Abstract
Гистологическая оценка мышечных биопсий служил в качестве незаменимого инструмента в понимании развития и прогрессирования патологии нервно-мышечных расстройств. Тем не менее, для того, чтобы сделать это, правильный уход должны быть приняты, когда иссечение и сохранение тканей для достижения оптимального окрашивания. Один из способов сохранения тканей включает фиксации тканей в формальдегид, а затем встраивания их парафином. Этот метод сохраняет морфологию также и позволяет длительное хранение при комнатной температуре, но громоздка и требует обработки токсичными химикатами. Кроме того, результаты формальдегида фиксации в антигена сшивки, что требует протоколы антиген извлечения для эффективного иммунного окрашивания. Напротив, замороженные секционирование не требует фиксации и, таким образом, сохраняет биологическую конформацию антигена. Этот метод также обеспечивает явное преимущество в быстрой свою очередь вокруг времени, что делает его особенно полезным в ситуациях, требующих быстрого гистологическая оценка как intraoperaного хирургических биопсий. Здесь мы опишем наиболее эффективный способ получения мышечной биопсии для визуализации с различными гистологическими и иммунологическими пятен.
Introduction
Экспертиза мышечной гистологии играет важную роль в понимании различных типов нервно-мышечных расстройств 1-4. В сочетании с другими методами, что позволяет исследователям получить лучшее представление о проявлении и прогрессирования патологии, а также может иметь важное значение для оценки эффективности терапевтического вмешательства 5-10. Однако, чтобы быть точным, ткани должны быть сохранены в надлежащем порядке, с тем чтобы сохранить физиологическое состояние непосредственно перед удалением. Это требует большой осторожности во время удаления, сохранения, секционирования и окрашивания.
Ткани могут быть получены двумя различными способами для легкой микроскопическом исследовании. Первый способ, фиксированных формалином парафин (FFPE) секции, требуется ткани, чтобы быть фиксировали в 10% буферном растворе формальдегида природного прежде чем с встроенной парафина 11,12. Шаг фиксация помогает сохранить морфологию лучше, но также перекрестные ссылки эндогенного прoteins что требует сложная антиген извлечения процедуры иммунным и исключая возможность окрашивания ферментативной на таких участках 12. Замороженные срезы, с другой стороны, не должны быть предварительно обработаны или фиксированной; Поэтому, белки способны удерживать родные биологические конформации 13,14. Кроме того, замороженные срезы также позволяют быстро времени оборота, что в некоторых случаях необходимо, например, в интраоперационной диагностике сарком и других хирургических биопсий 15. Тем не менее, если не сделано должным образом, этот метод склонен к заморозить ущерб, который вносит изменения в мышечной архитектуре, делая секции непригодным для гистологического исследования. Эта статья будет выделить наиболее эффективный способ получения мышечной биопсии для того, чтобы достичь оптимального окрашивания для тщательного осмотра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ткань Урожай и замораживание мышечных тканей
- Эвтаназии мышь с передозировкой изофлуран (2-хлор-2- (дифторметокси) -1,1,1-трифтор-этан). Выполните этот шаг в вытяжном шкафу и использовать дополнительный метод сдерживания, такие как эксикаторе или колпаком, содержащей ватным тампоном, смоченным в ИФ.
- Подтвердите смерть, крепко сжимая в подушечку лапы. Используйте дополнительный метод эвтаназии, таких как рак шейки матки дислокации.
- Намочите шерсть с 70% -ным спиртом, чтобы уменьшить прилипание сыпучих пряди волос на мышцы. Очистите кожу с помощью лимба тонких щипцов, таких как # 5.
- Осторожно отделите мышцу интерес (передней большеберцовой (TA) в данном случае) из костей внизу, начиная с сухожилия и удалить.
- Акцизный мышцы, закройте его в ОСТ (Оптимальная температура для резки соединение), и положите его плашмя на меченым одноразовой формы замерзания. Убедитесь, что мышцы на его нормальное физиологическое положение (головой к тайл), не растягивая. Кроме того, заморозить мышцы на маленьких площадях пенополистирола и закрепить его с помощью насекомых булавками, чтобы обеспечить правильную длину мышц.
- Холод 2-метилбутан (изопентана) в стальной стакан с использованием жидкого азота. Это займет в среднем 3 - 5 мин. Продолжайте перемешивание с перерывами до белого осадка не начнут образовываться на дне и стенках стакана.
