Abstract
पेशी बायोप्सी के histological मूल्यांकन न्यूरोमस्कुलर विकारों की विकृति के विकास और प्रगति की समझ में एक अनिवार्य उपकरण के रूप में कार्य किया है। हालांकि, ऐसा करने के क्रम में, उचित देखभाल excising और इष्टतम धुंधला प्राप्त करने के ऊतकों के संरक्षण जब उठाए जाने की जरूरत है। ऊतक के संरक्षण की एक विधि पैराफिन मोम के साथ उन्हें embedding तो फॉर्मेल्डीहाइड में ऊतकों फिक्सिंग और शामिल है। इस विधि को अच्छी तरह से आकृति विज्ञान को बरकरार रखता है और आरटी पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए अनुमति देता है, लेकिन बोझिल है और जहरीले रसायनों के निपटने की आवश्यकता है। इसके अलावा, प्रभावी immunostaining के लिए प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रोटोकॉल जरूरी है जो प्रतिजन पार से जोड़ने, में formaldehyde निर्धारण का परिणाम है। इसके विपरीत, जमे हुए सेक्शनिंग निर्धारण की आवश्यकता होती है और इस तरह जैविक प्रतिजन रचना को बरकरार रखे हुए नहीं है। इस विधि को भी intraopera की तरह जल्दी ऊतकीय मूल्यांकन की आवश्यकता होगी, स्थितियों में यह विशेष रूप से उपयोगी है, जिससे समय के आसपास जल्दी बारी में एक विशिष्ट लाभ प्रदान करता हैशल्य चिकित्सा बायोप्सी ेश्य। यहाँ हम अलग histological और प्रतिरक्षात्मक धब्बे के साथ दृश्य के लिए पेशी बायोप्सी की तैयारी करने का सबसे प्रभावी विधि का वर्णन।
Introduction
मांसपेशी ऊतक विज्ञान की परीक्षा न्यूरोमस्कुलर विकारों 1-4 की विभिन्न प्रकार की समझ में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। अन्य तकनीकों के साथ संयुक्त, यह शोधकर्ताओं विकृति की अभिव्यक्ति और प्रगति की एक बेहतर विचार प्राप्त करने के लिए और यह भी एक चिकित्सकीय हस्तक्षेप 5-10 की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक हो सकता है की अनुमति देता है। छांटना से पहले तुरंत शारीरिक स्थिति को संरक्षित करने के लिए इतनी के रूप में हालांकि, सटीक होना, ऊतकों उचित तरीके से संरक्षित किया जाना चाहिए। यह हटाने, संरक्षण, सेक्शनिंग, और धुंधला दौरान बड़ी सावधानी की आवश्यकता है।
टिश्यूज प्रकाश सूक्ष्म अध्ययन के लिए दो अलग अलग तरीकों से तैयार किया जा सकता। (FFPE) वर्गों, एम्बेडेड पहली विधि, formalin तय आयल ऊतकों पैराफिन मोम 11,12 के साथ एम्बेडेड किए जाने से पहले 10% प्राकृतिक बफर फॉर्मेल्डीहाइड में तय किए जाने की आवश्यकता है। नियतन कदम है लेकिन यह भी पार लिंक अंतर्जात जनसंपर्क बेहतर आकारिकी की रक्षा करने में मदद करता हैoteins इस प्रकार immunostaining के लिए जटिल प्रतिजन पुनर्प्राप्ति प्रक्रियाओं की जरूरत महसूस और ऐसे वर्गों पर 12 एंजाइमी धुंधला की संभावना को नष्ट करने। जमे हुए वर्गों, दूसरी ओर, पूर्व निर्धारित या संसाधित करने की आवश्यकता नहीं है; इसलिए, प्रोटीन देशी जैविक रचना 13,14 बनाए रखने में सक्षम हैं। इसके अलावा, जमे हुए वर्गों को भी समय पर सार्कोमा और अन्य शल्य चिकित्सा बायोप्सी 15 के intraoperative निदान में उदाहरण के लिए आवश्यक है, जो त्वरित प्रतिक्रिया समय, के लिए अनुमति देते हैं। ठीक से नहीं किया है, हालांकि, इस विधि histological परीक्षा के लिए वर्गों अयोग्य बना पेशी वास्तुकला में परिवर्तन का परिचय जो क्षति, फ्रीज होने का खतरा है। इस पत्र में उचित जांच के लिए इष्टतम धुंधला को प्राप्त करने के क्रम में पेशी बायोप्सी तैयार करने के लिए सबसे प्रभावी तरीका की रूपरेखा तैयार करेंगे।
