Abstract
La fluorescencia mediada por tomografía (FMT) permite la determinación longitudinal y cuantitativa de la distribución de fluorescencia in vivo y se puede utilizar para evaluar la biodistribución de nuevas sondas y para evaluar la progresión de la enfermedad utilizando sondas moleculares establecidas o genes informadores. La combinación con una modalidad anatómica, por ejemplo, micro tomografía computarizada (μCT), es beneficioso para el análisis de imagen y para la reconstrucción de fluorescencia. Se describe un protocolo para multimodal de imágenes μCT-FMT incluyendo los pasos de procesamiento de imágenes necesarias para extraer mediciones cuantitativas. Después de la preparación de los ratones y la realización de la formación de imágenes, los conjuntos de datos multimodales están registrados. Posteriormente, se realiza una mejor reconstrucción de fluorescencia, que tiene en cuenta la forma del ratón. Para el análisis cuantitativo, segmentaciones de órganos se genera en base a los datos anatómicos utilizando nuestra herramienta de segmentación interactiva. Finalmente, el cu biodistribuciónrves se generan utilizando una función de procesamiento por lotes. Mostramos la aplicabilidad del método mediante la evaluación de la biodistribución de una sonda bien conocido que se une a los huesos y las articulaciones.
Introduction
Tomografía de fluorescencia mediada, también llamada tomografía de fluorescencia molecular (FMT), es una técnica prometedora para evaluar cuantitativamente la distribución de fluorescencia en los tejidos difusos, tales como ratones anestesiados o incluso tejidos del cuerpo humano, por ejemplo, senos o articulaciones de los dedos. En contraste con las técnicas de microscopía no invasivos, que permiten imágenes de objetivos superficiales en resolución subcelular 1, FMT permite la reconstrucción tridimensional de fuentes fluorescentes en profundidades de varios centímetros, aunque a menor resolución 2. Muchas sondas fluorescentes específicas están disponibles para la angiogénesis imagen, apoptosis, inflamación, y otros 2 - 5. Algunas sondas son activable, por ejemplo., Mediante escisión específica de la enzima que conduce a unquenching de fluorocromos. Por otra parte, los genes indicadores que expresan proteínas fluorescentes se pueden obtener imágenes, por ejemplo, para rastrear la migración de células del tumor 6.
FMT beneficia considerablemente de la combinación con una modalidad anatómica, por ejemplo, μCT 2,7 o RM 8. Mientras que los dispositivos FMT independientes están disponibles comercialmente 9, las imágenes de fluorescencia son difíciles de interpretar, sin información de referencia anatómica. Recientemente hemos sido capaces de demostrar, que los datos de imagen anatómica fundido permite un análisis más robusto 10. Los datos anatómicos también se pueden utilizar para proporcionar conocimiento previo, tal como la forma exterior del ratón, lo cual es importante para el modelado óptico de fluorescencia reconstrucción precisa y 11. Además, los mapas de dispersión y absorción ópticos pueden estimarse utilizando la segmentación de tipos de tejido y mediante la asignación de coeficientes específicos de clase 12,13. Para la luz del infrarrojo cercano, la hemoglobina es el absorbente principal en ratones, además de la melanina y la piel 14. Dado que el volumen de sangre relativa varía regionalmente por órdenes de magnitud, un mapa de absorción es particularmente importante para Quanfluorescencia reconstrucción cuanti- 13.
Una ventaja de utilizar dispositivos de imagen no invasivas es que los ratones se pueden obtener imágenes longitudinalmente, es decir, en múltiples puntos de tiempo. Esto es importante para evaluar el comportamiento dinámico de sondas, es decir, su acumulación de destino, biodistribución y la excreción 10,15, o para evaluar la progresión de la enfermedad 16. Cuando la formación de imágenes de varios ratones en múltiples puntos de tiempo, una gran cantidad de conjuntos de datos de imagen surge. Para permitir la comparabilidad, estos deben ser adquiridos de manera sistemática, es decir, con un protocolo bien definido y documentado. El gran número de exploraciones plantea un desafío para el análisis de imágenes, que se requiere para extraer mediciones cuantitativas de los datos de imagen.
El objetivo de nuestro estudio es proporcionar una descripción detallada de un protocolo de imágenes μCT-FMT que utilizamos y optimizado a lo largo de varios estudios 10,13,15,17,18. Describimoscómo se generan los conjuntos de datos, procesado, visualizado, y se analizaron. Esto se demuestra utilizando una sonda molecular establecido, OsteoSense, que se une a la hidroxiapatita 19, y se puede utilizar para enfermedades de los huesos y remodelación de imagen 2. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el comité de evaluación del gobierno en el cuidado de animales.
