Introduction
Ubiquity av Arthrobacter arter i jord miljøer tilbyr et stort antall og mangfold av fager i stand til å være isolert fra denne arten av verts bakterier. Bakterielle medlemmer av Acintobacteriaceae familien er mest kjent for sine katabolske veier av nedverdigende gjenstridige forbindelser som atrazine og diverse andre plantevernmidler og herbicides 1,2,3. Selv om det meste av forskningen er gjort ved hjelp av miljø stammer av Arthrobacter, er kliniske isolater av denne slekten finnes i blod, urin, øyne, og mange andre menneskelige kilder alle viser fylogenetisk heterogenitet 4.
Mens det er en ganske omfattende mengde forskning på Arthrobacter bakterier, bare noen få studier rapporterer om fagene i stand til å infisere medlemmer av denne mangfoldige slekten. Interessant om, arbeidet som er gjort tidligere på Arthrobacter fager berører flere sentrale forskjellige temaer som typing av jord <em> Arthrobacter arter 5, industrielle bruksområder med det formål å redusere skadelig skum i aktivert slam renseanlegg 6, og arbeidet fremhever stedsspesifikke rekombinasjon og integrasehemmere gener 7.
Ulike berikelse teknikk protokoller har blitt ansatt for å generere ren fag isolerer i Arthrobacter arter. Tidlige prosedyrer inkluderer inkuberinger av jord med tilsatt giftige stoffer som nikotin salter for perioder på over ett år 8 gir opphav til fager som kan bare infisere A. globiformis. Studier gjort ved hjelp av jord perkolert med labile organiske syntes å gi målbare fager via plakkassay teknikker, utelate lange inkubasjonsperioder 8. Interessant om, ble en teknikk ligner direkte plating brukt tidligere ga støtet til flere fag samtidig som de har en særlig lav suksessrate av etterforskerne 5, siterer tidligere studier med lave suksessraten Samlet, isolasjonsteknikker brukt tidligere var kjent for å ha liten effekt i praksis til tross for Arthrobacter slekten som representerer den vanligste aerobic jord isolere i naturen 4,9,, Van Twest og Kropinski 10 nåværende berikelse metoder for å isolere fager fra vann og jord tilpasset fra tidligere teknikker som brukes til å berike miljø bakterieisolater men disse berikelse teknikker vist seg ineffektiv i å isolere Arthrobacter fager. Hensikten med fremgangsmåten beskrevet her er å vise "bevis på konseptet" at de tidlige berikelse metoder kan tilpasses til konsekvent og effektivt isolere Arthrobacter fager, overvinne tidligere tekniske utfordringer forbundet med å isolere fager fra dette bakteriell slekten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av Arthobacter Cells for Fag Isolation
- Kultur Arthrobacter sp. KY3901 kolonier streket på en Luria Bertaini (LB) agar plate inkubert ved 30 ° C i 2-3 dager. Plukk en koloni og bruke en steril sløyfe for å legge den til 250 ml LB buljong i en baffled kultur kolbe og inkuberes i en risting inkubator ved 225 rpm ved 30 ° C.
- Tillate ca 24 timer av vekst for å få sene eksponentiell / tidlig stasjonære fase celler for fag smitteforsøk. Overvåke tilstanden til bakterievekst tett for å forhindre celler fra å komme inn i midten til slutten av stasjonære veksttilstand.
MERK: Cellevekst bør bestå av en optisk tetthet OD 600 mellom 0.5-.0.7 for fag-isolerings- og opprenskningsprosedyrer / trinnene beskrevet nedenfor.
2. Innsamling av Fag fra jordprøver
- Samle 200-400 g av jord fra ønsket plassering. Merk: Siden bakterier i Arthrobacter slekten er vanlige jordbakterier de og de fagene som infiserer dem kan finnes i og er gjennomgående i de fleste typer jord.
- Tilsett minst 400 ml fagbuffer (PB) [68 mM NaCl, 10 mM MgSO4, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5)] til jord og bland i en stor nok kolbe slik at minst 200 ml PB er i supernatanten og er i stand til å bli ekstrahert.
- Bland forsiktig omrøring eller virvlende før jordsmonnet er suspendert og la jorda sediment å bosette, typisk 30 min.
- Bestå "jord ekstrakt" gjennom filterpapir ved gravitasjonsfiltrering for å fjerne jord sediment rusk.
- Legg LB pulver og blandes for å lage en 2% løsning (4 g LB-pulver i 200 ml jord ekstrakt).