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Protocol
1. ऊतक फसल और मांसपेशियों के ऊतकों की ठंड
- Isoflurane (2-क्लोरो-2- (difluoromethoxy) -1,1,1-trifluoro-एटैन) की अधिक मात्रा के साथ माउस euthanize। एक धूआं हुड में इस चरण पर कार्यवाई और इस तरह के एक desiccator या isoflurane में भिगो एक कपास झाड़ू से युक्त एक बेल जार के रूप में एक माध्यमिक रोकथाम विधि का उपयोग करें।
- मजबूती लुटेरा फैलाएंगे द्वारा मौत की पुष्टि। इस तरह गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के रूप में इच्छामृत्यु की एक माध्यमिक विधि का प्रयोग करें।
- मांसपेशियों पर खुले बाल किस्में के चिपके कम करने के लिए 70% शराब के साथ फर गीले। ऐसे # 5 के रूप में एक ठीक संदंश का उपयोग अंग बंद त्वचा छील।
- ध्यान से, नीचे की हड्डियों से (इस मामले में tibialis पूर्वकाल (टीए)) ब्याज की मांसपेशियों को अलग कण्डरा से शुरू करने और हटा दें।
- , मांसपेशियों में आबकारी OCT (इष्टतम काटने तापमान मिश्रित) में यह कवर, और एक लेबल डिस्पोजेबल ठंड मोल्ड पर यह फ्लैट करना। पेशी ताई को अपने सामान्य शारीरिक अभिविन्यास (सिर पर है सुनिश्चित करेंखींचने के बिना एल)। वैकल्पिक रूप से, छोटे स्टायरोफोम चौराहों पर पेशी फ्रीज और मांसपेशियों के सही लंबाई सुनिश्चित करने के लिए कीट पिन का उपयोग पिन।
- तरल नाइट्रोजन का उपयोग करते हुए एक स्टील बीकर में 2-methylbutane (isopentane) टेंशन मत लो। 5 मिनट - यह औसत 3 पर ले जाता है। सफेद अवक्षेप बीकर के नीचे और दीवारों पर फार्म शुरू तक रहकर सरगर्मी रखें।
नोट: जब ऐसा होता है, isopentane इष्टतम ठंड तापमान तक पहुँच गया है (-150 डिग्री सेल्सियस) - ठंडा 2-methylbutane में मांसपेशियों युक्त नए साँचे डुबकी। 20 सेकंड - 15 के लिए gastrocnemius soleus (जी एस) और triceps की तरह 12 सेकंड और बड़ा मांसपेशियों - जैसे डायाफ्राम और प्रसारिणी digitorum 6 के लिए longus (edl) के रूप में छोटे मांसपेशियों रुक। बहुत लंबे समय से इस खुर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के रूप में के लिए मांसपेशियों को फ्रीज नहीं है।
- सूखी बर्फ करने पर जमे हुए ऊतकों स्थानांतरण और isopentane लुप्त हो जाना (इस प्रक्रिया के आसपास औसत पर 15 लेता है कि ध्यान दें - 20 मिनट) करते हैं। एल्यूमीनियम पन्नी में ऊतकों लपेटें और यू पर उन्हें स्टोरltra कम तापमान सेक्शनिंग तक (-70 डिग्री सेल्सियस -80 डिग्री सेल्सियस)।
2. ऊतक ब्लॉक तैयार करने के लिए अक्टूबर में टिश्यूज Embedding
- सूखी बर्फ पर परिवहन ऊतकों विगलन को रोकने के लिए cyrostat करने के लिए। स्थानांतरण ऊतक और उन्हें 30 मिनट के लिए संतुलित करते हैं (ऊतकों की पूर्ण विगलन से बचने के लिए -20 -24 डिग्री सेल्सियस पर सेट) चैम्बर cryostat करने के लिए।