Protocol
El protocolo contiene una descripción detallada de los pasos siguientes: En primer lugar, fantasmas o ratones y la cama ratón multimodal se preparan para la imagen. A continuación, una exploración de todo el cuerpo se adquiere en el μCT. Posteriormente la cama ratón se transfiere a la FMT donde dos exploraciones se adquieren (y al revés). Esto se puede repetir para múltiples ratones en múltiples puntos de tiempo. Después de la finalización de la adquisición de datos, los datos deben ser exportados y ordenados para permitir la segmentación automatizada (que requiere una licencia de software Definiens), así como la fusión de imágenes y reconstrucción de fluorescencia (que requiere una licencia de software Imalytics preclínica). Finalmente se muestra cómo los conjuntos de datos multimodales se visualizan y cómo órganos están segmentados de forma interactiva para cuantificar la biodistribución de sondas fluorescentes.
1. Preparación Phantom
NOTA: Phantoms son útiles para probar el sistema de formación de imágenes, sino también para determinar la calibración de factor para una nueva sonda.
- Preparar una solución de agua de 200 ml, 2% de agarosa, 1,8 g de polvo de TiO2, 50 l de azul de tripano. Después de hervir, llenar la solución en una forma rectangular, aproximadamente de 8 cm de longitud, 3 cm de ancho, y 1,5 cm de altura.
- Prepare varias inclusiones fluorescentes en el espectro utilizando puntas de pipeta, que contiene una mezcla de fluorescencia y de contraste μCT. Para crear las inclusiones, cortar las puntas de pipeta y sellarlos con un encendedor.
- Después la solución se ha solidificado, inserte las inclusiones en el fantasma. Cortar algunas partes del espectro para lograr una forma irregular y para adaptarse a la titular del ratón multimodal.
- Para determinar el factor de calibración para una nueva sonda, se requieren algunas exploraciones fantasma. Para ello, el FMT fantasma predeterminado se utiliza en combinación con cantidades conocidas de la sonda. Para una mayor precisión, añadir 4% de emulsión de lípidos a la solución para recibir el mismo coeficiente de dispersión dentro de la inclusión como en elresto del fantasma. También agregue una pequeña cantidad (2%) de agente de contraste μCT para el análisis de imágenes más fácil.
2. Preparación del ratón
NOTA: imágenes μCT-FMT requiere una preparación especial, incluyendo anestesia y la depilación.
- Coloque el ratón sobre la comida-clorofila libre 7 días antes de la imagen. Esto reducirá la señal de fondo y es particularmente importante para los canales por debajo de 750 nm FMT.
- Todos los experimentos con animales se realizan bajo anestesia. Para iniciar la anestesia, coloque el ratón en una cámara llena de 2% de isoflurano en el aire (caudal de 5 l / min) hasta que el ratón se está quedando dormido. Confirmar anestesia adecuada por los pies suaves o pellizcar la piel y comprobando la relajación del tono muscular (por ejemplo., Músculo de la mandíbula). Para mantener la anestesia, continuar la aplicación isoflurano usando un tubo que se coloca en la nariz del ratón (2% de isoflurano en el aire, caudal 1 L / min). A fin de evitar drynes ojos, utilice ungüento veterinario en ratones anestesiados.
- Para inyectar medio de contraste, fijar el ratón anestesiado sobre una almohadilla térmica con cinta. Colocar un (aguja de la jeringa unida a un tubo) catéter a la vena de la cola e inyectar el agente de contraste fluorescente (por ejemplo, 2 nmol, con un volumen máximo de inyección de 5 ml / kg de peso corporal, es decir, 150 l para una 30 g de ratón).
- Para escanear un ratón peludo, el área de exploración tiene que depilar con antelación. Para ello, utiliza una crema de eliminación de la máquina de afeitar o el cabello. Algunas cepas de ratones pueden desarrollar erupciones de la crema de depilación. Por lo tanto, controlar los ratones para cambios en la piel y en contacto con el personal veterinario para la atención si es necesario. También prueba la tolerancia en un pequeño número de animales al usar nuevas cepas de ratón.
- Mantenga el ratón anestesiado durante μCT y FMT de formación de imágenes (2% de isoflurano en el aire, caudal 1 L / min).
3. Ratón Cama Preparación
NOTA: Para el escaneado μCT-FMT, use un multimodalcama de ratón, que se ajusta tanto a la μCT y la FMT.
- Antes de imagen, limpiar la cama ratón con toallitas húmedas. No utilice el etanol, ya que puede dañar el vidrio acrílico. Asegúrese de que los marcadores están libres de agua, ya que esto puede afectar a la detección de marcadores automatizado.