Примечание: Когда это происходит, изопентан достигла оптимальной температуры замерзания (-150 ° С) - Опустите форм, содержащих мышцы в охлажденной 2-метилбутана. Замораживание мелкие мышцы, такие как диафрагма и разгибатель большого пальца (EDL) для 6 - 12 сек и более крупных мышц, как икроножной камбаловидной (GS) и трицепс для 15 - 20 сек. Не замораживать мышцы слишком долго, так как это может привести к растрескиванию.
- Передача замороженных тканей на сухом льду и пусть изопентан испаряются (обратите внимание, что этот процесс занимает в среднем около 15 - 20 мин). Оберните тканей в алюминиевую фольгу и хранить их в ULTRA низкая температура (-70 ° С до -80 ° С) до секционирования.
2. Внедрение тканей в октябре подготовить тканей блок
- Транспорт ткани на сухом льду, чтобы предотвратить cyrostat оттаивания. Передача ткани в криостате камеры (набор от -20 до -24 ° С, чтобы избежать полного оттаивания тканей), и пусть они уравновешивают в течение 30 мин.
- Поверните отсек Пельтье охлаждения на. Если криостат не имеет этой охлаждение, используйте спрей охлаждения аэрозоля быстро заморозить октября Не позволяйте мышц оттепель в любой момент в течение вложения, так как это может привести к повреждению замораживания.
- Добавить равномерное тонкий слой ОКТ на диске образца и дайте ему остыть. Когда большинство из центра развертывания заморожен на дно, а еще жидкость сверху, вставьте ткань на правильной ориентации (перпендикулярно по октябрь для поперечных сечений и параллельно по октябрь для продольных секций). Используйте спрей охлаждения аэрозоля быстро заморозить Office. Нажмите unembeded часть ткани с тепловым добractor и ждать в течение 45 сек.
- Добавить еще один тонкий слой ОКТ вокруг мышц, спрей с распылителем охлаждения аэрозоля и извлекать тепло, как в предыдущем шаге.
- Продолжайте добавлять октября небольшими порциями и быстро заморозить центра развертывания с использованием комбинации аэрозоля охлаждения спрей и тепла экстрактор, пока вся мышца покрыта.
- Положить тепла экстрактор на верхней части блока тканей и ждать в течение 5 мин.
3. Подготовка секций и Выявление Разделы с середины живота области мышц
- Установите образец на образец голове. Затянуть ручку, чтобы закрепить диск. Убедитесь, что образец диск находится в хорошем контакте с образцом руководителя.
- Отрегулируйте температуру в камере до -21 и между -24 ° C и подождите, пока заданная температура не будет достигнута.
- Настройте параметры толщины (7 мкм); отделка блок по продвижению или втягивания блока с помощью грубой и тонкой настройки.
- Соберите разделына предварительно нагревают положительно заряженные предметные стекла, нажав на верхнюю часть слайда на участках, используя притяжение между противоположными зарядами, чтобы облегчить адгезию отрезанных секций с ползуном.
- Определение секции середине живота путем измерения площади поперечного сечения (CSA) секций. Делайте это, используя программное обеспечение обработки изображений на компьютере, подключенном к микроскопу.
ПРИМЕЧАНИЕ: фазового контраста изображения взяты и окружность всей мышцы измеряется с помощью функции отслеживания на программе. Это даст как CSA, а также минимальный диаметр хорька (меру волокна размером поперечного сечения, что выражается в виде наименьшего расстояния между двумя параллельными касательными на противоположных сторонах частицы) измерений. Примечание: При CSA и минимальный диаметр хорек измерения начинают плато, в середине живота была достигнута. - Инвентаризация и архив слайды при температуре -80 ° C для дальнейшего окрашивания.
Примечание: Окт не должны быть удалены до staininг процедуры. После того, как слайды coverslipped, они готовы быть окрашены немедленно.
4. Окрашивание
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как подробные шаг за шагом процедуры могут быть найдены на спецификации и должны следовать за процедурами окрашивания, личный оптимизация может потребоваться для получения оптимального окрашивания.
- Из-за монтажа информации (смотри таблицу) не смешивается с водой, обезвоживают слайды посредством увеличения сортов спирта (2 мин каждый в 70%, 95% и 100% этанола) и очистить их с ксилолом (100% в течение 5 мин), чтобы обеспечить слайды не становятся непрозрачными в течение долгого времени.