- Passere løsningen gjennom et 0,22 mikrometer filter ved vakuumfiltrering for å oppnå et sterilt filtrat. Hvis mulig, gå videre til trinn 2.7 umiddelbart. Hvis nødvendig, lagre filtrerte prøvene ved 4 ° C i opptil en uke før du fortsetter imidlertid antall levedyktige fagpartiklervil bli redusert.
- Alikvoter flere 50 ml porsjoner av filtersterilisert LB / jord ekstraktblanding i individuelle 250 ml sterilt risting med ledeplater kulturflasker ved hjelp av aseptiske teknikker. Legg steril 2,0 M CaCl2-løsning til de endelige ønskede konsentrasjoner (0-50 mM), siden forskjellige Arthrobacter fager vokser optimalt under forskjellige CaCl 2 forhold.
MERK: Vi finner at de fleste av Arthrobacter fager som er identifisert av oss er innen området 1 mM-2,5 mM CaCl2. Imidlertid har flere av de isolerte fager vokste med oss utelukkende ved 0 mM CaCl2 .eller ved svært høye konsentrasjoner CaCl2. Fortsett umiddelbart til trinn 3.1.
3. Fag Isolation
- Legg 1 til 2,5 ml sen eksponentiell / tidlig stasjonær fase bakteriekultur til hver av kolbene. For en OD 600 0,5 til 0,7, bruker 1 ml av celler. For en OD 600 er høyere enn en OD på 0,7 bruke 2,5 mlceller.
MERK: Celler i eksponentiell fase vekst gir vanligvis flere fager og høyere titer enn celler i stasjonær fase vekst. - Rystekolber ved 250 rpm ved 30 ° C i ca. 24 timer i en rysteinkubator.
- Etter en 24 timers inkubasjonstid fjerne berikelse kolber fra risteinkubator og fortynne berikelse prøvene ti ganger i fag buffer.
- Sett opp dyrkningsrør med 0,5 ml sen eksponensiell / tidlig stasjonær fase bakteriekultur og tilsette forskjellige mengder av anrikningskultur (5 ul til 500 ul av en 10 -1 fortynning i PB) til rørene kultur.
MERK: Det anbefales å teste et bredt spekter av konsentrasjoner siden hver jordprøve genererer ulike fag titer etter berikelse. - Legg CaCl2 i kultur-rør for å lage en sluttkonsentrasjon lik konsentrasjonen til stede i den opprinnelige anrikning kolbe. Bruk en rekke forskjellige CaCl 2 -konsentrasjoner å velge for mange fager with varierende CaCl 2 avhengigheter.
MERK: De fleste fager blir isolert inne i CaCl2 området 1 til 2,5 mM, men det er fager isoleres mest optimalt hvor som helst 0-50 mM CaCl2 konsentrasjoner. På grunn av dette er det best å sjekke en rekke CaCl 2 -konsentrasjoner å maksimere antall unike isolerte Arthrobacter fager. - Bland 4,5 ml LB topp agar i kulturen rør og hell blandingen på en LB agar plate. Virvles forsiktig for å fordele over hele platen jevnt og gir mulighet for toppagar å stivne etter omtrent 15 min.
MERK: Top agar kan være forberedt på større grupper (250 ml) og ekstra topp agar kan lagres ved RT og gjenbrukes for senere eksperimenter i minst to uker. Selv om det er forskjellige formler som brukes til å lage topp agar, gjør vi topp agar bruker 7g / L av agar blandet med LB. Plasser topp agar i et 60 ° C vannbad for å holde den flytende tilstand i løpet av et eksperiment. - Inverter tHan platen og inkuber ved ønsket temperatur (temperaturen til 30 ° C) O / N til 48 timer. Variere disse forholdene for å optimalisere for fagene stede. De fleste isolerte fager kommer fra platene ble inkubert ved 30 ° C i 1 til 2,5 mM CaCl2-konsentrasjon etter en 24-timers inkubasjonsperiode.
4. Fag Rensing
- Etter en 24 timers inkubasjon sjekk for plakkdannelse på platene. Fortsett inkubasjon i opptil 72 timer hvis ingen plaketter er tydelig eller å finne ut om flere plaketter vises. Hvis det er nødvendig, lagre plater med antatte plaketter for opp til en uke ved 4 ° C før du fortsetter.