- Abrir los tornillos de la cama del ratón multimodal y quitar la parte superior.
- Conecte el tubo de gas anestésico en la cama del ratón y fijar con cinta.
- Coloca el ratón anestesiado en el lecho del ratón y poner la nariz en el tubo de gas. Asegúrese de que la cabeza del ratón es el indicador delante de la cama del ratón (Figura 1).
- Asegúrese de que el ratón está en el centro de la cama ratón para utilizar de manera óptima el campo de visión de la FMT.
- Cierre la cama ratón y apriete los tornillos hasta que el ratón se mantiene con fuerza. Asegúrese de que el ratón puede respirar de manera constante por el control visual de los movimientos respiratorios torácicos.
4. μCT Imaging
NOTA: Una exploración de todo el cuerpo se realiza utilizando el μCT. Se requiere que el anatómica de datos generado para la fusión de imágenes, para una mejor reconstrucción de fluorescencia y para el análisis de imagen.
- Coloque la cama del ratón con el ratón en la μCT. Asegúrese de que el ratón se coloca de una manera que va "cola-primero" en el μCT. Esto es importante para la fusión automatizado.
- A fin de mantener la anestesia cuando el μCT-tapa está cerrada, vuelva a conectar los tubos para canalizar el gas a través del caso de la μCT. En primer lugar separar el tubo largo del lecho del ratón y adjuntarlo al conector en la parte exterior de la μCT. A continuación, conecte el extremo libre que queda en el conector dentro del μCT.
- Conduzca la cama del ratón en el μCT. Asegúrese de que el tubo de gas no está suelto y no puede quedar atrapado por el pórtico rotativo. Si es necesario, fijar con cinta. Inserte el tubo en el recorte de la titular de la cama del ratón. Cierre la μCT y adquirir un topograma. Seleccione al menos dos subscans para cubrir una parte sustancial del ratón y la cama de ratón, que es importante para la fusión y la reconstrucción.
- Seleccione el protocolo de exploración μCT llamado HQD-6565-360-90, que adquiere 720 proyecciones con 1032 x 1012 píxeles en una rotación completa que requiere un tiempo de exploración de 90 s por subexploración. Los tubos se operaron a tensión de 65 kV y corriente de 1,0 mA. Alternativamente, para reducir la dosis de radiación y el escaneo duración, seleccione el protocolo de exploración SQD-6565-360-29 que adquiere 720 proyecciones con 516 x 506 píxeles con tiempo de exploración 29 s por subexploración.
- Inicie el escaneo μCT. La barra azul indica el progreso. Los subscans serán adquiridas posteriormente. La hipotermia y la pérdida de fluido no son un problema debido a la corta duración de exploración de sólo unos pocos minutos. No abra la tapa de la μCT durante la exploración, ya que esto interrumpa automáticamente el escaneo para proteger al usuario deradiación.
- Cuando el análisis haya finalizado, abra la tapa, vuelva a conectar el tubo de anestesia y separar la cama de ratón del soporte para transportar a la FMT.
5. FMT Imaging
NOTA: Directamente después de la digitalización μCT, el ratón se escanea en el FMT en dos configuraciones (arriba y boca abajo) que se utilizan juntos por una mejor reconstrucción de fluorescencia.
- Abra el suministro de gas anestésico (2% de isoflurano en el aire, caudal de 1 l / min) para la FMT antes de colocar la cama ratón en la FMT. Utilizando el software de control de FMT, crear un grupo de estudio con un número adecuado de sujetos (es decir, los ratones). Seleccione las sondas que se utilizarán para la imagen (uso OsteoSense de nuevas sondas que no figuran).
- Llevar a la cama del ratón multimodal con el ratón a la FMT. El tubo de gas anestésico largo y flexible mantiene el flujo de gas. Antes de insertar la cama ratón en la FMT, retire con cuidado el tubo ya queNo se necesita dentro de la FMT. Evite girar los tornillos de la cama del ratón.
- Coloque la cama ratón en la FMT con el indicador rojo primero ("cabeza-primero"). Esto es importante para la fusión de imágenes para ser coherente con la μCT.
- Cierre la FMT.
- Seleccione el grupo de estudio correctos y tema. Seleccione el canal deseado de la FMT (por OsteoSense 750EX, utilice el canal de 750 nm).
- Añadir una descripción, por ejemplo., "Arriba" o "abajo" y adquirir una visión general de exploración pulsando "captura". Esta captura una imagen de reflectancia de todo el campo de visión. Asegúrese de no tener "Sólo reflectancia Imágenes" seleccionados, porque de lo contrario no es posible adquirir 3D escanea posteriormente.
