Abstract
Histologische Bewertung von Muskelbiopsien wurde als unverzichtbares Instrument für das Verständnis der Entwicklung und Progression von Pathologie der neuromuskulären Erkrankungen serviert. Um dies zu tun, muss jedoch die richtige Pflege, wenn das Ausschneiden und die Erhaltung Gewebe, um eine optimale Färbung erreichen ergriffen werden. Eine Methode der Gewebekonservierung beinhaltet Befestigungs Gewebe in Formaldehyd und dann Einbettung mit Paraffinwachs. Dieses Verfahren bewahrt Morphologie gut und ermöglicht langfristige Lagerung bei Raumtemperatur, ist aber umständlich und erfordert Umgang mit giftigen Chemikalien. Ferner Formaldehydfixierung ergibt Antigen Vernetzung, die Antigen-Retrieval-Protokolle für eine wirksame Immunfärbung erfordert. Im Gegenteil, ist gefrorene Schnitte nicht Fixierung erfordern und somit behält biologischen Antigen-Konformation. Dieses Verfahren stellt auch einen entscheidenden Vorteil in der schnellen Durchlaufzeit, so dass es besonders hilfreich in Situationen, brauchen schnelle histologische Auswertung wie intraoperative chirurgischen Biopsien. Hier beschreiben wir die effektivste Methode zur Herstellung von Muskelbiopsien zur Visualisierung mit unterschiedlichen histologischen und immunologischen Flecken.
Introduction
Prüfung der Muskel Histologie spielt eine entscheidende Rolle für das Verständnis der verschiedenen Arten von neuromuskulären Störungen 1-4. Wenn sie mit anderen Techniken kombiniert, erlaubt es Forschern, eine bessere Vorstellung von der Manifestation und Progression der Pathologie zu bekommen und kann auch wichtig sein, um die Wirksamkeit eines therapeutischen Interventions 5-10 bewerten. Jedoch genau zu sein, müssen die Gewebe in der richtigen Art und Weise gespeichert, die den physiologischen Zustand unmittelbar vor dem Herausschneiden erhalten. Dies erfordert große Sorgfalt bei der Entnahme, Konservierung, Schnitte, und Färbung.
Gewebe können auf zwei verschiedenen Wegen für lichtmikroskopische Untersuchung vorbereitet werden. Das erste Verfahren, Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Abschnitten erfordert Gewebe in 10% gepuffertem Formaldehyd natürlichen bevor sie mit Paraffin eingebettet 11,12 fixiert werden. Der Fixierungsschritt hilft, Morphologie besser zu bewahren, sondern auch Querverbindungen endogenen proteins macht es erforderlich komplizierte Antigen-Retrieval-Verfahren für die Immunfärbung und die Beseitigung der Möglichkeit der enzymatischen Flecken auf solche Abschnitte 12. Gefrierschnitte andererseits brauchen nicht vor, eine feste oder verarbeitet werden sollen; daher sind Proteine in der Lage, native biologische Konformationen 13,14 beibehalten. Ferner gefrorene Schnitte auch schnelle Durchlaufzeit, die manchmal notwendig ist, beispielsweise in der intraoperativen Diagnose von Sarkomen und anderen chirurgischen Biopsien 15 ermöglichen. , Wenn nicht richtig gemacht, Diese Methode ist jedoch anfällig für Schäden, die Änderungen an Muskel-Architektur macht die Abschnitte ungeeignet für die histologische Untersuchung stellt einfrieren. Dieses Papier wird die effektivste Methode, um Muskelbiopsien, um eine optimale Färbung für die ordnungsgemäße Prüfung zu erreichen vorbereiten zu skizzieren.
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Protocol
1. Tissue Ernte und Einfrieren von Muskelgewebe
- Euthanize die Maus mit einer Überdosis Isofluran (2-Chlor-2- (difluormethoxy) -1,1,1-trifluor-ethan). Führen Sie diesen Schritt in einem Abzug und verwenden Sie eine Auffangverfahren, wie einem Exsikkator oder einer Glasglocke, die ein Wattestäbchen in Isofluran getränkt.
- Tod Bestätigen fest drückte Fußballen. Verwenden Sie eine sekundäre Methode der Euthanasie wie Genickbruch.
- Befeuchten Sie das Fell mit 70% Alkohol, um das Anhaften von losen Haarsträhnen auf die Muskeln zu reduzieren. Schälen Sie die Haut von dem Schenkel mit einer feinen Pinzette, wie # 5.