MERK: Det er ikke uvanlig å finne en rekke forskjellige plakk morfologi på én plate. Finne plaketter etter tre dagers inkubasjon er mulig, men sjelden. - Rense ønskede fager fra klart isolerte plaketter bruker strek plakett metoden. Trykk på en plakett med en steril trepinne. Strek plakett ved å kjøre en trepinne gjennom en flamme, allowing pinnen å kjøle kort, og deretter gni pinnen på agar plate i den milde bevegelse som vist i figur 1. Gjenta dette ved hjelp av en ren pinne for hver passering.
- Alternativt kan du bruke den tradisjonelle plakk titer analyse for å isolere enkelt fagplakker. Plakk titer assay krever bruk av flere reagenser slik som LB-agar og LB topp-agar og materialer som petriplater for fag-plakk isolasjon. Vi har vært svært vellykket med strek plakett metoden, men det er teknisk enklere å isolere enkelt plaketter ved hjelp av plakk titer analysen.
- Når LB agarskål har striper minst tre ganger, markere området med den laveste konsentrasjon av putative fagpartikler og forsiktig bruke 0,5 ml av Arthrobacter og 4,5 ml flytende LB topp-agar (som inneholdt den samme konsentrasjon av kalsiumklorid som moderplaten ) og la den spre seg jevnt over hele platen.
- Snu og ruge plate O / N. Gjenta strek plakkTeknikken i minst tre iterasjoner for å sikre en ren fag-arter blir isolert. Oppbevar plater ved 4 ° C i opptil en uke etter behov mellom streker uten betydelig tap av fag levedyktighet.
- Når ønskede plaketter har blitt dyrket og isolert på den siste strek plate, trykker du på ett godt isolert plakett med en mikropipette tips og re-suspendere i 100 mL PB. Serielt fortynnet dette 10 0 løsningen ut til 10 -8 fortynning ved å føre 20 ul av prøven i 180 ul av frisk PB.
- Tilsett 10 ul av hver fortynning til 0,5 ml av Arthrobacter dyrkes i et dyrkningsrøret for 5 til 10 minutter ved RT og plate ved å blande de infiserte bakterier med 4,5 ml smeltet LB topp-agar inneholdende samme konsentrasjon av CaCl2 anvendt for å isolere fagen fra den opprinnelige jordprøve. Lagre alle fortynninger gjort ved 4 ° C før neste dag.
- Bestem fagen serie fortynning som trengs for å lage en web-mønster ved hjelp av tradisjonelle plakk titer somsi. Formålet med plakk titer analysen er å bestemme fag-titeret nødvendig for å oppnå en nettmønsterplate. Identifisere en nettmønsterplate som stort sett fri for bakterier, men inneholdende rester av bakterier som ennå ikke er lysert av fager. Tilsett 5 ml av sen eksponentiell / tidlig stasjonær Arthrobacter kulturen til et sterilt 50 ml kulturflaske.
- Tilsett 100 ul av fortynningen (som ga en nettmønster til Arthrobacter kultur) i dyrkningskolben, og tillate fager for å infisere bakteriecellene etter 5 til 10 minutter ved RT. Bland med smeltet LB topp-agar inneholdende samme konsentrasjon av CaCl2 som benyttes til å begynne med å identifisere fagen og plate 5 ml av denne blandingen på 10 friske LB-plater. La stivne og ruge inverterte plater ved 30 ° C.
- Neste dag, svømme nettet mønsterplater med 5 ml av PB og store O / N ved 4 ° C eller 4 timer ved romtemperatur.
- Filtrer det fag-lysat gjennom et 0,22 um sprøytefilterog oppbevar ved 4 ° C. Bruk dette siste fag-lager for ytterligere forsøk som elektronmikroskopi bilder av fagpartikler, fagen genomisk DNA for DNA restriksjonsenzymanalyse og genomisk sekvensering ved anvendelse av standard prosedyrer. For langtidslagring av fagen lager, legge en lik mengde av faglysat til steril glyserol i små ampuller for lager arkivering ved -80 ° C.
