Abstract
Fluorescens-medierad tomografi (FMT) möjliggör longitudinell och kvantitativ bestämning av fluorescens fördelning in vivo och kan användas för att bedöma biodistributionen av nya prober och bedöma sjukdomsförloppet med hjälp av etablerade molekylära prober eller reportergener. Kombinationen med en anatomisk modalitet, t.ex. mikro datortomografi (μCT), är fördelaktigt för bildanalys och för fluorescens återuppbyggnad. Vi beskriver ett protokoll för multimodal μCT-FMT avbildning inklusive bildbehandlings nödvändiga åtgärder för att utvinna kvantitativa mätningar. Efter beredning mössen och utföra bildbehandling, de multimodala datamängder registreras. Därefter är en förbättrad fluorescens rekonstruktion utförs, som tar hänsyn till formen på musen. För kvantitativ analys är segmenteorgan genereras baserat på de anatomiska data med hjälp av vår interaktiva segmente verktyg. Slutligen biodistributionen curves genereras med användning av en gruppbearbetning funktionen. Vi visar tillämpningen av förfarandet genom att bedöma biofördelningen av ett välkänt sond som binder till ben och leder.
Introduction
Fluorescens-medierad tomografi, även kallad fluorescens molekylär tomografi (FMT), är en lovande teknik för att kvantitativt bedöma fluorescens distribution i diffusa vävnader, såsom sövda möss eller ens mänskliga kroppsvävnader, t.ex. bröst och fingerleder. I motsats till icke-invasiva mikroskopi tekniker, som möjliggör avbildning av ytliga mål på subcellulär upplösning 1 tillåter FMT tredimensionell rekonstruktion av fluorescerande källor i djupet av några centimeter, om än i lägre upplösning 2. Många riktade fluorescerande prober finns bilden angiogenes, apoptos, inflammation, och andra 2-5. Vissa sonder är aktiveras, exempelvis genom särskilda enzymklyvning leder till unquenching av fluorokromer.,. Dessutom kan reportergener som uttrycker fluorescerande proteiner avbildas, t.ex. för att spåra tumörcellmigrering 6.
FMT gynnar starkt från kombinationen med en anatomisk modalitet, t.ex. μCT 2,7 eller MRI 8. Medan fristående FMT anordningar är kommersiellt tillgängliga 9, fluorescens bilder är svåra att tolka utan anatomisk referensinformation. Nyligen kunde vi visa att den smält anatomiska bilddata möjliggör en mer robust analys 10. De anatomiska data kan också användas för att ge förkunskaper, såsom den yttre formen av musen, som är viktiga för en korrekt optisk modellering och fluorescens återuppbyggnad 11. Dessutom kan optiska spridningen och absorptionen kartor uppskattas med hjälp segmentering av vävnadstyper och genom att tilldela klass specifika koefficienter 12,13. För nära infrarött ljus, är hemoglobin huvud absorbatorn i möss, förutom melanin och päls 14. Eftersom den relativa volymen blod varierar regionalt med tiopotenser, är särskilt viktigt för Quan An absorption kartatitativ fluorescens rekonstruktion 13.
En fördel med användning av icke-invasiva avbildningsanordningar är att mössen kan avbildas i längdled, dvs vid multipla tidpunkter. Detta är viktigt för att bedöma det dynamiska beteendet hos prober, dvs deras mål ackumulation, biodistribution och utsöndring 10,15, eller att bedöma sjukdomsförloppet 16. När avbildning flera möss vid flera tidpunkter, en stor mängd bilddatamängder uppstår. För att möjliggöra jämförbarhet, bör dessa förvärvas på ett systematiskt sätt, det vill säga med en väl definierad och dokumenterad protokoll. Det stora antalet avsökningar innebär en utmaning för bildanalys, som krävs för att extrahera kvantitativa mätningar från nämnda bilddata.
Syftet med vår studie är att ge en detaljerad beskrivning av en μCT-FMT avbildning protokoll som vi använt och optimeras genom flera studier 10,13,15,17,18. Vi beskriverhur datamängder genereras, behandlas, visualiseras och analyseras. Detta visas med användning av ett etablerat molekylsond, OsteoSense, som binder till hydroxiapatit 19, och kan användas för att avbilda skelettsjukdomar och remodeling 2. Alla som deltar i djurförsök har godkänts av den statliga granskningskommitté på djurvård.
Protocol
Protokollet innehåller en detaljerad beskrivning av följande steg: Först är fantomer eller möss och multimodala musen sängen förberedd för avbildning. Så hela kroppen scan förvärvas i μCT. Därefter musen bädden överföres till FMT där två avsökningar förvärvas (upp och upp och ner). Detta kan upprepas för flera möss vid multipla tidpunkter. Efter slutförandet av datainsamling, behöver data som ska exporteras och sorteras för att möjliggöra automatiserad segmente (som kräver en definiens programvarulicens), samt bildfusion och fluorescens rekonstruktion (som kräver en Imalytics Prekliniska programvarulicens). Slutligen visas hur de multimodala dataset visualiseras och hur organ är interaktivt segmenterad att kvantifiera biofördelningen av fluorescerande prober.