- Peltier बे पर ठंडा कर दें। Cryostat इस ठंडा करने की जरूरत नहीं होती है, तो जल्दी से अक्टूबर फ्रीज करने के लिए एयरोसोल ठंडा स्प्रे का उपयोग करें। इस फ्रीज नुकसान में परिणाम कर सकते हैं के रूप में एम्बेड दौरान किसी भी बिंदु पर पेशी पिघलना मत देना।
- नमूना डिस्क पर अक्टूबर के एक समान पतली परत को जोड़ने और इसे ठंडा। अक्टूबर के सबसे जबकि अभी भी तरल शीर्ष पर तल पर जमे हुए है, (अनुदैर्ध्य वर्गों के लिए अक्टूबर को अनुप्रस्थ वर्गों और समानांतर के लिए अक्टूबर को सीधा) सही अभिविन्यास में ऊतक डालें। जल्दी अक्टूबर फ्रीज करने के लिए एयरोसोल ठंडा स्प्रे का प्रयोग करें। गर्मी ext के साथ ऊतक के unembeded भाग को छूनेractor और 45 सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें।
- , मांसपेशियों के आसपास अक्टूबर के एक और पतली परत जोड़ें एयरोसोल ठंडा स्प्रे के साथ स्प्रे और पिछले चरण में गर्मी के रूप में निकाल सकते हैं।
- पूरे पेशी कवर किया जाता है जब तक स्प्रे और गर्मी चिमटा ठंडा एयरोसोल के संयोजन का उपयोग अक्टूबर फ्रीज जल्दी से छोटे वेतन वृद्धि अक्टूबर जोड़कर रखना और।
- ऊतक ब्लॉक के शीर्ष पर गर्मी चिमटा रखो और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
3. धारा तैयारी और मांसपेशियों के मध्य पेट क्षेत्र से वर्गों की पहचान
- नमूना सिर पर नमूना माउंट। डिस्क को सुरक्षित करने के घुंडी कस दें। नमूना डिस्क नमूना सिर के साथ अच्छे संपर्क में है कि सुनिश्चित करें।
- ° -21 के बीच और -24 सी के लिए चैम्बर के तापमान को समायोजित करें और सेट तापमान हासिल की है जब तक प्रतीक्षा करें।
- मोटाई सेटिंग्स (7 माइक्रोन) समायोजित करें; आगे बढ़ने के लिए या मोटे और ठीक सेटिंग्स का उपयोग कर ब्लॉक retracting द्वारा ब्लॉक ट्रिम।
- वर्गों लीजिएपर स्लाइड करने के लिए कटौती वर्गों के पालन की सुविधा के लिए विपरीत आरोपों के बीच आकर्षण का उपयोग करते हुए, वर्गों पर स्लाइड के शीर्ष दबाकर सकारात्मक आरोप लगाया खुर्दबीन स्लाइड पूर्व गर्म।
- वर्गों के पार के अनुभागीय क्षेत्र (सीएसए) को मापने के द्वारा मध्य पेट वर्गों को पहचानें। माइक्रोस्कोप से जुड़ा है कि कंप्यूटर पर इस का उपयोग इमेजिंग सॉफ्टवेयर करो।
नोट: चरण विपरीत छवियाँ लिया जाता है और पूरे मांसपेशियों की परिधि सॉफ्टवेयर प्रोग्राम पर एक ट्रेसिंग समारोह के माध्यम से मापा जाता है। यह दोनों सीएसए के साथ ही न्यूनतम भाल व्यास माप (एक कण के विपरीत दिशा में दो समानांतर उभयनिष्ठ के बीच छोटी से छोटी दूरी के रूप में व्यक्त किया जाता है कि फाइबर पार के अनुभागीय आकार के उपाय) निकलेगा। नोट: सीएसए और न्यूनतम भाल व्यास माप पठार शुरू, मध्य पेट तक पहुँच चुका है। - इन्वेंटरी भविष्य धुंधला के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड संग्रह और।
नोट: stainin करने के लिए अक्टूबर से पहले हटा दिया जाना चाहिए नहीं करताजी प्रक्रियाओं। स्लाइड coverslipped हो जाने के बाद, वे तुरंत कलंकित किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं।
4. धुंधला
नोट: विस्तृत कदम दर कदम प्रक्रिया उत्पाद डाटा शीट पर पाया जा सकता है और धुंधला प्रक्रियाओं के लिए पीछा किया जाना चाहिए, व्यक्तिगत अनुकूलन इष्टतम धुंधला प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है।