- Trennen Sie vorsichtig die Muskeln von Interesse (tibialis anterior (TA) in diesem Fall) von den Knochen unter, ausgehend von der Sehne und zu entfernen.
- Auszuschneiden den Muskel, bedecken Sie es in OCT (optimale Schnitt Temperatur-Verbindung), und legen Sie ihn flach auf einem markierten Einweggefrierform. Stellen Sie sicher, dass der Muskel an seinem normalen physiologischen Orientierung (Kopf bis tail) ohne Dehnung. Alternativ einfrieren den Muskel auf kleinen Styropor-Plätze und stecken Sie es mit Insektenstifte auf die richtige Länge der Muskeln zu gewährleisten.
- Chill-2-Methylbutan (Isopentan) in einem Stahlbecher mit Hilfe von flüssigem Stickstoff. Dies dauert im Durchschnitt 3-5 min. Halten Sie das Rühren mit Unterbrechungen bis weiße Niederschläge beginnen, sich auf den Boden und die Wände des Bechers zu bilden.
HINWEIS: Wenn dies geschieht, Isopentan optimale Gefriertemperatur erreicht hat (150 ° C) - Tauchen Die Formen, die Muskeln in der gekühlten 2-Methylbutan. Einfrieren kleinen Muskeln, wie der Membran und extensor digitorum longus (EDL) für 6-12 sec und größere Muskeln wie gastrocnemius soleus (GS) und Trizeps für 15-20 sec. Die Muskeln Nicht einfrieren zu lange, da dies zu Rissen führen.
- Übertragen Sie die gefrorenen Gewebe auf Trockeneis und lassen Sie die Isopentan verdampft (beachten Sie, dass dieser Prozess dauert im Durchschnitt etwa 15 bis 20 min). Wickeln Sie das Gewebe in Aluminiumfolie und im Kühlschrank bei ultra niedriger Temperatur (-70 ° C bis -80 ° C) bis zum Schneiden.
2. Einbindung der Gewebe in OCT zu Tissue-Block vorbereiten
- Transport Gewebe auf Trockeneis zu cyrostat zu Auftauen zu verhindern. Transfer Gewebe Kryostatkammer (bei -20 bis -24 ° C eingestellt, um volle Auftauen der Gewebe zu vermeiden) und lassen Sie sie für 30 Minuten ins Gleichgewicht kommen.
- Drehen Sie das Peltier-Kühlschacht auf. Wenn der Kryostat nicht diese Kühlung haben, verwenden Aerosolkühlspray, schnell einfrieren Oktober Lassen Sie sich nicht den Muskel Tauwetter zu irgendeinem Zeitpunkt während der Einbettung, da dies zu Frostschäden führen.
- Fügen Sie eine gleichmäßige dünne Schicht von Oktober auf der Probenscheibe und abkühlen lassen. Wenn die meisten der Oktober ist auf dem Boden, während immer noch Flüssigkeit auf der Oberseite eingefroren, legen Sie die Gewebe an der richtigen Ausrichtung (senkrecht zur OCT zur Querabschnitte und parallel Oktober für Längsschnitte). Benutzen Sie Aerosol-Kühlspray, schnell einfrieren Oktober Tippen Sie auf die unembeded Teil des Gewebes mit Wärme extRactor und warten Sie 45 Sekunden.
- Fügen Sie eine weitere dünne Schicht Oktober rund um die Muskeln, Aerosolspray mit Kühlspray und extrahieren Sie die Hitze wie im vorherigen Schritt.
- Halten Sie das Hinzufügen Oktober in kleinen Schritten und schnell einfrieren des OAT mit einer Kombination von Aerosol-Kühlspray und Wärmeableitblock bis der ganze Muskel wird abgedeckt.
- Legen Sie die Wärmeableitblock auf der Oberseite der Gewebeblock, und warten Sie 5 Minuten.
3. Vorbereitung Profile und Identifizieren der Teile von Mid-Bauch Region der Muskeln
- Montieren Sie die Probe auf die Probe Kopf. Ziehen Sie den Knopf, um die Disc zu sichern. Stellen Sie sicher, dass die Objektplatte ist in einem guten Kontakt mit dem Objektkopf.
- Passen Sie die Raumtemperatur zwischen -21 und -24 ° C, und warten Sie, bis die eingestellte Temperatur erreicht ist.
- Passen Sie die Einstellungen Dicke (7 & mgr; m); schneiden Sie den Block durch Vorschieben oder Zurückziehen des Blocks mit Grob- und Feineinstellungen.