1. Fantom Framställning
OBS: fantomer är användbart för att testa avbildningssystemet, utan även att bestämma kalibreringen factor för en ny sond.
- Bered en lösning av 200 ml vatten, 2% -ig, 1,8 g TiO 2 pulver, 50 pl trypanblått. Efter kokning, fylla lösningen i en rektangulär form approximativt av 8 cm längd, cm bredd 3, och 1,5 cm hög.
- Förbered flera fluorescerande införanden i fantom använder pipettspetsar, som innehåller en blandning av fluorescens och μCT kontrastmedel. För att skapa inneslutningar, skär pipettspetsarna och täta dem med en tändare.
- Efter lösningen har stelnat, sätter inneslutningar i fantom. Skär bort vissa delar av fantom att uppnå en oregelbunden form och att passa till multimodala musen hållaren.
- För att bestämma kalibreringsfaktorn för en ny sond, är några streckade scanningar krävs. För detta används standard FMT fantom användas i kombination med kända mängder av sonden. För en ökad noggrannhet, tillsätt 4% lipidemulsion till lösningen för att få samma spridningskoefficient inuti integration som iResten av fantom. Också lägga till en liten mängd (2%) av μCT kontrastmedel för enklare bildanalys.
2. Mus Framställning
OBS: μCT-FMT avbildning kräver speciella förberedelser inklusive bedövning och hårborttagning.
- Placera musen på klorofyll-fri mat 7 dagar innan avbildning. Detta kommer att minska bakgrundssignalen och är särskilt viktig för FMT kanaler under 750 nm.
- Alla djurförsök utförs under narkos. För att initiera anestesi, placera musen i en kammare fylld med 2% isofluran i luft (flöde 5 l / min) tills musen somna. Bekräfta korrekt anesthetization genom försiktig tå eller hud klämmande och genom att kontrollera relaxation av muskeltonus (t.ex.., Käkmusklerna). För att upprätthålla anestesi, fortsätter isofluran program med en slang som är placerad på näsan av musen (2% isofluran i luft, flödeshastighet 1 L / min). För att förhindra ögon dryness, använda veterinär salva på sövda möss.
- Att injicera kontrastmedlet, fixera anestetiserad mus på en värmedyna med tejp. Placera en kateter (sprutnål fäst till ett rör) i svansvenen och injicera det fluorescerande kontrastmedlet (t.ex., 2 nmol, med maximal injektionsvolym av 5 ml / kg kroppsvikt, dvs 150 | il för en 30 g mus).
- För att skanna en hårig mus, har skanningsområdet att depilerades i förväg. För detta använder en rakapparat eller hårborttagningskräm. Vissa stammar av möss kan utveckla utslag från hårborttagningskräm. Därför övervaka mössen för hudförändringar och kontakta veterinär personal för vård om det behövs. Också testa toleransen för ett litet antal djur vid användning av nya musstammar.
- Håll musen bedövas under μCT och FMT imaging (2% isofluran i luft, flödeshastighet 1 L / min).
3. Mus B Framställning
OBS: För μCT-FMT scanning, använd en multimodalmus säng, som passar både i μCT och FMT.
- Innan avbildning, rengöra musen sängen med våtservetter. Använd inte etanol eftersom det kan skada akrylglas. Försäkra dig om att markörerna är fria från vatten, eftersom detta kan försämra den automatiska markördetektering.
- Öppna skruvarna till multimodala musen sängen och ta bort den övre delen.
- Fäst anestesi gasröret på musen sängen och fixera den med tejp.
- Placera sövda musen i musen sängen och sätta näsan i gasröret. Se till att huvudet av musen är på framsidan indikator på musen säng (Figur 1).
- Kontrollera att musen är i mitten av musen bädden att optimalt använda synfält FMT.
- Stäng musen sängen och dra åt skruvarna tills musen hålls tätt. Se till att musen kan andas stadigt genom visuell kontroll av bröstkorg andningsrörelser.
4. μCT Imaging
OBS: En hela kroppen skanning utförs med hjälp av μCT. Den genererade anatomiska data krävs för bildfusion, för en förbättrad fluorescens återuppbyggnad och för bildanalys.
- Placera musen sängen med musen i μCT. Se till att mus placeras på ett sådant sätt att den går "svans-först" i μCT. Detta är viktigt för den automatiserade fusionen.
- För att upprätthålla anestesin när μCT-locket är stängt, anslut rören att kanalisera gasen genom fallet med μCT. Först loss långt rör från musen säng och anslut den till kontakten på utsidan av μCT. Fäst sedan den återstående fria änden till kontakten inuti μCT.
- Kör musen sängen i μCT. Se till att gasröret är inte löst och kan inte fastna i det roterande gantry. Om så är nödvändigt, fixera den med tejp. Sätt röret i utskurna av innehavaren av musen sängen. Stäng μCT och skaffa en topogram. Välj åtminstone två subscans att täcka en betydande del av musen och musen sängen, vilket är viktigt för fusions och återuppbyggnad.