- Покровное разделы и дайте им высохнуть. Изображение с микроскопа оснащены ПО для обработки изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Установка для сбора и замораживания тканей можно увидеть на рисунке 1. Вырезанные ткани должны храниться на марлю, пропитанную PBS, чтобы избежать высыхания (рис 1А). Когда ткани выбирают так, чтобы быть использованы для гистологического анализа они должны быть погружены в ОСТ и раскладывают на крио плесени в правильной ориентации, и как можно ближе к физиологическому длины, насколько это возможно, чтобы обеспечить точную морфологию (Фигура 1В). Шлам изопентана, подходящей для замораживания тканей может быть достигнуто путем охлаждения изопентан в жидком азоте и перемешивание до тех пор, мелкие белые осадки не появляются в нижней части. В этот момент, носитель пригоден для замораживания (рисунок 1c). Ткани должны быть заморожены из 6-15 сек в охлажденном изопентана в зависимости от размера / толщины ткани (рис 1D). После замораживания, мышцы появятся меловой белый, на котором указать его следует хранить в сухом льду, а затем переведен в -80 <сильный> ° С с морозильной камерой.
Установка Криостат и ингредиенты, необходимые для подготовки мышц блок за счет постепенного встраивания ткани в OCT показаны на рисунке 2. Криостата должен быть установлен между -20 и -24 ° C (фиг.2А). ОКТ и замерзания Она должна быть легко доступна, чтобы создать блок подходит для секционирования. Внутри криостата должны иметь небольшие кисти, чтобы манипулировать и сплющиваются вырезать разделы для создания слайд-как пинцет для обработки тканей блока, потому что это никогда не должно быть затронуты с руками, чтобы обеспечить ткани остается замороженной (рис 2B). ОКТ должен быть добавлен к ткани, чтобы создать блок секционирования, но должны быть немедленно заморожены при лиофильной Это распылением, а затем дополнительно охлаждают с тепловой экстрактор изображенный здесь (фиг.2с). Для поперечных сечений, ткань должна быть помещена на голову образца так, что она ориентирована перпендикулярно к лезвию (Рис 2D). СеНастройки фотокамеры должны быть скорректированы, чтобы достичь желаемой толщины раздел (5-10 мкм в зависимости от ткани).
Если заморожены правильно тканей лица должны быть меловой белый, а ткань, которая была заморожена или неправильно таял в процессе монтажа появятся красный / розовый. Рисунок 3 показывает типичные ткани для ненадлежащем обращении образцов (рис 3а) и надлежащим образом образцы (3В) ,
В середине области живота определяется путем измерения CSA и минимальный диаметр хорька с помощью микроскопа, снабженного контрастных оптики фазе и программного обеспечения для анализа изображений. Представитель скриншот программного обеспечения для анализа показано на рисунке 4. Гематоксилин-эозином окрашенных образов правильно замороженной и секционного биопсии наряду с замораживанием поврежденного биопсии передней большеберцовой (TA) мышцы показано на рисунке 5. Разделы, которые должным образом обработаны будет соответствует morpholoГр и даже окрашивания всей (5А). Неправильно обрабатываются мышцы, которые замораживания поврежденные или преждевременно размороженные, будет иметь несколько перерывов в морфологии и имеют вид "измельченной пшеницы" (рис 5B). На рисунке 6 показан влажной камере для оптимального иммунной окраски. Слайды должны быть покрыты парафином, хранится на мокрую бумажным полотенцем, и запечатаны в небольшой коробке, чтобы избежать высыхания во время разделов иммунным. Рисунок 7 изображает пример иммуногистохимии слайд, который был должным образом подготовлен и окрашивали.
Рисунок 1. Подготовка и созданы для правильного замораживания тканей. () Вырезали ткани должны храниться на марлю, пропитанную PBS. (Б) тканей selectedfor гистологическихАнализ ближнего в ОСТ и выложил на крио формы в правильной ориентации (от живота к сухожилия) и как можно ближе к физиологическому длины, как это возможно. (С) Шлам изопентана подходит для ткани. Примечание: маленькие белые осадки появляются в нижней части. (D) Замороженные ткани после погружения в изопентана. Примечание:. Меловой белый цвет Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. КРИОСТАТ настройки и ингредиенты, необходимые для секционирования. (А) Криостат установлен между -20 и -24 ° С октября до аэрозоль охлаждения легко доступны. (B), Внутри установки криостата в комплекте с маленькими кистями, чтобы манипулировать и сгладить вырезать sectiДополнения для принятия слайд, а также пинцет для обработки тканей блока. (С) Замороженные ткани блок готов к охлаждается тепла вытяжного (белая стрелка). (D) тканей блок установлен на монтажной головки готовы быть сокращены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Типичные ткани правильно и неправильно сохранившихся мышц. () Неправильно замороженные или обрабатываются (Б) Правильно замороженные и обрабатываются мышцы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Определение площади поперечного сечения мышцы, используя программное обеспечение TA изображений Nikon. Скриншот фазового контраста изображения раздела мышц, которые были обведены помощью себе программное обеспечение для измерения CSA и мин диаметром хорька. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура.