MERK: For de som ikke har erfaring med disse fag teknikker, er en stor ressurs online tilgjengelig www.phagesdb.org nettside.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Å demonstrere reproduserbarhet av forbedret berikelse teknikk for Arthrobacter fager, ble 30 forskjellige jordprøver brukes til forskjellige tider og steder i løpet av våren og sommeren 2014. Av disse 30 jordprøver unike Arthrobacter fager ble hentet fra 22 av innsamlede jordprøver ved hjelp av denne berikelse prosedyren. Standarden anrikningsfremgangsmåte ga unike fag fra tre av de samme jordprøvene. Anrikningen prøvene kan ha en meget høy fag-titeret ønsker initial fortynning for å isolere plakk eller en forholdsvis lav fag-titeret som krever et større volum av anriket Arthrobacter for vellykket påvisning av plakk. Vi bruker plakett strek metode for å isolere rene fag populasjoner etter innledende berikelse og platekledning på LB-agar (figur 2). Alternativt kan en tradisjonell standard plaque titer assay brukes for å isolere en ren fag-isolat selv om denne metoden tar mer tid, reagenser, og materialets. Som nevnt tidligere, bruker vi plakk titer analyse for å bestemme empirisk fag-titeret tall og antallet plakkdannende enheter (PFUs) for å danne et vevet mønster på en plate. Figur 3 viser et sett med serielle fortynninger av fag-banan og viser etter en av platene hva en god web mønster bør se ut. Figur 4 viser elektronmikrofotografering av 20 Arthrobacter fager isolert med berikelse teknikk. Av de 25 fager tiden isolert, 23 av dem er siphoviruses med ganske lange haler. To av de isolerte fagene er myoviruses inneholder hodediameter lik i lengde som i halene.
Fig. 1. Serieplateteknikken skjematisk anvendt for isolering av de enkelte fag-plaques Den gule stjernen betegner det området på platen som LBtopp agar pluss bakterier oppløsning bør være nøye hellet på platen etter at fagen plakk streker har blitt fullført.
Figur 2. Eksempler på strek-plate teknikken som brukes for isolering av plaketter for en fag (Dylan) ved tre forskjellige temperaturer. Legg merke til at fagen Dylan gir lignende plaques ved RT, 30 ° C og 37 ° C. De røde sirkler på to av platene surround klart isolerte plakk.
Figur 3. Plakk titer analysen. Arthrobacter fag Banana var serie fortynnet i PB og belagt på agarplater som beskrevet i kapittel 4.6 og 4.7 i protokollen tekst. Vist er seriefortynninger T-4 til T-8 (fra toppen). Merk at the T-5 fortynning (fra bunn til topp) ga en nettmønster med bare en liten mengde av den bakterielle plenen fremdeles gjenstår. Lavere seriefortynninger (T-1 til T-3) laget klare plater med alle bakterier lysert ved fagpartikler demonstrert ved mangelen på noen bakterievekst.
Figur 4. Electron mikrofotografering av 20 Arthrobacter fager isolert med berikelse teknikk. Bildene ble tatt ved hjelp av en FEI Morgagni TEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Til tross for mange tidligere forsøk på å isolere fager i stand til å infisere Arthrobacter verter, hadde vi liten suksess ved hjelp av standard anrikningsfremgangsmåter. Generalisert metode for bakteriell berikelse utviklet og tilpasset av van Twest og Kropinski 10 å berike fager fra miljøprøver er fortsatt grunnlaget for de fleste av anrikningsfremgangsmåter. Bevis fra tidligere studier tyder på at metoder for direkte plating har produsert påvisbare plakater på stammer av Arthrobacter riktignok med svært lave suksessraten av isolasjon 5. Med den direkte pletteringsmetode, er fager utvunnet fra jordprøver i en fag-buffer og filtrert for å fjerne forurensende bakterier. Det filtrerte ekstrakt inneholdende fag-partikler ble tilsatt til den ønskede bakterieverts å tillate vertscelle infeksjon og platet uten ytterligere runder med bakterievekst og fag-amplifikasjon.
Vår berikelse teknikk er robust og optimized for relativt enkel isolering av Arthrobacter fager fra Arthrobacter sp. KY3901. Med tradisjonelle anrikningsfremgangsmåter, fager, sammen med mange forskjellige typer bakterier som er tilstede i jordprøvene, er hentet fra jord i phage-buffer og tilsatt til friskt vekstmedium med ønskede bakterieceller som brukes som vert for faginfeksjon. Ved anrikning metode, er alle jordbakterier fjernet fra jord ekstrahert fag-prøvene ved filtrering gjennom et 0,22 pM filter. De sterilfiltrert lysat som inneholdt fag-partikler, men ikke jordbakterier, blir fortynnet i 2x LB-næringsløsning med de ønskede bakterier brukt som fagen forplantnings vert. Den største forskjellen mellom vår anrikningsfremgangsmåte og andre er at det er ingen forurensende jordbakterier som konkurrerer om vekst med verts bakterier under berikelse inkubasjonstid periode. Den eneste vert jord hentet fag kan infisere er at av de ønskede verts bakterier og derfor Maximihever formen vekstpotensialet i vertsbakterier og forsterkning av de ønskede vertsspesifikke fager.