- Välj μCT scan protokoll som heter HQD-6565-360-90, som förvärvar 720 prognoser med 1032 x 1012 bildpunkter under ett helt varv kräver ett sveptiden 90 sekunder per subscan. Rören drivs med spänning 65 kV och ström 1,0 mA. Alternativt, för att minska stråldosen och skanning varaktighet Välj rätt skannerprotokollet SQD-6565-360-29 som förvärvar 720 prognoser med 516 x 506 pixlar med skanning tid 29 s per subscan.
- Starta μCT avsökning. Den blå stapeln visar framsteg. De subscans kommer att förvärvas senare. Hypotermi och vätskeförlust är inte ett problem på grund av den korta avsöknings varaktighet av endast ett fåtal minuter. Öppna inte locket på μCT under skanning eftersom det automatiskt kommer att avbryta skanningen för att skydda användaren frånstrålning.
- När scanningen är klar, öppna locket, anslut anestesiröret och lossa musen sängen från hållaren för att transportera det till FMT.
5. FMT Imaging
OBS: Direkt efter μCT scanning, är mus skannas i FMT i två konfigurationer (upp och upp och ner) som används tillsammans för en förbättrad fluorescens rekonstruktion.
- Slå på anestesi gasförsörjning (2% isofluran i luft, flödeshastighet 1 L / min) för FMT innan du placerar musen sängen i FMT. Med hjälp av styrprogram FMT, skapa en studiegrupp med ett lämpligt antal patienter (dvs möss). Välj sonderna som kommer att användas för avbildning (använd OsteoSense för nya prober som inte är noterade).
- Bär multimodala musen sängen med musen för att FMT. Den långa böjliga anestesigas röret bibehåller gasflödet. Innan du sätter musen sängen i FMT, försiktigt bort röret eftersom detbehövs inte inne i FMT. Undvik att vrida skruvarna på musen sängen.
- Placera musen sängen i FMT med den röda indikatorn först ("head-first"). Detta är viktigt för bild fusion till att överensstämma med μCT.
- Stäng FMT.
- Välj rätt studiegruppen och ämne. Välj kanalen för FMT krävs (för OsteoSense 750EX använder 750 nm-kanal).
- Lägg till en beskrivning, till exempel. "Upp" eller "ner" och skaffa en överblick skanning genom att trycka på "Capture". Detta fångar en reflektions bild av hela synfältet. Se till att inte ha "Reflektions Endast bilder" väljs, eftersom det annars inte är möjligt att förvärva 3D skannar därefter.
- Justera bildparametrar för 3D scanningen. Förstora synfältet till att omfatta så mycket som möjligt av musen. Vanligtvis kommer huvud och svans inte helt passar in i synfältet, dock. Klicka på "Avancerat221; och kontrollera bildinställningarna. Ställ stickprovstäthet som 3 mm, känslighet för normal och belysning min / max till 5000 och 50000, respektive.
- Klicka på "lägg till återuppbyggnad kö" och klicka sedan på "Scan" för att starta FMT skanningen. Detta tar ca 5 till 15 min, beroende på storleken och tjockleken hos mus, eftersom längre exponeringstider erfordras för tjockare föremål. Enheten innehåller en uppvärmd avbildning kammare för att undvika hypotermi.
- Efter skanningen, vända musen säng med musen upp och ner och få en annan skanning. Detta ger ytterligare data för fluorescens återuppbyggnad.
- När μCT och FMT-skanningar är klara och musen vaknar upp ur narkosen, inte lämna den utan uppsikt tills den har återfått tillräckligt medvetande, till exempel, att gå runt eller att behålla sternala VILA.
6. Bild Fusion och återuppbyggnad
OBS: Efterfullbordande av μCT-FMT skanning, t ex vid slutet av studien, måste det förvärvade data som skall sorteras för att möjliggöra den automatiserade bildfusion och fluorescens återuppbyggnad.
- För att sortera söker efter ytterligare bearbetning, skapa en mapp för studien. För varje μCT-FMT skanning, skapa en undermapp vars namn innehåller mus-ID och tidpunkten, M01_02h exempel.,.
- För varje μCT-FMT skanna, exportera FMT skannar (upp och ner) som .fmt filer och spara dem i undermappen med hjälp av filnamn som slutar med antingen "_up.fmt" eller "_down.fmt". Varje .fmt filen innehåller förvärvade rådata, det vill säga de excitations- och emissions bilder förvärvas av kameran, metadata, såsom exponeringstider, och fluorescens rekonstruktion som genereras av FMT.
- Med hjälp av μCT programvara, skapa en rekonstruktion med isotrop voxelstorlek 35 um. Välj en mjuk rekonstruktion kärna (T10). Justera synfältet såatt hela musen säng med markörerna är täckt. Välj MIFX / RAW som utdataformat och börja återuppbyggnaden. Efter återuppbyggnaden är klar, flytta μCT återuppbyggnads filer till undermappen i μCT-FMT scan.