- मीडिया (देखें तालिका) बढ़ते पानी के साथ मिश्रणीय नहीं है, क्योंकि (70%, 95%, और 100% इथेनॉल में 2 मिनट प्रत्येक) शराब की बढ़ती ग्रेड के माध्यम से स्लाइड निर्जलीकरण और xylene (5 मिनट के लिए 100%) सुनिश्चित करने के साथ उन्हें स्पष्ट स्लाइड समय के साथ अपारदर्शी नहीं हो जाते।
- वर्गों coverslip और उन्हें सूखी। माइक्रोस्कोप के साथ छवि इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ सुसज्जित है।
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Representative Results
कटाई और ऊतकों की ठंड के लिए सेट अप चित्रा 1 में देखा जा सकता है। excised ऊतकों सुखाने (चित्रा 1 ए) से बचने के लिए पीबीएस में भिगो धुंध पर संग्रहित किया जाना चाहिए। ऊतकों वे सटीक आकृति विज्ञान (चित्रा 1 बी) सुनिश्चित करने के लिए अक्टूबर में डूबा हुआ है और क्रायो मोल्ड पर बाहर रखी उचित अभिविन्यास में और संभव के रूप में शारीरिक लंबाई के करीब होना चाहिए ऊतकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल करने के लिए चुना है। ऊतक ठंड के लिए उपयुक्त isopentane के घोल तरल नाइट्रोजन में isopentane ठंडा और छोटे सफेद अवक्षेप तल पर दिखाई जब तक सरगर्मी से प्राप्त किया जा सकता है। इस बिंदु पर, मीडिया (चित्रा 1C) ठंड के लिए उपयुक्त है। टिश्यूज ऊतक (चित्रा -1) के आकार / मोटाई के आधार पर ठंडा isopentane में 6-15 सेकंड से जमे हुए किया जाना चाहिए। ठंड के बाद, मांसपेशी -80 <यह सूखी बर्फ पर संग्रहित किया जाना चाहिए बात जिस पर चूने का सफेद दिखाई देते हैं और बाद में स्थानांतरित कर दिया जाएगामजबूत> डिग्री सेल्सियस फ्रीजर।
धीरे-धीरे अक्टूबर में ऊतक embedding द्वारा पेशी ब्लॉक की तैयारी के लिए आवश्यक cryostat सेटिंग और सामग्री चित्रा 2 में दिखाया जाता है। Cryostat -20 और -24 डिग्री सेल्सियस (2A चित्रा) के बीच स्थापित किया जाना चाहिए। अक्टूबर और रुक-यह सेक्शनिंग के लिए उपयुक्त ब्लॉक बनाने के लिए आसानी से उपलब्ध होना चाहिए। Cryostat के अंदर हेरफेर और यह ऊतक सुनिश्चित करने के लिए हाथों से छुआ जा कभी नहीं करना चाहिए, क्योंकि स्लाइड बनाने के रूप में अच्छी तरह से ऊतक ब्लॉक से निपटने के लिए चिमटी के लिए कट वर्गों को समतल करने के लिए छोटे ब्रश करना चाहिए था जमी (चित्रा 2 बी) बनी हुई है। अक्टूबर सेक्शनिंग ब्लॉक बनाने के लिए ऊतक में जोड़ा जाना चाहिए, लेकिन रुक-यह स्प्रे और फिर आगे यहाँ चित्र गर्मी चिमटा (चित्रा -2) के साथ ठंडा साथ तुरंत जमे हुए किया जाना चाहिए। अनुप्रस्थ वर्गों के लिए, ऊतक यह ब्लेड (चित्रा 2 डी) के लिए सीधा उन्मुख है कि इतनी नमूना सिर पर रखा जाना चाहिए। एसईttings वांछित अनुभाग मोटाई (5-10 माइक्रोन ऊतक के आधार पर) प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए।
सही ढंग से जमे हुए हैं ऊतक चेहरे बढ़ते प्रक्रिया के दौरान अनुचित तरीके से जमे हुए या thawed किया गया था कि एक ऊतक लाल / गुलाबी दिखाई देगा, जबकि। सफेद चूने का होना 3 अनुचित तरीके से संभाला नमूने के लिए प्रतिनिधि के ऊतकों (चित्रा 3) और ठीक से संभाला नमूने से पता चलता है चाहिए (3B चित्रा) ।
