 | Device for fluorescence molecular tomography |
| µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo | CT Imaging GmbH | Tomoscope Duo | Device for micro computed tomography |
| Multimodal Mouse Bed | CT Imaging GmbH | Experimental builder | Partially transparent animal holder |
| IsoFlo (isoflurane, USP) | Abbott | 05260-05 | Isoflurane Inhalation anesthesia |
| Small animal anesthesia system | Harvard apparatus | 726419 | Complete Isoflurane Table-Top System |
| Chlorophyll-free mouse food | Ssniff | E15051 | low chlorophyll / low fluorescence food |
| OsteoSense 750EX | PerkinElmer | NEV10053EX | Animal FMT contrast agent |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smith medical | 800/100/120 | Tube for injection catheter |
| Sterican 30g | BBraun | 4656300 | Hypodermic needle for catheter |
| Imeron | Altana pharma | INLA F.1/0203/3.5337.69 | CT contrast agent for the phantom inclusions |
| Agarose | Sigma | 90-12-36-6 | Agarose for phantom production |
| TiO2 | Applichem | A1900,1000 | Titanium oxyde as phantom scattering agent |
| Trypan blue | Fluka | 93595 | Trypan blue to adjust phantom light propagation |
| Cy7 | Lumiprobe | 15020 | Fluorochrome for the phantom inclusions |
| Lipovenoes 20% | Fresenius Kabi | 3094740 | Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents |
| Definiens Developer XD Server | Definiens AG | Server XD | Software platform for automated segmentation |
| Imalytics Preclinical | ExMI/Gremse-IT | Version 2.0.1 | Software for image fusion, reconstruction and analysis |
| NVIDIA Geforce Titan | Asus | GTXTITAN6GD5 | High end computer graphics card, 6GB Memory |
References
- Hoffman, R. M., Yang, M. Subcellular imaging in the live mouse. Nature Protocols. 1 (2), 775-782 (2006).
- Ale, A., Ermolayev, V., Herzog, E., Cohrs, C., Angelis, M. H., Ntziachristos, V. FMT-XCT: in vivo animal studies with hybrid fluorescence molecular tomography-X-ray computed tomography. Nature Methods. 9 (9), 615-620 (2012).
- Eaton, V. L., Vasquez, K. O., Goings, G. E., Hunter, Z. N., Peterson, J. D., Miller, S. D. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. Journal of Neuroinflammation. 10 (138), (2013).
- Lederle, W., Arns, S., et al. Failure of annexin-based apoptosis imaging in the assessment of antiangiogenic therapy effects. EJNMMI Research. 1 (26), (2011).
- Ntziachristos, V., Tung, C. -H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nature Medicine. 8 (7), (2002).
- Hoffman, R. M. The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nature Reviews Cancer. 5 (10), 796-806 (2005).
- Schulz, R. B., Ale, A., et al. Hybrid system for simultaneous fluorescence and x-ray computed tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29 (2), 465-473 (2010).
- Stuker, F., Baltes, C., et al. Hybrid small animal imaging system combining magnetic resonance imaging with fluorescence tomography using single photon avalanche diode detectors. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (6), 1265-1273 (2011).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdés, P. A., Pogue, B. W. Preclinical Whole-body Fluorescence Imaging: Review of Instruments, Methods and Applications. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Kunjachan, S., Gremse, F., et al. Noninvasive optical imaging of nanomedicine biodistribution. ACS Nano. 7 (1), 252-262 (2013).
- Radrich, K., Ale, A., Ermolayev, V., Ntziachristos, V. Improving limited-projection-angle fluorescence molecular tomography using a co-registered x-ray computed tomography scan. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126011 (2012).
- Freyer, M., Ale, A., Schulz, R. B., Zientkowska, M., Ntziachristos, V., Englmeier, K. -H. Fast automatic segmentation of anatomical structures in x-ray computed tomography images to improve fluorescence molecular tomography reconstruction. Journal of Biomedical Optics. 15 (3), 036006 (2010).
- Gremse, F., Theek, B., et al. Absorption Reconstruction Improves Biodistribution Assessment of Fluorescent Nanoprobes Using Hybrid Fluorescence-mediated Tomography. Theranostics. 4 (10), 960-971 (2014).
- Cheong, W. -F., Prahl, S. A., Welch, A. J. A review of the optical properties of biological tissues. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2166-2185 (1990).
- Doleschel, D., Mundigl, O., et al. Targeted near-infrared imaging of the erythropoietin receptor in human lung cancer xenografts. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 53 (2), 304-311 (2012).
- Al Rawashdeh, W., Arns, S., et al. Optical tomography of MMP-activity allows a sensitive non-invasive characterization of the invasiveness and angiogenesis of SCC-xenografts. Neoplasia. 16 (3), 235-246 (2014).
- Kunjachan, S., Pola, R., et al. Passive versus Active Tumor Targeting Using RGD- and NGR-Modified Polymeric Nanomedicines. Nano Letters. 14 (2), 972-981 (2014).
- Schober, A., Nazari-Jahantigh, M., et al. MicroRNA-126-5p promotes endothelial proliferation and limits atherosclerosis by suppressing Dlk1. Nature Medicine. 20 (4), 368-376 (2014).
- Aikawa, E., Nahrendorf, M., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
- Gremse, F., Höfter, A., Schwen, L., Kiessling, F., Naumann, U. GPU-Accelerated Sparse Matrix-Matrix Multiplication by Iterative Row Merging. SIAM Journal on Scientific Computing. , C54-C71 (2015).
- Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. Quantitative Whole Body Biodistribution of Fluorescent-Labeled Agents by Non-Invasive Tomographic Imaging. PLoS ONE. 6 (6), e20594 (2011).
- Theek, B., Gremse, F., et al. Characterizing EPR-mediated passive drug targeting using contrast-enhanced functional ultrasound imaging. Journal of Controlled Release. 182 (1), 83-89 (2014).
- Hyde, D., Schulz, R., Brooks, D., Miller, E., Ntziachristos, V. Performance dependence of hybrid x-ray computed tomography/fluorescence molecular tomography on the optical forward problem. Journal of the Optical Society of America. A, Optics, Image Science, and Vision. 26 (4), 919-923 (2009).
- Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37 (2013).
- Loening, A. M., Gambhir, S. S. AMIDE: a free software tool for multimodality medical image analysis. Molecular Imaging. 2 (3), 131-137 (2003).
- Gremse, F., Schulz, V. Qualitative and Quantitative Data Analysis. Small Animal Imaging. , 363-378 (2011).
- Baiker, M., Milles, J., et al. Atlas-based whole-body segmentation of mice from low-contrast Micro-CT data. Medical Image Analysis. 14 (6), 723-737 (2010).
- Sevick-Muraca, E. M., Rasmussen, J. C. Molecular imaging with optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine. Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041303 (2008).