- Exportera data μCT och FMT för alla skanningar. Se till att varje undermapp innehåller två .fmt filer (upp och ner) och μCT återuppbyggnad i MIFX / RAW-format. För att kontrollera fullständighet välja Meny-> CT-FMT> Kontrollera fullständighet med hjälp av Imalytics Prekliniska programvaran. En lista över fel kan tyckas, som att det saknas .fmt filer eller μCT rekonstruktioner. Fäst fel och kontrollera fullständighet tills alla fel har åtgärdats.
- Använda Meny-> CT-FMT> Inställningar, kontrollera servernamnet på definiens programvara och justera vid behov. Standard är http: // localhost: 8184, förutsatt att definiens programvaran är installerad på samma dator. Den definiens programvara krävs i nästa steg för att utföra automated segmentering av musen säng och markörer.
- Klicka på Meny-> CT-FMT> säkringsgrupp i Imalytics Prekliniska programvara för att utföra automatiserad μCT-FMT fusion för hela studien. Detta tar några minuter per μCT-FMT skanna och resulterar i en mapp med ändelsen "paket" parallellt med studie mappen. Denna artikel innehåller en mindre delmängd av filer (de μCT data och den kondenserade leverantörs tillgänglig FMT rekonstruktion) som är relevanta för vidare analys.
- Klicka på Meny-> CT-FMT> Rekonstruera grupp (FMT) i Imalytics Prekliniska programvara för att utföra fluorescens rekonstruktion med framtagning av absorption och spridning kartor 13. Även om bearbetningen är GPU-accelererade 20 kräver varje rekonstruktion 1 till 4 h beroende på storleken på musen. Resultaten kommer att lagras i paketet mappen. Obs! För att möjliggöra en högre genomströmning, gör vi för närvarande dessa rekonstruktioner på en GPU kluster med 56 grafikprocessorer.
7. Bildanalys
OBS: För att extrahera kvantitativa mätningar från bilddata krävs segmentering av skador och organ.
- När alla datamängder är smält och rekonstruerade, skapa en segmentering för varje μCT-FMT skanna med Imalytics Prekliniska programvaran.
- Ladda en μCT filen som underlag och fluorescens filen som överlägg. Tryck på "3D" för att slå på volymen rendering och inspektera datamängden.
- För segmentet lungan, klicka Menu-> Classes-> Lägg till klass och skapa en klass som heter "tmp". Detta kan också göras via snabbmenyn. Skapa en ny klass ställer den automatiskt utgående klass för efterföljande segmente verksamhet.
- Utför en tröskeloperation att segmentera alla regioner med låg intensitet i μCT datamängden (klicka Meny-> Segmentation-> Thresholding-> nedan och ange 600). Nu tmp klassen innehåller luften utanför moanvända men även lungvävnaden.
- Skapa en "Lung" klass. Utför en "Fill Region" operation (högerklicka i lungan och välj Menu-> Fyll Region-> Fyll region obegränsat), att skilja lungan från den yttre luften.
- Ta bort tmp klassen eftersom det inte behövs längre.
- Att segmentera konvexa områden, till exempel., Urinblåsan, använder klottra läget. Först skapa en klass "blåsa".
- Tryck på F1 för att radera alla klotter.
- Med hjälp av datormusen, rita klotter att avgränsa gränserna för blåsan.
- Tryck på F3 för att fylla området omges av klotter med en tillfällig mask som visas som röd överlagring. Iterativt lägga till fler klotter (i alla skiv orientering) och tryck på F3 tills en tillräcklig noggrannhet uppnås. Typiskt klotter i 10 skivor är tillräckliga.
- Tryck på F4 för att lagra den tillfälliga masken som "blåsa".
- Gör så här för att segmenteraandra konvexa områden som hjärta och njurar. Många regioner, till exempel., Magen eller levern, kan approximeras med några konvexa regioner.
- För segmentet ryggraden, först skapa en "Bone" klass.
- Välj ContextMenu-> Thresholding-> ovan för att utföra en tröskel operation för att klassificera alla ljusa voxlar (t.ex.., Över 1.600) som "Bone".
- En region fyllningsoperation skulle misslyckas att segmentera ryggraden eftersom den är ansluten med många andra delar av skelettet, t.ex.., Revbenen. Utför några skäroperationer genom iterativ rita klotter och trycka på F2 för att separera ryggraden från skallen, revbenen och sakrala ben.
- Slutligen, skapa en klass "Spine" och utför en region fyllningsoperation för att få ryggraden (högerklicka i ryggraden och välj ContextMenu-> Fyll Region-> Fyll region obegränsat).
- Spara segmente som en fil i the mapp av μCT-FMT scan. Använd samma namn, t.ex., organs.seg, för att möjliggöra för satsvis bearbetning.
- Välj Meny-> Statistics-> Class statistik (overlay), för att generera ett kalkylblad som innehåller den genomsnittliga fluorescensintensiteten, volymen och det totala beloppet (produkt av medelvärdet och volym) för varje klass.