Рисунок 5. Типичные изображения правильно и неправильно приготовленных Н & Е, окрашенных мышц. (A) должным образом обработаны раздел. (Б) Неправильно обрабатываются замораживания повреждения мышц раздел. Пожалуйста, CLIск здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. влажной камере подходит для иммунной окраски. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. Пример иммуногистохимии слайд правильно подготовленной и окрашенных слайдов. Slide была окрашивали фибронектина (зеленый) и DAPI (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гистологии и иммуногистохимии были использованы в качестве основных инструментов в понимании проявление и прогрессирование патологии в различных нервно-мышечных нарушений. Классически, мышечные биопсии были впервые зафиксированы в формальдегид, а затем с встроенной парафина. В то время как формальдегид фиксация сохраняет архитектуру ткани и позволяет хранить тканей и транспорта при комнатной температуре, он также инактивирует ферменты и белки, требующими сшивок дальнейшие шаги для достижения точной иммуноокрашивания. Эта проблема устранена с использованием замороженных секций, но этот метод представляет собой уникальные технические проблемы в получении оптимальных результатов окрашивания и точной интерпретации 14,15.
Во-первых, важно, что образцы будут заморожены сразу после хирургического иссечения, как автолиза и разложение начаться в ближайшее время после удаления из организма. Ткани также должны быть быстро и тщательно заморожены для надлежащего количества времени, которое меняется в зависимости от размера/ Толщина ткани. Если это не будет сделано правильно, замораживать ущерб будет происходить оказание ткани для гистологического бесполезный оценки. После замораживания, ткани должны быть немедленно хранить на сухом льду, а затем переведен в ультра низкой температуре (-80 ° С) до тех пор, морозильной секционирования. Важно отметить, что ткани не должны быть удалены из морозильной камеры без на сухом льду, потому что при замораживании-оттаивании также повредить ткани архитектуру.
Еще одно замечание важно при выполнении гистологический анализ, чтобы заботиться, чтобы всегда анализировать ту же часть интересующей ткани, чтобы обеспечить единообразие среди анализа. Это может быть сделано для секций мышц путем выполнения анализа midbelly. Это часть мышцы, что является самым толстым и, следовательно, будут иметь наибольшую площадь поперечного сечения. Для того, чтобы гарантировать, что вы действительно секционирования midbelly, CSA последующих разделах должны быть измерены с использованием гистологической обработки изображений. MeasuremЭнты должны продолжать быть до площадь поперечного сечения не начинает плато. Как только это происходит, в середине живота была достигнута; только эта часть ткани должны быть использованы для гистологического анализа, чтобы обеспечить единообразие среди сравнений.
После секционирования была завершена, и горки были подготовлены, они должны иметь возможность высохнуть при комнатной температуре в течение 1 - 2 часов. Сушка позволяет должным образом присоединения секции до слайда, а также предотвращает избыточную воду для кристаллизации следующей передачи до -80 ° C морозильнике. Важно отметить, что скользит также должны быть обработаны только на сухом льду при выборе слайдов для анализа, чтобы предотвратить циклов замораживания-оттаивания. После того, как слайды были отобраны окрашивания, протоколы включены пятно должно следовать в первую очередь на экспериментальной основе до тех пор, оптимальные результаты не были достигнуты. При выполнении иммуноокрашивания, важно, чтобы убедиться, горки не сушить в течение всей процедуры. Сушка слайдов может привести к транзиторной взаимодействияс оставаться нетронутыми после инкубации. Эти взаимодействия не могут быть удалены в ходе промывки и приводит к неспецифическое окрашивание. Сушку можно избежать, сохраняя слайды в увлажненной атмосфере. Выполнение инкубации с участков, покрытых парафином и скользит по влажной бумажной салфеткой запечатан в небольшой коробке слайд достаточно для обеспечения слайдов не высохнет в любой момент во время процедуры.
Гистология является важным инструментом в визуализации морфологии и различные аспекты патологии. В то время как несколько тривиально, это имеет огромное значение взять большую заботу в подготовке тканей, которые будут использоваться для гистологического исследования. С удалением от замерзания, секционирования и окрашивания, ткани должны быть обработаны таким образом, что позволит избежать замораживания ущерб и получить наиболее точные изображения возможно. Без надлежащего сохранения, окрашивание не будут точно отражать физиологию и, следовательно, привести к неправильному толкованию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
References
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N.
- Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
- Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
- Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
- Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779 (2012).
- Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
- Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
- Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14 (2014).
- Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
- Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P.
- Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
- Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).