- Sammeln Sie die AbschnitteAuf vorgewärmten positiv geladenen Objektträgern durch Drücken der Oberseite des Schiebers auf die Abschnitte mit der Anziehung zwischen entgegengesetzten Ladungen, um die Haftung der ausgeschnittenen Abschnitte zu der Folie zu erleichtern.
- Identifizieren Sie die Mitte der Bauchabschnitte durch Messung Querschnittsfläche (CSA) der Abschnitte. Tun Sie dies mit Imaging-Software auf dem Computer, an das Mikroskop angeschlossen ist.
HINWEIS: Phasenkontrastbilder aufgenommen und Umfang des gesamten Muskel wird über eine Rückverfolgung-Funktion auf dem Software-Programm gemessen. Dies wird sowohl CSA sowie minimale Frettchen Messer (Maß für die Faserquerschnittsgröße, die als der kleinste Abstand zwischen zwei parallelen Tangenten an gegenüberliegenden Seiten eines Teilchens ausgedrückt wird) Messungen zu erhalten. Hinweis: Bei der CSA und Frettchen Mindestdurchmessermessungen beginnen, Plateau, hat Mitte Bauch erreicht ist. - Inventur und Archivierung der Objektträger bei -80 ° C für die künftige Färbung.
HINWEIS: Oktober muss nicht vor der entfernt werden, um staining Verfahren. Sobald Folien eingedeckt werden, sind sie bereit, sofort gefärbt werden.
4. Die Färbung
HINWEIS: Während ausführliche Schritt-für-Schritt-Verfahren finden Sie auf der Produkt-Datenblatt entnommen werden und sollte für Färbeverfahren befolgt werden, können persönliche Optimierung erforderlich, um eine optimale Färbung zu erhalten.
- Da die Montage Medien (siehe Tabelle) ist nicht mit Wasser mischbar ist, dehydrieren gleitet durch zunehmende Grade von Alkohol (2 min jeweils in 70%, 95% und 100% Ethanol), und deaktivieren Sie sie mit Xylol (100% für 5 Minuten), um sicherzustellen, Dias nicht undurchsichtig über die Zeit.
- Deckglas Sektionen und trocknen lassen. Bild mit Mikroskop mit Bildbearbeitungssoftware ausgestattet.
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Representative Results
Das Set-up für die Ernte und das Einfrieren von Gewebe kann in 1 gesehen werden kann. Entfernte Gewebe sollte auf eine Gaze in PBS eingeweicht, um das Trocknen (1A) zu vermeiden, gespeichert werden. Werden die Gewebe so ausgewählt sind, für die histologische Analyse verwendet werden, sollten in OCT eingetaucht werden und auf Kryo Form gelegt in der richtigen Orientierung und so nahe physiologischen Länge möglichst genaue Morphologie (1B) zu gewährleisten. Aufschlämmung von Isopentan geeignet für Gewebe Gefrieren kann durch Kühlung Isopentan in flüssigem Stickstoff und Rühren bis sich kleine weiße Niederschläge am Boden erscheint erreicht werden. An diesem Punkt ist die Medien eignet sich zum Einfrieren (Abbildung 1c). Gewebe sollten 6-15 sec in gekühltem Isopentan abhängig von der Größe / Stärke des Gewebes (1D) eingefroren werden. Nach dem Gefrieren wird der Muskel kalkweiß an welcher Stelle es sollte auf Trockeneis gelagert werden angezeigt und später übertragen auf -80 <strong> ° C Tiefkühltruhe.
Kryostat-Einstellung und Zutaten für die Zubereitung der Muskel-Block durch die schrittweise Einbetten des Gewebes im Oktober erforderlich sind in Abbildung 2 dargestellt. Der Kryostat sollte zwischen -20 und -24 ° C (Abbildung 2A) festgelegt werden. Oktober und gefrier Es sollte leicht zugänglich Block geeignet zum Schneiden zu schaffen. Im Inneren des Kryostaten sollten kleine Bürsten zu manipulieren und zu glätten Zuschnitte für Dia machen und Pinzette zur Handhabung von Gewebeblock, weil sie niemals mit den Händen berührt, um das Gewebe zu gewährleisten müssen eingefroren (2B). OCT sollte, um Gewebe hinzugefügt, um Schnittblock zu erstellen, sondern muss sofort eingefroren mit gefrier Es sprühen und dann weiter mit Wärmeschleuder hier abgebildet (Abbildung 2C) gekühlt werden. Für Querschnitte sollten Gewebe auf der Objektkopf, so daß sie senkrecht zu der Klinge (2D) ausgerichtet ist, platziert werden. SeArmaturen sollte so eingestellt werden, um die gewünschte Schnittdicke (5-10 & mgr; m je nach Gewebe) zu erreichen.