- För att generera en enda kalkylblad som innehåller värden för alla regioner i alla μCT-FMT skanningar klickar du på Meny-> batch> Ange inställningar sats och klicka sedan på Meny-> batch> Batch statistik. Detta undviker insatser för att skapa och slå samman flera kalkylblad, det vill säga, en för varje μCT-FMT scan.
8. Sond Kalibrering
- För att beräkna kalibreringsfaktorn för en sond, flera μCT-FMT fantomskanningar med olika kända mängder av sonden krävs (se steg 1.4), t ex., Med 100 pmol, 50 pmol, 25 pmol och 0 pmol.
- Scan fantomer som beskrivs iavsnitt 4 och 5. Även för fantom skannar, upp och ner skannar i FMT krävs.
- Exportera data och utföra fusion och återuppbyggnad som beskrivs i avsnitt 6.
- Segment införandet med hjälp av μCT data för varje avsökning av tröskel (över 1.200) och region fyllning.
- Skapa ett kalkylblad med de uppmätta fluorescens belopp och rita dem som en funktion av de kända mängder. Beräkna lutningen av en linjär regressionsanpassning. Detta är kalibreringsfaktorn för sonden.
Representative Results
Vi tillämpade beskrivna protokollet för att bedöma biodistributionen av en riktad sond, OsteoSense, som binder till hydroxiapatit. 3 möss (C57BL / 6 ApoE - / - Ahsg - / - dubbel knockout möss, 10 veckor gamla) avbildades före och 15 minuter, 2 timmar, 4 timmar, 6 timmar och 24 timmar efter intravenös injektion av 2 nmol OsteoSense. Vår programvara upptäcks automatiskt markörerna inbyggda i den multimodala mus säng (figur 1, figur 2A, B), som gjorde det möjligt fusion av de anatomiska μCT data med fluorescens återuppbyggnad utförs av FMT (figur 2C, D). Eftersom OsteoSense är en sond med en låg molekylvikt, en snabb renal utsöndring och därför hög signal i urinblåsan förväntas. Fusion av fluorescens rekonstruktion av FMT avslöjat problem såsom felplacerad signalen utanför blåsan (figur 2C, D). Dessa problem uppstår eftersom FMT inte veta den verkliga formen på musen och antar ett blockform. Our rekonstruktion bestämmer den exakta formen från μCT uppgifterna och alstrar spridningen och absorptionen kartor 13 för att möjliggöra en mer exakt fluorescens rekonstruktion med bättre signal lokalisering, vilket är särskilt tydligt för blåsan (Figur 2E, F).
Om du vill tilldela den rekonstruerade fluorescens lämpliga områden, interaktivt segment vi flera organ använder vår mjukvara (Figur 3). För vart och ett av de 18 skanningar, var 7 regioner segmente baserat på μCT uppgifter, dvs., Hjärta, lungor, lever, njurar, ryggrad, tarmar och urinblåsa. Därefter den programvara som används för att beräkna den genomsnittliga fluorescens koncentrationen för var och en av de 126 regionerna. Lyckligtvis ger programmet en satsvis, som beräknar alla värden och sparar dem i en enda kalkylblad.
Att visualisera fluorescens fördelningen var 3D renderingar genereras för varje tidpunkt,Omräknat i jämförbara fönsterinställning (Figur 4A-F). Med hjälp av värdena kvantifierade organ var biodistribution beräknas genom att ta medelvärdet av organvärdena under tre möss (Figur 4G). De pre skannar, som förvärvats före injektion, visade försumbar bakgrundssignal. 15 min efter injektion, visade den starkaste signalen i urinblåsan, på grund av den snabba utsöndring via njurarna. Vid efterföljande tidpunkter, hade de återstående sonden ackumuleras i ben och leder.