- Ajuste los parámetros de imagen para el escaneo 3D. Ampliar el campo de visión para incluir lo más posible del ratón. Por lo general, la cabeza y la cola no caben por completo en el campo de visión, sin embargo. Haga clic en "Opciones avanzadas221; y comprobar los ajustes de imagen. Establecer densidad de muestreo a 3 mm, la sensibilidad a la normalidad y la iluminación min / max a 5.000 y 50.000, respectivamente.
- Haga clic en "añadir a la cola de la reconstrucción" y luego haga clic en "Scan" para iniciar la exploración FMT. Esto tomará alrededor de 5 a 15 min, dependiendo del tamaño y el grosor del ratón, ya que se requieren tiempos de exposición más largos para los objetos más gruesos. El dispositivo contiene una cámara de imágenes climatizada para evitar la hipotermia.
- Después de la exploración, dar la vuelta a la cama del ratón incluyendo el ratón boca abajo y adquirir otra exploración. Esto proporciona datos adicionales para la reconstrucción de fluorescencia.
- Cuando el μCT y los FMT-scan se han completado y el ratón se despierta de la anestesia, no lo deje sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente, por ejemplo, caminar alrededor o para mantener decúbito esternal.
6. Imagen de Fusión y Reconstrucción
NOTA: Despuésla finalización de la exploración μCT-FMT, por ejemplo, al final del estudio, los datos adquiridos tiene que ser resuelto para permitir la fusión de imágenes automatizado y la reconstrucción de fluorescencia.
- Para ordenar las exploraciones para su posterior procesamiento, cree una carpeta para el estudio. Para cada exploración μCT-FMT, cree una subcarpeta cuyo nombre contiene el ID del ratón y el punto de tiempo, por ejemplo., M01_02h.
- Para escanear cada μCT-FMT, exportar los escaneos FMT (arriba y abajo) como .fmt archivos y guardarlos en la subcarpeta utilizando nombres de archivos que terminan con cualquiera "_up.fmt" o "_down.fmt". Cada archivo .fmt contiene los datos en bruto adquiridos, es decir, las imágenes de excitación y emisión adquiridos por la cámara, los metadatos, tales como los tiempos de exposición, y la reconstrucción de fluorescencia generada por la FMT.
- Usando el software μCT, crear una reconstrucción con el tamaño de vóxel isotrópico 35 micras. Seleccionar un kernel de reconstrucción suave (T10). Ajuste el campo de visión de modoque todo el lecho de ratón incluyendo los marcadores está cubierto. Seleccione MIFX / RAW como formato de salida y comenzar la reconstrucción. Después de la reconstrucción se hace, mover los archivos de reconstrucción μCT en la subcarpeta de la exploración μCT-FMT.
- Exportar los datos μCT y FMT para todos los escaneos. Asegúrese de que cada subcarpeta contiene dos archivos .fmt (arriba y abajo) y la reconstrucción μCT en el formato MIFX / RAW. Para comprobar la integridad seleccionar Menú-> CT-FMT-> comprobación de la integridad utilizando el software Imalytics preclínicos. Puede aparecer una lista de errores, tales como falta .fmt archivos o reconstrucciones μCT. Corregir los errores y compruebe si hay integridad hasta que se resuelvan todos los errores.
- Usando Menú-> Configuración CT-FMT->, compruebe el nombre del servidor del software Definiens y ajustar si es necesario. El valor predeterminado es http: // localhost: 8184, en el supuesto de que el software Definiens está instalado en el mismo equipo. El software Definiens se requiere en el siguiente paso para realizar la ausegmentación tomatizada de la cama del ratón y marcadores.
- Haga clic en Menú-> CT-FMT-> Grupo de fusibles en el software Imalytics preclínicos para llevar a cabo la fusión automatizado μCT-FMT durante todo el estudio. Esto toma unos minutos por μCT-FMT escanear y resulta en una carpeta con el sufijo "paquete" paralela a la carpeta de estudio. Este contiene un subconjunto más pequeño de archivos (los datos μCT y la FMT reconstrucción proporcionado por el proveedor fusionado) que son relevantes para su posterior análisis.
- Haga clic en Menú-> CT-FMT-> Reconstruir grupo (FMT) en el software Imalytics preclínicos para llevar a cabo la reconstrucción de fluorescencia incluyendo la generación de absorción y dispersión de mapas 13. A pesar de que el procesamiento es acelerado por la GPU 20, cada reconstrucción requiere de 1 a 4 horas dependiendo del tamaño del ratón. Los resultados se almacenan en la carpeta del paquete. Nota: Para permitir un mayor rendimiento, actualmente realizamos estas reconstrucciones en un clúster de GPU con 56 GPUs.