Ved utvikling av fremgangsmåten beskrevet her vi forsøkte å gjøre rede for selektiv forspenning iboende i en hvilken som helst anrikningsfremgangsmåte ved å teste en rekke CaCl 2 11 konsentrasjoner. Hva ble klart, er at enkelte fag-isolatene viser fysiologiske forskjeller avhengig av parametre som kalsium-ion-konsentrasjon og temperatur. For fremtidige Arthrobacter fag isoleringer vi planlegger å teste viktige faktorer som som pH, temperatur, saltholdighet, næringssalter, toverdige metallioner for å isolere fager som kan gjengi i sine verter optimalt under ulike miljøforhold.
Vi bruker fersk vokst Arthrobacter celler i dette eksperimentet. Vi bruker ikke celler som når midten til slutten av stasjonær vekstfase siden vi har hatt problemer med å isolere fag eller å ha anstendig titre med kjente fager på ther vekstperioden. Andre har vist en inhibering av fag-infeksjon i stasjonær fase Achromobacter celler 12 som kan forklare den manglende suksess med å isolere fager som ved hjelp av bakterieceller i midten sen stasjonær vekstfase. Vi har hatt suksess ved hjelp av kulturer for disse eksperimentene med en celletetthet alt fra en OD6 00 på 0,5 til 0,9. Dyrkede kulturer blir lagret ved 4 ° C, og kan brukes til fagen isolert opp til syv dager. Imidlertid er jo lenger Arthrobacter cellene lagret ved 4 ° C jo lavere titer og brast størrelsen av infeksiøse fagpartikler. Lignende resultater ble funnet med hjelp av Escherichia coli for infeksjon av phageT4 13. Derfor er ved hjelp av bakterieceller så snart som mulig etter at de når den ønskede vekst maksimerer sjansene for å få et nytt fag fra en jordprøve.
Grovt sagt, bruk av denne berikelse teknikken med LB media skulle vise seg å være knapteksklusivt til isolering av Arthrobacter fager. Mens LB har vært bransjens standard for dyrking E. coli-stammer og andre medlemmer av Enterobacteriaceae, den støtter veksten av et bredt spekter av bakterier i aerobe forhold 14. Kan trolig brukes næringsrike sammensetningen av LB media i denne metoden til å forplante fager i et utrolig variert gruppe av aerobe bakterier som hindrer tekniske utfordringer fra hindrer fag oppdagelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Tilskudd til utvikling av denne protokollen ble gitt av Sørøst Pennsylvania Consortium for høyere utdanning og Cabrini College Science Department. Ytterligere finansiering og støtte kom fra Arcadia University og Immaculata University. Vi vil spesielt takke Dr. Karen Snetselaar ved St. Joseph Universitetet for bes ta elektron mikroskopiske bilder av våre isolerte fager. Ekstra støtte ble gitt av Howard Hughes Medical Institute Science Education Alliance Fag Hunters Advancing Genomics and Evolutionary Science (SEA-fag) program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth powder | Fisher | BP9722-2 | It's best to order these in bulk. |
| Granulated Agar | Fisher | BP1423-2 | It's best to order these in bulk. |
| 0.22 um syringe filters | Fisher | 09-719A | |
| 0.22 um buchner filters | Fisher | 430320 | More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube. |
| Eppendorf Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 5 ml pipets individual | Fisher | 13-678-11D | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 76002844 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 76002845 | |
| 10 ml pipets individual | Fisher | 13-676-10J | |
| 25 ml pipets individual | Fisher | 13-676-10K | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher | 1001-824 |
References
- Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).
- Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil. J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).
- Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine. Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).
- Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).
- Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters. Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).
- Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).
- Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70. J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).
- Casida, L. E., Liu, K. C. Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil. J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).
- Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis. J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).
- Twest, R., Kropinski, A. M. Bacteriophage Enrichment from Soil and Water. Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).
- Fullner, K. J., Hatfull, G. F. Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria. Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).
- Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells. J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).
- Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age. Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).
- MacWilliams, M. P., Liao, M. K. Luria Broth (LB) and Luria Agar, Media and Their Uses Protocol. ASM MicrobeLibrary. , Available from: http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli (2013).