Figur 1. Multimodal Mus säng. (A) Den multimodala mus bädden innehåller två akrylglasplattor som tätt håller musen. Åtstramningen justeras med två skruvar. Musen bädden innehåller markörer (tomma hål) för bildfusion. Anestesigas levereras med användning av ett flexibelt rör, som är fixerad med tapa. (B) Musen bädden är fäst vid en metallhållare och hålls i centrum av den roterande μCT gantryt. (C) Undvik en klyfta mellan mus säng och metallhållaren, annars, markörerna kan vara felaktigt tilldelas vilket leder till felaktig fusion. Den anestetiska gasröret bör vara fäst vid röret kontakten. (D) Musen säng bör införas i FMT med fronten först att möjliggöra en korrekt automatiserad fusion. (E) Markörerna är synliga för FMT kamera, som används för automatiserad markör upptäckt och fusion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Bild Fusion och återuppbyggnad. (A, B) markeringar och den yttre formen av mouSE bestäms av den automatiserade segmenteringsalgoritmen. (C, D) 15 min efter injektion av OsteoSense, en avsevärd mängd av sonden har redan utsöndras in i urinblåsan. Efter att smälta leverantörs försedd rekonstruktion med μCT data problem blir synliga. Det mesta av den signal uppträder runt blåsan men inte inne i blåsan och vissa signal visas även i luften. Detta händer eftersom FMT antar en blockformad mus. (E, F) Vår förbättrade fluorescens rekonstruktion med hjälp av formen på musen härrör från μCT uppgifterna, resulterar i en bättre lokalisering av fluorescens inuti blåsan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Interaktiv Organ Segmentat. jon (A) För att kvantifiera fluorescensfördelningen, är flera organ segmenterad: hjärta (röd), lunga (rosa), lever (brun), mage (beige), ryggrad (lila), njurar (gul), tarmar (grön) , och urinblåsan (guld). (B) Lung, som starkt kontrasterar jämfört med den omgivande vävnaden, segmenteras med hjälp av tröskel och region fyllning. (C) Runda organ, såsom urinblåsan, njurarna, och hjärta segmenteras med hjälp av "klotter". (D) organ med en mer komplex form, till exempel, lever och mage segmenteras stegvis med hjälp av klotter. Att segmentera ryggraden, är en hög tröskel appliceras på segmentet alla ben. Sedan några ben, till exempel., Revbenen, skärs bort, tills ryggraden kvar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Biodistribution. För att bedöma biodistribution mössen skannas vid flera tidpunkter (AF). (A) före avsökning, före injektion, visar liten bakgrundssignal i 750 nm-kanalen. (B) 15 min efter injektion, är en avsevärd mängd av sonden redan i urinblåsan. (C) Vid 2 h tidpunkt hade musen urinerat, vilket resulterar i viss fluorescens utanför musen. Vid senare tidpunkter (DF), visas signalen huvudsakligen vid ben och leder, dvs., Vid ryggraden och knäna. (G) Den kvantifierade fluorescens koncentrationen visas för utvalda organ.
Discussion
Vi beskriva och tillämpa ett protokoll för multimodal μCT-FMT avbildning. Vi använder kommersiellt tillgängliga och används i stor utsträckning FMT och μCT enheter 3,11,15 - 17,21. Medan protokollet kräver en specifik FMT kan μCT ersättas av en annan μCT med liknande funktionalitet och jämförbara inläsningsparametrarna, t.ex. bör synfältet vara tillräckligt stor för att täcka musen sängen inklusive markörer.
FMT har använts för biodistribution analys utan att kombinera det med μCT eller MRI 21 är emellertid den anatomiska data som fördelaktigt att öka reproducerbarheten, eftersom den segmente kan baseras på gränserna organ som är synliga i μCT uppgifter 10. Även integrerade μCT-FMT-enheter har utvecklats 2,7, dessa inte är kommersiellt tillgängliga ännu. Vidare har användningen av två separata anordningar tillåter rörledningar, dvs., Nästa mus can avbildas i μCT medan den första musen är fortfarande i FMT, för att öka genomströmningen.
För att minska den manuella arbetsbördan, vi utför automatiserad markör upptäckt och fusion. Dessutom är musformen automatiskt segmenterade och denna information avsevärt förbättrar fluorescens återuppbyggnad 11,13,22. För kvantitativ fluorescens rekonstruktion, är absorption och spridning kartor behövs 13,23. Vi härleda spridningskartan genom automatiserad segmentering av μCT uppgifter och tilldela kända spridningskoefficienterna flera vävnadstyper (lunga, ben, hud, fett, och återstående mjukdelar) 24. Därefter vi rekonstruera en absorption karta från den optiska rådata som är särskilt viktigt för väl perfusion organ som hjärta och lever 13,20.
Skanna flera möss vid flera tidpunkter snabbt resulterar i ett stort antal uppgifter som skall analyseras. För biodisavgiftsstudier, flera organ måste segmenteras för varje μCT-FMT scan. Olyckligtvis kan de segmenteringar inte återanvändas, eftersom musen är nyligen placerat i musen bädden upprepade gånger. Vi använder ett verktyg för interaktiv segmentering, som utvecklats vid vårt institut, men andra verktyg kan också vara lämpligt 25. Vi skapar voxel-wise segmente, eftersom dessa motsvarar bättre till komplexa organ än enkla former såsom ellipser och kuber 26. Automatiserad hela-djur segmente vore lämpligt att ytterligare minska den manuella arbetsbördan 27, men ett interaktivt segmente verktyg skulle fortfarande krävas för att korrigera för segmente fel. Dessutom kan automatiserade segmente verktyg knappast förutse specialfall såsom patologier korrekt. Eftersom vi använder infödda μCT skannar, vissa organ såsom mjälten är mycket svåra att segmentet även manuellt. Kontrastmedel skulle hjälpa, men det finns problem med tolererbarhet och det är svårt att upprätthålna stadig kontrastmedel distribution i hela den längsgående avbildning.