मध्य पेट क्षेत्र चरण विपरीत प्रकाशिकी और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर से लैस एक माइक्रोस्कोप का उपयोग सीएसए और न्यूनतम भाल व्यास को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है। विश्लेषण सॉफ्टवेयर का एक प्रतिनिधि स्क्रीनशॉट। चित्रा 4 में दिखाया गया Hematoxylin और है की एक फ्रीज क्षतिग्रस्त बायोप्सी के साथ-साथ एक अच्छी तरह से जमे हुए और sectioned बायोप्सी के दाग छवियों eosin tibialis पूर्वकाल (प्रादेशिक सेना) की मांसपेशियों चित्रा 5 में दिखाया जाता है। ठीक से होगा कार्रवाई की जाती है कि धारा लगातार morpholoGY और यहां तक कि पूरे धुंधला (चित्रा 5A)। अनुचित। फ्रीज क्षतिग्रस्त या समय से पहले ही आकृति विज्ञान में एक से अधिक टूट जाता है और "कटा हुआ गेहूं" (चित्रा 5 ब) की भूमिका है के लिए दिखाई देगा thawed हैं कि मांसपेशियों को संसाधित इष्टतम immunostaining के लिए 6 से पता चलता है humidified कक्ष चित्रा। स्लाइड्स, parafilm के साथ कवर एक गीला कागज तौलिया पर रखा है, और immunostaining के दौरान वर्गों के सूखने से बचने के लिए एक छोटे से बॉक्स में बंद किया जाना चाहिए। 7 ठीक से तैयार और दाग कर दिया गया है कि एक नमूना immunohistochemistry के स्लाइड को दर्शाया गया है चित्रा।
चित्रा 1. तैयारी और उचित ऊतक ठंड के लिए निर्धारित किया है। (ए) excised ऊतकों पीबीएस में भिगो धुंध पर संग्रहित किया जाना चाहिए। (बी) ऊतकीय selectedfor ऊतकोंविश्लेषण अक्टूबर में डूबा हुआ है और और संभव के रूप में शारीरिक लंबाई के करीब (कण्डरा को पेट से) उचित अभिविन्यास में क्रायो मोल्ड पर बाहर रखी। ऊतक के लिए उपयुक्त isopentane (सी) गारा। नोट: छोटे सफेद अवक्षेप तल पर दिखाई देते हैं। (डी) isopentane में सूई के बाद जमे हुए ऊतक। नोट:। चूने का सफेद उपस्थिति इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
सेक्शनिंग के लिए आवश्यक 2. cryostat सेटिंग्स और सामग्री चित्रा। (ए) cryostat -20 और -24 डिग्री सेल्सियस के साथ अक्टूबर और एयरोसोल ठंडा स्प्रे आसानी से उपलब्ध के बीच निर्धारित किया है। छोटे ब्रश के साथ पूरा cryostat की स्थापना के अंदर (बी) में हेरफेर और कटौती secti समतल करने के लिएस्लाइड ऊतक ब्लॉक से निपटने के लिए बनाने के साथ ही चिमटी के लिए ons। (सी) जमे हुए ऊतक ब्लॉक तैयार गर्मी चिमटा (सफेद तीर) के साथ ठंडा किया जाना है। कटौती होने के लिए तैयार सिर बढ़ते पर सेट (डी) ऊतक ब्लॉक। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा सही ढंग से और गलत तरीके से संरक्षित मांसपेशियों के 3. प्रतिनिधि ऊतकों। (ए) अनुचित जमे हुए या संभाला (बी) पर ठीक से जमे हुए है और मांसपेशियों को संभाला। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Nikon इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रादेशिक सेना पेशी के पार अनुभागीय क्षेत्र की चित्रा 4. निर्धारण। सीएसए और न्यूनतम भाल व्यास की माप के लिए सॉफ्टवेयर की कल्पना का उपयोग कर परिक्रमा किया गया है कि मांसपेशियों खंड के चरण विपरीत छवि का स्क्रीनशॉट। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा।