Análisis 7. Imagen
NOTA: Para extraer mediciones cuantitativas de los datos de imagen, es necesaria la segmentación de las lesiones y órganos.
- Una vez que todos los conjuntos de datos se fusionan y reconstruidos, crean una segmentación para cada μCT-FMT escanear utilizando el software Imalytics preclínicos.
- Cargar un archivo μCT como capa base y el archivo de fluorescencia como superposición. Pulse el botón "3D" para encender la representación de volumen e inspeccione el conjunto de datos.
- Para segmentar el pulmón, haga clic en Menú-> Classes-> Agregar clase y crear una clase llamada "tmp". Esto también puede hacerse a través del menú de contexto. La creación de una nueva clase define automáticamente como clase de salida para las operaciones de segmentación posteriores.
- Realizar una operación de umbralización segmentar todas las regiones con baja intensidad en el conjunto de datos μCT (clic Menú-> Segmentation-> Thresholding-> Abajo e introduzca 600). Ahora la clase tmp contiene el aire fuera de la moutilizar, sino también el tejido pulmonar.
- Crear una clase de "pulmón". Realice una operación "Fill Región" (botón derecho del ratón en el pulmón y seleccione Menú-> Rellenar Región-> Rellenar región ilimitado), para separar el pulmón del aire exterior.
- Eliminar la clase tmp ya que no se necesita más.
- Para regiones convexas segmento, por ejemplo., La vejiga, utilice el modo de garabato. En primer lugar crear una "vejiga" clase.
- Pulse F1 para borrar todos los garabatos.
- Utilizando el ratón del ordenador, dibujar garabatos para delinear los límites de la vejiga.
- Presione F3 para llenar la región encerrada por los garabatos con una máscara temporal que aparece como superposición de rojo. Añadir iterativamente más garabatos (en cualquier orientación slicing) y presione F3 hasta que se consigue una exactitud suficiente. Típicamente, garabatos en 10 rebanadas son suficientes.
- Presione F4 para guardar la máscara temporal como "vejiga".
- Proceda como este para el segmentootras regiones convexas tales como el corazón y los riñones. Muchas regiones, por ejemplo., El estómago o el hígado, pueden ser aproximadas por unas pocas regiones convexas.
- Para el segmento de la columna vertebral, en primer lugar crear una clase "hueso".
- Seleccionar ContextMenu-> Thresholding-> Por encima de realizar una operación de umbralización para clasificar todos los voxels brillantes (por ejemplo., Por encima de 1600) como "Bone".
- Una operación de llenado región dejaría de segmento de la columna vertebral, ya que está conectado con muchas otras partes del esqueleto, por ejemplo., Las costillas. Realizar unas cuantas operaciones de corte dibujando garabatos iterativa y pulsando F2 para separar la espina dorsal del cráneo, las costillas y el hueso sacro.
- Por último, cree una clase de "columna vertebral" y llevar a cabo una operación de llenado región para obtener la columna vertebral (botón derecho del ratón en la columna vertebral y seleccione ContextMenu-> Rellenar Región-> Rellenar región ilimitado).
- Guarde la segmentación como un archivo dentro ªe subcarpeta de la exploración μCT-FMT. Utilice un nombre consistente, por ejemplo, organs.seg, para permitir que el procesamiento por lotes.
- Seleccione Menú-> Statistics-> Clase estadísticas (overlay), para generar una hoja de cálculo que contiene la intensidad de fluorescencia media, el volumen y la cantidad total (producto de la media y volumen) para cada clase.
- Para generar una sola hoja de cálculo que contiene los valores para todas las regiones de todos los análisis μCT-FMT, haga clic en Menú->> Configuración por lotes Conjunto lotes y haga clic en Menú-> por lotes> estadísticas por lotes. Esto evita el esfuerzo de creación y combinación de muchos archivos de hojas de cálculo, es decir, uno para cada exploración μCT-FMT.
8. Sonda de calibración
- Para calcular el factor de calibración para una sonda, múltiples exploraciones fantasma μCT-FMT con se requieren diferentes cantidades conocidas de la sonda (véase el paso 1.4), por ejemplo., Con 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol y 0 pmol.
- Analiza los fantasmas como se describe enSe requieren las secciones 4 y 5. También para exploraciones fantasmas, arriba y abajo en las exploraciones del FMT.