Vår fantom studie visar att signalen lokalisering förbättras vid användning av informationen formen för fluorescens rekonstruktion. In vivo är en liknande förbättring uppenbar för tidig tidpunkt (15 minuter efter injektion), när en stor mängd av proben redan finns i urinblåsa. Den hydroxyapatit-bindande sond ackumuleras i ben och leder. Det är anmärkningsvärt hur snabbt detta sker, det vill säga, är signalen redan väl synlig på ryggraden 15 minuter efter injektionen. Detta förmodligen orsakas av den låga molekylvikten av sonden, vilket möjliggör snabb extravasation och diffusion till målregionerna. Sonden binder kovalent till sitt mål hydroxyapatit och obunden prob utsöndras. För senare tidpunkter, mellan 6 h och 24 h efter injektion, signalintensiteten i ryggraden är relativt stabil, förmodligen, eftersom knappast något ljus revärk djupt in i musen för att bleka fluorescens. För vår studie har vi använt 750 nm-kanal, vilket resulterar i låg bakgrundsfluorescens som uppenbart för skanningar som förvärvats före injektion. Vid lägre våglängder, kan förväntas mer bakgrundssignal 28.
Sammanfattningsvis beskriver vi en multimodal avbildningsprotokoll för kommersiellt tillgängliga FMT och μCT enheter. Vi visar att kombinationen ger fördelar för fluorescens återuppbyggnad. Vi visar hur biodistributionen kurvorna extraheras från den stora mängden bilddata med hjälp av en interaktiv organsegmentering och batch-bearbetning. Vi tror att detta standardiserade arbetsflöde kan vara till hjälp för läkemedelsutveckling och andra avbildnings studier med fluorescerande prober.
Disclosures
Felix Gremse är grundare och ägare av Gremse-IT, ett nystartat företag som erbjuder mjukvara och tjänster för medicinsk bildanalys i samarbete med Philips och Institutionen för experimentell Molecular Imaging av RWTH Aachen.
Acknowledgments
Vi tackar Marek Weiler för att utföra fantom experiment. Detta arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet (ERC Starting Grant 309.495: NeoNaNo), den tyska delstaten Nordrhein-Westfalen (NRW, High-Tech.NRW/EU-Ziel 2-Programm (EFRE), ForSaTum), den tyska ministeriet för utbildning och forskning (BMBF) (finansieringsprogram Virtual Lever (0.315.743), LungSys (0315415C), LungSys2 (0316042F), Photonik Forschung Deutschland (13N13355)), i RWTH Aachen (I 3 TM Seed Fund), och Philips Research (Aachen, Tyskland).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT (Fluorescence molecular tomography) FMT2500 LX | PerkinElmer | FMT2000 | Device for fluorescence molecular tomography |
| µCT (micro computed tomography) Tomoscope Duo | CT Imaging GmbH | Tomoscope Duo | Device for micro computed tomography |
| Multimodal Mouse Bed | CT Imaging GmbH | Experimental builder | Partially transparent animal holder |
| IsoFlo (isoflurane, USP) | Abbott | 05260-05 | Isoflurane Inhalation anesthesia |
| Small animal anesthesia system | Harvard apparatus | 726419 | Complete Isoflurane Table-Top System |
| Chlorophyll-free mouse food | Ssniff | E15051 | low chlorophyll / low fluorescence food |
| OsteoSense 750EX | PerkinElmer | NEV10053EX | Animal FMT contrast agent |
| Portex Fine Bore Polythene Tubing | Smith medical | 800/100/120 | Tube for injection catheter |
| Sterican 30g | BBraun | 4656300 | Hypodermic needle for catheter |
| Imeron | Altana pharma | INLA F.1/0203/3.5337.69 | CT contrast agent for the phantom inclusions |
| Agarose | Sigma | 90-12-36-6 | Agarose for phantom production |
| TiO2 | Applichem | A1900,1000 | Titanium oxyde as phantom scattering agent |
| Trypan blue | Fluka | 93595 | Trypan blue to adjust phantom light propagation |
| Cy7 | Lumiprobe | 15020 | Fluorochrome for the phantom inclusions |
| Lipovenoes 20% | Fresenius Kabi | 3094740 | Lipid emulsion, scattering agent for FMT contrast agents |
| Definiens Developer XD Server | Definiens AG | Server XD | Software platform for automated segmentation |
| Imalytics Preclinical | ExMI/Gremse-IT | Version 2.0.1 | Software for image fusion, reconstruction and analysis |
| NVIDIA Geforce Titan | Asus | GTXTITAN6GD5 | High end computer graphics card, 6GB Memory |
References
- Hoffman, R. M., Yang, M. Subcellular imaging in the live mouse. Nature Protocols. 1 (2), 775-782 (2006).
- Ale, A., Ermolayev, V., Herzog, E., Cohrs, C., Angelis, M. H., Ntziachristos, V. FMT-XCT: in vivo animal studies with hybrid fluorescence molecular tomography-X-ray computed tomography. Nature Methods. 9 (9), 615-620 (2012).
- Eaton, V. L., Vasquez, K. O., Goings, G. E., Hunter, Z. N., Peterson, J. D., Miller, S. D. Optical tomographic imaging of near infrared imaging agents quantifies disease severity and immunomodulation of experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. Journal of Neuroinflammation. 10 (138), (2013).