ठीक से और अनुचित तरीके से तैयार एच एंड ई दाग की मांसपेशियों की चित्रा 5. प्रतिनिधि छवियाँ। (ए) ठीक से खंड संसाधित। (बी) अनुचित संसाधित फ्रीज क्षतिग्रस्त मांसपेशियों अनुभाग। कृपया सीएलआईइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां सी.के.।
चित्रा 6 immunostaining के लिए उपयुक्त humidified कक्ष। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
ठीक से तैयार और दाग स्लाइड। स्लाइड चित्रा 7. नमूना immunohistochemistry के स्लाइड फ़ाइब्रोनेक्टिन (हरा) और DAPI (नीला) के साथ दाग दिया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
प्रोटोकॉल और immunohistochemistry के विभिन्न न्यूरोमस्कुलर विकारों में अभिव्यक्ति और विकृति विज्ञान की प्रगति को समझने में महत्वपूर्ण औजार के रूप में इस्तेमाल किया गया है। माइल्ड, मांसपेशियों में बायोप्सी पहले फॉर्मेल्डीहाइड में तय की और फिर पैराफिन मोम के साथ एम्बेडेड थे। Formaldehyde के निर्धारण ऊतक वास्तुकला को बरकरार रखता है और आरटी पर ऊतक भंडारण और परिवहन की अनुमति देता है, यह भी सही immunostaining के लक्ष्य को हासिल करने के लिए आगे कदम की जरूरत महसूस एंजाइम और crosslinks प्रोटीन निष्क्रिय। यह समस्या जमे हुए वर्गों के उपयोग के साथ समाप्त हो रहा है लेकिन इस विधि इष्टतम धुंधला परिणाम और सटीक व्याख्या 14,15 प्राप्त करने में अद्वितीय तकनीकी चुनौतियों प्रस्तुत करता है।
सबसे पहले, यह स्वलयन और अपघटन शरीर से हटाने के बाद जल्द ही शुरू हो नमूने के रूप में शल्य चिकित्सा छांटना के तुरंत बाद जमे हुए किया कि आवश्यक है। ऊतकों भी आकार पर निर्भर करता है, जो समय की उचित राशि के लिए तेजी से और अच्छी तरह से जमे हुए किया जाना चाहिए/ ऊतक की मोटाई। यह सही ढंग से नहीं किया है, ऊतकीय मूल्यांकन के लिए बेकार ऊतक प्रतिपादन घटित होगा क्षति फ्रीज। ठंड के बाद, ऊतकों तुरंत सेक्शनिंग जब तक एक अल्ट्रा कम तापमान (-80 डिग्री सेल्सियस) फ्रीजर को हस्तांतरित तो सूखी बर्फ पर संग्रहित किया जाना चाहिए। यह ऊतकों फ्रीज पिघलना भी ऊतक वास्तुकला को नुकसान होगा क्योंकि सूखी बर्फ पर किया जा रहा बिना फ्रीजर से नहीं हटाया जाना चाहिए कि नोट करना महत्वपूर्ण है।
महत्व की एक और नोट जब ऊतकीय विश्लेषण प्रदर्शन हमेशा विश्लेषण के बीच एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए ब्याज की ऊतक के एक ही हिस्से का विश्लेषण करने के लिए देखभाल करने के लिए है। इस midbelly के विश्लेषण के प्रदर्शन से पेशी वर्गों के लिए किया जा सकता है। यह सबसे बड़ा पार अनुभागीय क्षेत्र होगा इसलिए बड़ी से बड़ी है और कहा कि मांसपेशियों का हिस्सा है। यदि आप वास्तव में midbelly सेक्शनिंग रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए, बाद वर्गों के सीएसए ऊतकीय इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मापा जाना चाहिए। Measuremक्रॉस अनुभागीय क्षेत्र पठार के लिए शुरू होता है जब तक पिता किए जाने के लिए जारी रखना चाहिए। एक बार ऐसा होता, मध्य पेट तक पहुँच गया है; केवल ऊतक के इस हिस्से की तुलना के बीच एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए ऊतकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