- Exportar los datos y llevar a cabo la fusión y la reconstrucción como se describe en la sección 6.
- Segmento de la inclusión mediante los datos μCT para cada exploración por umbralización (por encima de 1200) y el llenado región.
- Generar una hoja de cálculo con las cantidades de fluorescencia medidos y colócalas en función de las cantidades conocidas. Calcular la pendiente de un ajuste de regresión lineal. Este es el factor de calibración para la sonda.
Representative Results
Se aplicó el protocolo descrito para evaluar la biodistribución de una sonda específica, OsteoSense, que se une a la hidroxiapatita. 3 ratones (C57BL / 6 ApoE - / - AHSG - / - ratones doble knockout, 10 semanas de edad) se obtuvieron imágenes de antes y 15 min, 2 h, 4 h, 6 h, y 24 h después de la inyección iv de 2 nmol OsteoSense. Nuestro software detecta automáticamente los marcadores incorporados en la cama ratón multimodal (Figura 1, Figura 2A, B), lo que permitió la fusión de los datos μCT anatómicas con la reconstrucción de fluorescencia realizado por el FMT (Figura 2C, D). Desde OsteoSense es una sonda con un bajo peso molecular, un excreción renal rápido y por lo tanto, la señal de alto en la vejiga urinaria que se espera. La fusión de la reconstrucción de fluorescencia de la FMT reveló problemas como señal fuera de lugar fuera de la vejiga (Figura 2C, D). Estos problemas se producen porque el FMT no sabe la verdadera forma del ratón y asume una forma de bloque. Oureconstrucción r determina la forma precisa de los datos μCT y genera dispersión y los mapas de absorción 13 con el fin de permitir una reconstrucción más exacta de fluorescencia con una mejor localización de la señal, que es particularmente evidente en la vejiga (Figura 2E, F).
Para asignar la fluorescencia reconstruida a regiones apropiadas, que de forma interactiva segmentado varios órganos que utilizan nuestro software (Figura 3). Para cada una de las 18 exploraciones, 7 regiones fueron segmentados basan en los datos, es decir μCT., Corazón, pulmón, hígado, riñones, la columna vertebral, el intestino y la vejiga. Posteriormente, el software se utilizó para calcular la concentración media de fluorescencia para cada una de las regiones 126. Afortunadamente, el software ofrece un modo discontinuo, que calcula todos los valores y las guarda en una sola hoja de cálculo.
Para visualizar la distribución de fluorescencia, representaciones en 3D se generaron para cada punto de tiempo,usando entorno de ventanas comparables (Figura 4A-F). Utilizando los valores cuantificados de órganos, la biodistribución se calculó promediando los valores de órganos durante los tres ratones (Figura 4G). Las exploraciones previas, adquiridas antes de la inyección, mostraron señal de fondo insignificante. 15 min después de la inyección, la señal más fuerte apareció en la vejiga urinaria, debido a la excreción renal rápido. En los puntos de tiempo posteriores, la sonda restante había acumulado en los huesos y las articulaciones.
Figura 1. Multimodal ratón cama. (A) La cama del ratón multimodal contiene dos placas de vidrio acrílico que sujetan firmemente el ratón. El endurecimiento se ajusta con dos tornillos. La cama ratón contiene marcadores (agujeros vacíos) para la fusión de imágenes. Gas anestésico se suministra mediante un tubo flexible que está obsesionado con tsimio. (B) La cama del ratón está unido a un soporte de metal y se mantiene en el centro del pórtico μCT rotativo. (C) Evitar una brecha entre la cama del ratón y el soporte de metal, porque de lo contrario, los marcadores pueden ser asignados de forma incorrecta que lleva a la fusión incorrecta. El tubo de gas anestésico debe ser conectado al conector de tubo. (D) La cama ratón debe ser insertado en el FMT con el frente primero para permitir una fusión correcta automatizado. (E) Los marcadores son visibles para la cámara FMT, que se utiliza para la detección de marcadores automatizado y la fusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Imagen de Fusión y Reconstrucción. (A, B) Marcadores y la forma exterior del mouSE se determina por el algoritmo de segmentación automatizado. (C, D) 15 min después de la inyección de OsteoSense, una cantidad considerable de la sonda ya ha sido excretado en la vejiga urinaria. Después de la fusión de la reconstrucción proporcionada por el proveedor con los datos μCT, los problemas se hacen visibles. La mayor parte de la señal aparece alrededor de la vejiga, pero no dentro de la vejiga y algunos incluso señal aparece en el aire. Esto sucede porque el FMT asume un ratón en forma de bloque. (E, F) Nuestra mejorado la reconstrucción de fluorescencia, usando la forma del ratón derivado de los datos μCT, se traduce en una mejor localización de la fluorescencia dentro de la vejiga. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. interactivo Organ Segmentat. iónico (A) Para cuantificar la distribución de fluorescencia, varios órganos están segmentados: Corazón (rojo), pulmón (rosa), hígado (marrón), estómago (beige), la columna vertebral (morado), los riñones (amarillo), intestino (verde) y la vejiga urinaria (oro). (B) El pulmón, que se contrastó fuertemente en comparación con el tejido circundante, se segmenta usando umbralización y llenado región. (C) de la Ronda órganos, como la vejiga, los riñones y el corazón están segmentados utilizando "garabatos". (D) Los órganos con una forma más compleja, por ejemplo, el hígado y el estómago están segmentados de forma incremental utilizando garabatos. Para el segmento de la columna vertebral, un umbral alto se aplica a todos los segmentos de huesos. Entonces algunos huesos, por ejemplo., Las costillas, se cortan, hasta que la columna vertebral se mantiene. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. La biodistribución. Para evaluar la biodistribución, los ratones se escanean en varios puntos temporales (AF). (A) La detección previa, antes de la inyección, muestra poca señal de fondo en el canal 750 nm. (B) 15 min después de la inyección, una cantidad considerable de la sonda ya está en la vejiga urinaria. (C) En el punto de tiempo de 2 h, el ratón había orinado, lo que resulta en algunos fluorescencia fuera del ratón. En los puntos de tiempo posteriores (DF), la señal aparece predominantemente en los huesos y articulaciones, es decir., En la columna vertebral y las rodillas. (G) La concentración de fluorescencia cuantificada se muestra para los órganos seleccionados.
Discussion
Describimos y aplicamos un protocolo para multimodal de imágenes μCT-FMT. Utilizamos FMT disponible en el mercado y ampliamente utilizado y dispositivos μCT 3,11,15 - 17,21. Mientras que el protocolo requiere una FMT específica, el μCT puede ser sustituido por otro μCT con una funcionalidad similar y parámetros de análisis comparables, por ejemplo, el campo de visión debe ser lo suficientemente grande como para cubrir la cama ratón incluyendo los marcadores.
La FMT se ha utilizado para el análisis de biodistribución sin combinarla con μCT o MRI 21, sin embargo, los datos anatómica es beneficioso para aumentar la reproducibilidad porque la segmentación se puede basar en los límites de órganos que son visibles en los datos μCT 10. Mientras que los dispositivos μCT-FMT integrados se han desarrollado 2,7, éstos aún no están disponibles comercialmente. Además, el uso de dos dispositivos separados permite la tubería, es decir., El siguiente ca ratónn ser fotografiado en el μCT mientras que el primer ratón se encuentra todavía en la FMT, para aumentar el rendimiento.
Para reducir la carga de trabajo manual, llevamos a cabo la detección de marcadores automatizado y la fusión. Además, la forma de ratón se segmenta automáticamente esta información y mejora significativamente la 11,13,22 reconstrucción de fluorescencia. Para la reconstrucción de fluorescencia cuantitativa, se necesitan mapas de absorción y dispersión 13,23. Obtenemos el mapa de dispersión por la segmentación automatizado de los datos μCT y asignar coeficientes de dispersión conocidos de varios tipos de tejidos (pulmón, hueso, piel, grasa y tejido blando restante) 24. Posteriormente, se reconstruye un mapa de absorción de los datos en bruto óptico que es particularmente importante para los órganos bien perfundidos, tales como el corazón y el hígado 13,20.
Escaneado de varios ratones en múltiples puntos de tiempo se traduce rápidamente en un gran número de conjuntos de datos para ser analizados. Para Biodisestudios tribución, varios órganos deben ser segmentados para cada exploración μCT-FMT. Por desgracia, las segmentaciones no pueden ser reutilizados, ya que el ratón está recién colocado en el lecho del ratón repetidamente. Utilizamos una herramienta para la segmentación interactiva, desarrollada en nuestro instituto, sin embargo, otras herramientas pueden también ser apropiados 25. Generamos segmentaciones-vóxel sabio, ya que estos se ajustan mejor a los órganos complejos de formas simples tales como elipses y cubos 26. Segmentación todo animal automatizada sería útil para reducir aún más la carga de trabajo manual de 27, sino una herramienta de segmentación interactiva seguiría siendo necesario para corregir errores de segmentación. Además, las herramientas de segmentación automatizada difícilmente pueden anticipar casos especiales como patologías correctamente. Desde que usamos exploraciones μCT nativos, algunos órganos como el bazo son muy difíciles de segmento incluso manualmente. Los medios de contraste se ayudan, pero hay problemas con la tolerabilidad y es difícil de mantenina distribución de agente de contraste constante en toda la imagen longitudinal.