Wenn es richtig gefroren sollte das Gewebe Gesicht kreideweiß sein, während ein Gewebe, das bei der Montage nicht ordnungsgemäß eingefroren oder aufgetaut wurde, wird rot / rosa angezeigt. Abbildung 3 zeigt repräsentative Gewebe für unsachgemäß behandelt Proben (3A) und richtig gehandhabt Proben (3B) .
Die Mitte der Bauchregion wird durch Messen CSA und Frettchen Mindestdurchmesser mit einem Mikroskop mit Phasenkontrastoptik und Bildanalyse-Software eingesetzt wurde. Ein Vertreter Screenshot von Analyse-Software ist in Abbildung 4 dargestellt. Hämatoxylin und Eosin gefärbt Bilder einer ordnungsgemäß eingefroren und geschnitten Biopsie sowie ein Einfrieren beschädigt Biopsie tibialis anterior (TA) Muskeln werden in Abbildung 5 dargestellt. Bereiche, die ordnungsgemäß verarbeitet werden müssen konsistente morphology und sogar Färbung im gesamten (5A). Nicht ordnungsgemäß verarbeitet Muskeln, die freeze beschädigt sind oder vorzeitig aufgetaut wird angezeigt, mehrere Pausen in der Morphologie haben und haben das Aussehen von "Weizenschrot" (5B). Abbildung 6 zeigt feuchten Kammer für eine optimale Immunfärbung. Die Objektträger sollten mit Parafilm abgedeckt werden, auf einem nassen Papiertuch gehalten und in einer kleinen Box, um Austrocknen der Abschnitte während Immunfärbung zu vermeiden versiegelt. 7 zeigt eine Beispiel Immunhistochemie Folie, die gut vorbereitet und gefärbt worden ist.
Abbildung 1. Herstellung und bis zur richtigen Gewebe eingestellten Gefrier. (A) Herausgeschnittene Gewebe sollten auf Gaze in PBS getränkt gespeichert werden. (B) Gewebe selectedfor histologischenAnalyse eingetaucht in OCT und ausgelegt auf Kryo Form in der richtigen Orientierung (von Bauch-Sehne) und so nah an physiologische Länge wie möglich. (C) Gülle Isopentan geeignet für Gewebe. Hinweis: kleine weiße Niederschläge an der Unterseite angezeigt. (D) Gefrorenes Gewebe nach dem Eintauchen in Isopentan. Hinweis:. Kreidig weiße Erscheinung Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Kryostat Einstellungen und Zutaten zum Schneiden erforderlich. (A) Kryostat gesetzt zwischen -20 und -24 ° C mit Oktober und Aerosolkühlspray leicht verfügbar. (B) Im Inneren des Kryostaten Setup komplett mit kleinen Bürsten zu manipulieren und zu flach geschnitten Abschnitons für Dia machen und Pinzette zur Handhabung der Gewebeblock. (C) Gefrorene Gewebeblock bereit, mit Wärmeableitblock (weißer Pfeil) gekühlt werden. (D) Gewebeblock am Montagekopf bereit, geschnitten werden gesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Representative Gewebe richtig und falsch erhaltenen Muskeln. (A) ist nicht ordnungsgemäß eingefroren oder verarbeitet (B) ordnungsgemäß eingefroren und behandelt Muskel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Bestimmung der Querschnittsfläche der TA Muskel mit Nikon Imaging-Software. Screenshot Phasenkontrastbild der Muskel Abschnitt mit vorstellen Software zur Messung von CSA und min Frettchen Durchmesser, die eingekreist hat von. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Abbildung.
Abbildung 5. Repräsentative Bilder von richtig und falsch vorbereitet H & E gefärbten Muskeln. (A) richtig verarbeitet Abschnitt. (B) ist nicht ordnungsgemäß verarbeitet Einfrieren beschädigt Muskelbereich. Bitte click Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6. feuchten Kammer für Immunfärbung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7. Beispiel Immunhistochemie Schieber richtig vorbereitet und fleckig Rutsche. Slide mit Fibronectin (grün) und DAPI (blau) gefärbt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Histologie und Immunhistochemie wurden als wichtige Instrumente für das Verständnis der Manifestation und Progression der Pathologie in verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen eingesetzt. Klassischerweise wurden Muskelbiopsien ersten in Formaldehyd fixiert und dann mit Paraffinwachs eingebettet. Während Formaldehydfixierung bewahrt Gewebearchitektur und ermöglicht Gewebe Lagerung und Transport bei RT, inaktiviert es auch Enzyme und Proteine Vernetzungen erfordern weitere Schritte, um genaue Immunfärbung zu erzielen. Dieses Problem wird bei der Verwendung von Gefrierschnitten eliminiert aber diese Methode ist mit besonderen technischen Herausforderungen bei der Erzielung optimaler Färbeergebnisse und genaue Auslegung 14,15.