2 घंटा - सेक्शनिंग पूरा हो चुका है और स्लाइड तैयार की गई है, के बाद वे 1 के लिए आरटी पर सूखे की अनुमति दी जानी चाहिए। सुखाने के लिए स्लाइड करने के लिए खंड के समुचित पालन के लिए अनुमति देता है और भी डिग्री सेल्सियस फ्रीजर -80 के लिए स्थानांतरण निम्नलिखित मणिभ अतिरिक्त पानी को रोकता है। यह फ्रीज पिघलना चक्र को रोकने के लिए विश्लेषण के लिए स्लाइड का चयन करते समय स्लाइड भी केवल सूखी बर्फ पर नियंत्रित किया जाना चाहिए कि नोट करना महत्वपूर्ण है। स्लाइड धुंधला के लिए चयनित किया गया है एक बार इष्टतम परिणाम हासिल किया गया है, जब तक दाग एक परीक्षण के आधार पर पहली पालन किया जाना चाहिए साथ, प्रोटोकॉल शामिल थे। Immunostaining प्रदर्शन करते हैं, तो यह सुनिश्चित करें कि स्लाइड प्रक्रिया के दौरान सूखी नहीं बनाने के लिए महत्वपूर्ण है। स्लाइड्स के सूखने क्षणिक बातचीत में परिणाम कर सकते हैंएस ऊष्मायन के बाद बरकरार रहने के लिए। इन मुलाकातों washes के दौरान हटा दिया है और अविशिष्ट धुंधला में परिणाम नहीं किया जा सकता। सुखाने के लिए एक humidified वातावरण में स्लाइड्स रखने से बचा जा सकता है। एक छोटे से स्लाइड के बक्से में बंद एक नम कागज तौलिया पर parafilm और स्लाइड के साथ कवर वर्गों के साथ incubations के प्रदर्शन की प्रक्रिया के दौरान किसी भी बिंदु पर होगा सूखा नहीं स्लाइड्स सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है।
प्रोटोकॉल आकृति विज्ञान और विकृति विज्ञान के विभिन्न पहलुओं visualizing में एक अनिवार्य उपकरण है। कुछ हद तक तुच्छ है, यह ऊतकों की तैयारी में ऊतक विज्ञान के लिए इस्तेमाल किया जा महान देखभाल करने के लिए सबसे बड़ा महत्व का है। ठंड के लिए छांटना, सेक्शनिंग और धुंधला से, ऊतकों फ्रीज क्षति से बचने और सबसे सटीक चित्र संभव निकलेगा कि एक तरीके से नियंत्रित किया जाना चाहिए। उचित संरक्षण के बिना, धुंधला सही रूप में शरीर विज्ञान को प्रतिबिंबित नहीं करेगा और इसलिए अशुद्ध अर्थ के लिए सीसा।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
References
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N. The diaphragm in dystrophia myotonica. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).
- Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
- Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
- Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
- Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779 (2012).
- Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
- Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
- Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14 (2014).
- Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
- Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).
- Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
- Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).