Nuestro estudio fantasma muestra que la localización de la señal se mejora cuando se utiliza la información de la forma para la reconstrucción de fluorescencia. In vivo, una mejora similar es evidente para el punto de tiempo temprano (15 min después de la inyección), cuando una gran cantidad de la sonda ya está en el vejiga urinaria. La sonda de unión a hidroxiapatita se acumula en los huesos y las articulaciones. Es notable lo rápido que se produce este, es decir, la señal ya es claramente visible en la columna 15 min después de la inyección. Esto probablemente es causada por el bajo peso molecular de la sonda, lo que permite la extravasación rápido y difusión a las regiones de destino. La sonda se une covalentemente a su hidroxiapatita diana y la sonda no unido se excreta. Para los puntos de tiempo posteriores, entre 6 h y 24 h después de la inyección, la intensidad de la señal en la columna vertebral se mantiene relativamente estable, probablemente, porque casi no re luzdolores profundamente en el ratón para blanquear la fluorescencia. Para nuestro estudio, hemos utilizado el canal de 750 nm, lo que resulta en una baja fluorescencia de fondo como es evidente para los escáneres adquiridos antes de la inyección. En longitudes de onda más bajas, más la señal de fondo se puede esperar 28.
En resumen, se describe un protocolo de imagen multimodal para dispositivos FMT y μCT disponibles en el mercado. Se demuestra que la combinación proporciona beneficios para la reconstrucción de fluorescencia. Se ilustra cómo las curvas de biodistribución se extraen de la gran cantidad de datos de imagen por medio de la segmentación del órgano interactivo y procesamiento por lotes. Creemos que este flujo de trabajo estandarizado puede ser útil para el desarrollo de medicamentos y otros estudios de imagen utilizando sondas marcadas con fluorescencia.
Disclosures
Felix Gremse es fundador y propietario de Gremse-IT, una compañía de lanzamiento que ofrece software y servicios para el análisis de imágenes médicas en colaboración con Philips y el Departamento de Imagen Molecular Experimental de la Universidad RWTH Aachen.
Acknowledgments
Damos las gracias a Marek Weiler para la realización de los experimentos fantasmas. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Europeo de Investigación (ERC Starting Grant 309495: NeoNaNo), el Estado federal alemán de Renania del Norte Westfalia (NRW; High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (EFRE); ForSaTum), el alemán Ministerio de Educación e Investigación (BMBF) (programas de financiación de hígado virtual (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), la Universidad RWTH Aachen (I 3 Fondo Semilla TM), e Investigación de Philips (Aquisgrán, Alemania).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX | PerkinElmer | FMT2000 | Device for fluorescence molecular tomography |
| µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo | CT Imaging GmbH | Tomoscope Duo | Device for micro computed tomography |
| Multimodal Mouse Bed | CT Imaging GmbH | Experimental builder | Partially transparent animal holder |
| IsoFlo (isoflurane, USP) | Abbott | 05260-05 | Isoflurane Inhalation anesthesia |
| Small animal anesthesia system | Harvard apparatus | 726419 | Complete Isoflurane Table-Top System |
| Chlorophyll-free mouse food | Ssniff | E15051 | low chlorophyll / low fluorescence food |
| OsteoSense 750EX | PerkinElmer | NEV10053EX | Animal FMT contrast agent |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smith medical | 800/100/120 | Tube for injection catheter |
| Sterican 30g | BBraun | 4656300 | Hypodermic needle for catheter |
| Imeron | Altana pharma | INLA F.1/0203/3.5337.69 | CT contrast agent for the phantom inclusions |
| Agarose | Sigma | 90-12-36-6 | Agarose for phantom production |
| TiO2 | Applichem | A1900,1000 | Titanium oxyde as phantom scattering agent |
| Trypan blue | Fluka | 93595 | Trypan blue to adjust phantom light propagation |
| Cy7 | Lumiprobe | 15020 | Fluorochrome for the phantom inclusions |
| Lipovenoes 20% | Fresenius Kabi | 3094740 | Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents |
| Definiens Developer XD Server | Definiens AG | Server XD | Software platform for automated segmentation |
| Imalytics Preclinical | ExMI/Gremse-IT | Version 2.0.1 | Software for image fusion, reconstruction and analysis |
| NVIDIA Geforce Titan | Asus | GTXTITAN6GD5 | High end computer graphics card, 6GB Memory |
References
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