- Lederle, W., Arns, S., et al. Failure of annexin-based apoptosis imaging in the assessment of antiangiogenic therapy effects. EJNMMI Research. 1 (26), (2011).
- Ntziachristos, V., Tung, C. -H., Bremer, C., Weissleder, R. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo. Nature Medicine. 8 (7), (2002).
- Hoffman, R. M. The multiple uses of fluorescent proteins to visualize cancer in vivo. Nature Reviews Cancer. 5 (10), 796-806 (2005).
- Schulz, R. B., Ale, A., et al. Hybrid system for simultaneous fluorescence and x-ray computed tomography. IEEE Transactions on Medical Imaging. 29 (2), 465-473 (2010).
- Stuker, F., Baltes, C., et al. Hybrid small animal imaging system combining magnetic resonance imaging with fluorescence tomography using single photon avalanche diode detectors. IEEE Transactions on Medical Imaging. 30 (6), 1265-1273 (2011).
- Leblond, F., Davis, S. C., Valdés, P. A., Pogue, B. W. Preclinical Whole-body Fluorescence Imaging: Review of Instruments, Methods and Applications. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 98 (1), 77-94 (2010).
- Kunjachan, S., Gremse, F., et al. Noninvasive optical imaging of nanomedicine biodistribution. ACS Nano. 7 (1), 252-262 (2013).
- Radrich, K., Ale, A., Ermolayev, V., Ntziachristos, V. Improving limited-projection-angle fluorescence molecular tomography using a co-registered x-ray computed tomography scan. Journal of Biomedical Optics. 17 (12), 126011 (2012).
- Freyer, M., Ale, A., Schulz, R. B., Zientkowska, M., Ntziachristos, V., Englmeier, K. -H. Fast automatic segmentation of anatomical structures in x-ray computed tomography images to improve fluorescence molecular tomography reconstruction. Journal of Biomedical Optics. 15 (3), 036006 (2010).
- Gremse, F., Theek, B., et al. Absorption Reconstruction Improves Biodistribution Assessment of Fluorescent Nanoprobes Using Hybrid Fluorescence-mediated Tomography. Theranostics. 4 (10), 960-971 (2014).
- Cheong, W. -F., Prahl, S. A., Welch, A. J. A review of the optical properties of biological tissues. IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2166-2185 (1990).
- Doleschel, D., Mundigl, O., et al. Targeted near-infrared imaging of the erythropoietin receptor in human lung cancer xenografts. Journal of Nuclear Medicine: Official Publication, Society of Nuclear Medicine. 53 (2), 304-311 (2012).
- Al Rawashdeh, W., Arns, S., et al. Optical tomography of MMP-activity allows a sensitive non-invasive characterization of the invasiveness and angiogenesis of SCC-xenografts. Neoplasia. 16 (3), 235-246 (2014).
- Kunjachan, S., Pola, R., et al. Passive versus Active Tumor Targeting Using RGD- and NGR-Modified Polymeric Nanomedicines. Nano Letters. 14 (2), 972-981 (2014).
- Schober, A., Nazari-Jahantigh, M., et al. MicroRNA-126-5p promotes endothelial proliferation and limits atherosclerosis by suppressing Dlk1. Nature Medicine. 20 (4), 368-376 (2014).
- Aikawa, E., Nahrendorf, M., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
- Gremse, F., Höfter, A., Schwen, L., Kiessling, F., Naumann, U. GPU-Accelerated Sparse Matrix-Matrix Multiplication by Iterative Row Merging. SIAM Journal on Scientific Computing. , C54-C71 (2015).
- Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. Quantitative Whole Body Biodistribution of Fluorescent-Labeled Agents by Non-Invasive Tomographic Imaging. PLoS ONE. 6 (6), e20594 (2011).
- Theek, B., Gremse, F., et al. Characterizing EPR-mediated passive drug targeting using contrast-enhanced functional ultrasound imaging. Journal of Controlled Release. 182 (1), 83-89 (2014).
- Hyde, D., Schulz, R., Brooks, D., Miller, E., Ntziachristos, V. Performance dependence of hybrid x-ray computed tomography/fluorescence molecular tomography on the optical forward problem. Journal of the Optical Society of America. A, Optics, Image Science, and Vision. 26 (4), 919-923 (2009).
- Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Physics in Medicine and Biology. 58 (11), R37 (2013).
- Loening, A. M., Gambhir, S. S. AMIDE: a free software tool for multimodality medical image analysis. Molecular Imaging. 2 (3), 131-137 (2003).
- Gremse, F., Schulz, V. Qualitative and Quantitative Data Analysis. Small Animal Imaging. , 363-378 (2011).
- Baiker, M., Milles, J., et al. Atlas-based whole-body segmentation of mice from low-contrast Micro-CT data. Medical Image Analysis. 14 (6), 723-737 (2010).
- Sevick-Muraca, E. M., Rasmussen, J. C. Molecular imaging with optics: primer and case for near-infrared fluorescence techniques in personalized medicine. Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041303 (2008).