Erstens ist es wichtig, daß die Proben nach der chirurgischen Exzision sofort eingefroren werden, da die Autolyse und die Zersetzung beginnt kurz nach der Entnahme aus dem Körper. Gewebe muß schnell und gründlich für die richtige Menge an Zeit, die in Abhängigkeit von der Größe abhängig gefroren/ Dicke des Gewebes. Wenn dies nicht richtig gemacht, Frostschäden auftreten Rendern des Gewebes nutzlos für die histologische Auswertung. Nach dem Gefrierpunkt, muss Gewebe sofort auf Trockeneis gelagert werden und dann zu einem extrem niedrigen Temperaturen (-80 ° C) Gefriertruhe übertragen bis zum Schneiden. Es ist wichtig zu beachten, dass Gewebe nicht aus dem Gefriergerät ohne auf Trockeneis weil Gefrier-Tau auch Gewebearchitektur beschädigen entfernt werden.
Noch ein Hinweis von Bedeutung bei der Durchführung histologische Analyse ist darauf zu achten, immer den gleichen Teil des Gewebes von Interesse zu analysieren, um die Einheitlichkeit unter Analyse zu gewährleisten. Dies kann für die Muskelabschnitte durch Ausführen Analyse der midbelly erfolgen. Dies ist der Teil des Muskels, der am dicksten ist und damit die größte Querschnittsfläche haben. Um sicherzustellen, dass Sie tatsächlich die Schnitt midbelly sollte CSA von nachfolgenden Abschnitten mit histologischen Imaging-Software gemessen werden. Measurements sollte weiterhin gemacht werden, bis die Querschnittsfläche beginnt Plateau. Sobald dies der Fall, hat die Mitte der Bauch erreicht ist; nur diesen Teil des Gewebes für die histologische Analyse sollte verwendet werden, um die Einheitlichkeit unter Vergleiche zu gewährleisten.
2 Stunden - nach dem Schneide abgeschlossen und Folien hergestellt worden sind, sollten sie bei RT 1 trocknen. Trocknen ermöglicht die richtige Einhaltung des Abschnitts auf den Objektträger und verhindert auch, dass überschüssiges Wasser zu kristallisieren folgenden Transfer auf -80 ° C Tiefkühltruhe. Es ist wichtig zu beachten, dass Objektträger sollte auch nur auf Trockeneis bei der Auswahl von Folien für die Analyse, um Einfrieren und Auftauen zu verhindern behandelt werden. Sobald Objektträger für die Färbung gewählt wurde, enthalten Protokolle mit der Fleck sollte zunächst probeweise gefolgt werden, bis optimale Ergebnisse erreicht wurden. Bei der Durchführung von Immunfärbung, ist es wichtig, um sicherzustellen, gleitet nicht während des gesamten Verfahrens zu trocknen. Das Trocknen der Folien kann in transienten Interaktion führens auf intakte nach Inkubation bleiben. Diese Wechselwirkungen können nicht während Waschvorgängen entfernt werden, und führen zu nicht-spezifische Färbung. Die Trocknung kann, indem Objektträger in einer feuchten Atmosphäre vermieden werden. Darstellende Inkubationen mit Abschnitten mit Parafilm und gleitet auf einem feuchten Papiertuch in einer kleinen Rutsche Box versiegelt abgedeckt ist ausreichend, um Objektträger wird nicht trocken zu jedem Zeitpunkt während des Verfahrens zu gewährleisten.
Histologie ist ein wichtiges Instrument bei der Visualisierung Morphologie und verschiedene Aspekte der Pathologie. Während etwas trivial, ist es von größter Bedeutung, um große Sorgfalt bei der Herstellung von Gewebe zu ergreifen, um für die Histologie verwendet werden. Von Exzision, um ein Einfrieren, Schneiden und Färben, sollten Gewebe in einer Weise, die Frostschäden zu vermeiden wird und liefern die genauesten Bilder möglich behandelt werden. Ohne die richtige Konservierung, wird die Färbung nicht genau Physiologie und damit zu Fehlinterpretationen führen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
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